Name: in vivo targeted expression of optogenetic proteins using silk/aav films
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films at JoVE.com

Yazarlar J. Vazquez resimler için D. Kaplan ve C. Preda'nın reaktifler ve yararlı rehberlik ve B. Sabatini ve C. Harvey labs vivo içinde görüntüleme için teşekkür etmek istiyorum. Mikroskopi M. Ocana ve kısmen bir bölümü, bir Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar olarak nöral görüntüleme Merkezi tarafından desteklenen Nörobiyoloji görüntüleme Merkezi tarafından mümkün yapıldı ve kontur (NINDS) P30 çekirdek Merkezi (NS072030) verin. Bu eser ve NIH hibe, NINDS R21NS093498, U01NS108177 ve NINDS R35NS097284 için W.G.R ve C.H.C. için bir NIH doktora sonrası bursu F32NS101889 GVR Khodadad Aile Vakfı, Nancy Lurie işaretleri Vakfı tarafından desteklenmiştir

Tüm Deney hayvanları içeren Harvard daimi Komitesi aşağıdaki yönergeleri bize NIH bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu' nda tanımlanan hayvan bakımı üzerinde tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Yetişkin C57BL/6 fareler her iki cinsiyetten (yaş 6-15 hafta) tüm deneyler için kullanılmıştır.
1. sulu ipek Fibroin alın
<ol><li>Hazırlamak veya sulu ipek fibroin (% 5-7,5 w/v) satın alın.</li>
</ol><p class="jov...

<ol>
	<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons.">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+Fibroin+Films+Facilitate+Single-Step+Targeted+Expression+of+Optogenetic+Proteins.">Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry.">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).</li><li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+silk+biomaterials.">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).</li><li>Hines, D. J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+controlled+release+from+silk+fibroin+films.">Mechanisms of controlled release from silk fibroin films.</a> Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+silk+material+structure+by+temperature-controlled+water+vapor+annealing.">Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).</li><li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li><li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels.">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li><li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation.">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li><li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A/R+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds.">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li></ol>

Ifade optogentic proteinlerin hedeflemek için ipek/AAV kullanımı geçerli olarak kullanımda olan yaklaşımlar sınırlamalar üstesinden gelir. Birçok çalışmalar başarıyla AAV enjeksiyonları optogenetic proteinler ifade etmek için kullansa da, ifade optik lifler ucu, bölgeler konik elyaf uzunluğu çevresinde ve bir SIRITIŞ lens görüş bölgenin hizalamak için meydan okuyor. Kayma optik bileşenleri ve optogenetic ifade arasında nedeniyle stereotaksik enjeksiyonları güvenilmez olabilir ve birçok den...

Son on yıl için izleme ve sinirsel aktivite1manipüle mühendislik ışığa duyarlı proteinlerin bir patlama üretti. Virüsler bu optogenetic araçlar beyinde ifade etmek için benzersiz esneklik sunar. Transjenik hayvanlar için karşılaştırıldığında, virüs üretmek, ulaşım ve mağaza, en yeni optogenetic araçların hızlı uygulama izin için daha kolay. İfade için farklı nöron popülasyonları genetik olarak yönlendirilebilir ve retrograd taşıma için tasarlanmış virüs bile nöronal bağlantı2dayalı ifade hedeflemek için kullanılır.
Virüsler genellikle zaman alıcı ve zor olabilir stereotaksik enjeksiyonları ile tanıtılmaktadır. Tam olarak küçük bölgeleri hedefleme-ebilmek var olmak zor, ifade kez geniş alanlar üzerinde sürüş birçok enjeksiyonları gerekirken. Bir optik cihaz daha sonra hafif vivo içindeteslim etmek için beynine yerleştirilmiş iken, Ayrıca, İmplantın doğru viral enjeksiyon ile hizalı gerekir. Burada, kolayca uygulanabilir bir yöntem viral vektörler ipek fibroin Filmler3kullanarak bir implant cihaz etrafında doku teslim etmek için açıklamak. İpek fibroin piyasada bulunan, nöral dokular tarafından iyi tolere ve çeşitli özellikleri ile malzeme üretmek için kullanılabilir. İpek filmleri ya da mikroenjeksiyon Pipetler gibi ortak labaratuar donanımları kullanarak implantlar için uygulanan Pipetler el. İpek/AAV filmleri iki cerrahi işlemler gereksinimini ortadan kaldırmak ve virüs-aracılı ifade düzgün optik implant uyumlu olun. Sonuçta elde edilen ifade lifleri ve lif parça daha az istenmeyen ifadeye stereotaksik enjeksiyonları daha sonuçlarında ucuna sınırlıdır.
Hedeflenen ifade ucundaki küçük liflerinin üreten ek olarak, ipek/AAV filmleri yaygın sürücü için kullanılabilir (> 3 mm çapında) kafatası windows altında kortikal ifade. İn vivo 2-Foton görüntüleme floresan etkinlik sensörler duyusal ve bilişsel işleme sürüş nöronal aktivite rolünün değerlendirilmesi için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Ancak, ifade geniş kortikal alanlarda Denemecileri kez üzerinde üniforma sürücü için birden fazla enjeksiyonları gerçekleştirin. Bu iğneleri son derece zaman alıcı olabilir ve tutarsız ifade görüş alanı açabilir. Buna ek olarak, kafatası windows ipek/AAV-ceket imalatı, büyük ölçüde ameliyatları için gereken süreyi azaltmak ve en dikkat çekici ifade yüz mikron kortikal yüzeyinin altında sürücü son derece kolaydır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aqueous silk fibroin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5154-20ML</td>
			<td>Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector to deposit silk/AAV</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td>Nanoject III nanoliter injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator to hold implants</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MM-33</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope to visualize silk deposits</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-6TX-FRL</td>
			<td>3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber to store implants</td>
			<td>Ablaze</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional, implant holder for storage</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>&#216;200 &#181;m Core Multimode Optical Fiber for fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrules</td>
			<td>Kientec</td>
			<td>FZI-LC-230</td>
			<td>LC Zirconia Ferrule for fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various materials for manufacturing chronic fiber implants</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered fiber implants</td>
			<td>Optogenix</td>
			<td>Lambda-B</td>
			<td>Tapered fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lenses</td>
			<td>GoFoton</td>
			<td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td>
			<td>GRIN lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass cranial windows</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0726 (CS-3R-0)</td>
			<td>Small round cover glass, #0 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large glass cranial windows</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0731 (CS-5R-0)</td>
			<td>Small round cover glass, #0 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various materials for manufacturing cranial windows</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeted expression of optogenetic proteins using silk/aav films

Ne kadar sinir devreleri işlem bilgileri sürücü davranış çıkış amacıyla büyük ölçüde işleme ve nöronlar içinde vivoetkinliğini izleme için son zamanlarda geliştirilen optik yöntemlerle destekli anlamak için arayışı. Bu tür deneyler iki ana bileşenleri üzerinde bağlıdır: beynin optik erişim sağlamak 1) implante edilebilir cihazların ve nöronal uyarılabilirlik değiştirmek veya bir okuma nöronal aktivitenin sağlayabilirsiniz 2) ışığa duyarlı proteinlerdir. Işığa duyarlı proteinler hızlı yolları vardır, ancak ifade, anatomik, genetik ve zamansal hassasiyetle kontrol edilebilir çünkü viral vektörler stereotaksik enjeksiyon şu anda en esnek yaklaşım. Viral vektörler büyük yarar rağmen virüs sayısız sorunlar optik implantlar pozlar siteye teslim. Stereotaksik virüs enjeksiyonları cerrahi süresini artırmak, çalışmaları maliyetini artırmak ve hayvan sağlığı için riski ameliyatları talep ediyorlar. Çevreleyen doku fiziksel olarak enjeksiyon şırınga ve immünojenik iltihap yüksek titresi virüs bolus ani teslim tarafından neden olduğu zarar görebilir. Enjeksiyonları optik implantlar ile hizalama zor özellikle küçük bölgeleri hedeflerken beynin derinliklerinde. Bu zorlukları aşmak için birden çok türü Filmler Adeno ilişkili viral (AAV) vektörel çizimler ve ipek fibroin oluşan optik implantlarda kaplama yöntemi açıklanmaktadır. Fibroin, Bombiks mori, koza türetilmiş bir polimer Kapsüller ve biomolecules korumak ve çözünür filmlerden seramik için değişen formları içine işlenebilir. Beyne ipek/AAV kaplamalar tam olarak gerektiğinde ifade sürüş arabirimi optik elemanları ve çevresindeki beyin arasında virüs serbest. Bu yöntem kolayca uygulanır ve in vivo çalışmalar nöral devre fonksiyonunun büyük kolaylaştırmak vaat ediyor.

İfade sürüş ipek/AAV filmleri başarısını değerlendirmek için biz hayvanlar 2-3 hafta implantasyonu sonrası derin ve bölge beyin dilim faiz hazırladı. Floresans görüntüleri (ChR2-YFP) fluorophore öğesini optogenetic proteinlerin ifade (şekil 1 d) kapsamını ölçüsü sağlanan. Tipik optik fiberler (230 µm çapı) kolayca 200 karşılamak ipek/AAV nL. Uygulama ile Denemecileri implante lifleri (şekil 5) ucu...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films at JoVE.com

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

Burada, viral ifade vektörel çizimler ipek fibroin Filmler kullanarak beynine teslim etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem ifade vektörel çizimler ipek/AAV kaplamalı optik lifler, konik optik lifler ve kafatası windows kullanarak hedeflenen teslimini sağlar.

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Bu yöntem, sistem nörolojisi alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Nöronal toplulukların aktivitesi beyinde duyusal ve bilişsel işleme nasıl desteklenir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, ayrı bir virüs enjeksiyon prosedürü gerektirmeden, ilgi beyin bölgelerine Chan rodopsin ve GCaMP gibi optogenetik proteinlerin doğru hedefleme kolaylaştırır olmasıdır.Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü küçük optik implantlara ipek ve virüs birikimi tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bazı pratikler gerektirebilir. İlk olarak, mix çözülmüş AAV ve 5-7 nokta beş yüzde sulu ipek fibroin bir oran bir-bir oranında 200 mikrolitre PCR tüp. Yavaşça pipet çözeltisi birkaç kez iyice AAV ve fibroin karıştırmak için.İpek/AAV'yi yatırmak için, yapılan fiber implant sayısı için gerekli çözelti miktarı yla bir enjeksiyon pipeti yükleyin, ayrıca pipet tıkanması nedeniyle oluşan kayıpları karşılamak için yaklaşık yüzde 30 ekstra. Daha sonra, bir mikroenjektör ile donatılmış stereotaksik bir cihaz içine bir ferrule tutucu monte. Ferrule tutucuyu mikroenjektörün üzerine yerleştirin ve aşağıdaki ipek/AAV karışımını uygulayın.Enjeksiyon pipeti optik fiber yüzeyin merkezine dokunana veya neredeyse dokunana kadar manevra yapın ve 10 ila 20 nanolitre ipek/AAV çözeltisi fırlatın. Sonra pipeti geri çekin. Daha sonra, yaklaşık bir dakika içinde düz bir filme kuruyan sıvı bir kubbe olarak görünen düz yüzeyde ipek/AAV bolus gözlemleyin.İstenilen miktarda ipek/AAV yatırılınakadar önceki adımları tekrarlayın. Birden fazla implant hazırlarken, ilk implanta dönmeden önce ipek/AAV solüsyonu bir implanta uygulayın ve diğer implantları kaplamaya geçin. Bir saat kuruduktan sonra, tüm ferrule tutucuyu bir vakum odasına yerleştirin ve vakum bir gecede yaklaşık 125 torr ve dört santigrat derece de kurutun.Ertesi gün, yüksek güçlü bir mikroskop altında ortaya çıkan ipek filmin şeklini ve konumunu değerlendirin. Filmlerin optik fiber yüzeyin ucuyla sınırlı olduğundan, nispeten ince ve simetrik olduğundan emin olun. Konik optik lifleri kaplamak için, ipi/AAV enjeksiyon pipetini konik lerin başındaki optik fiberin yan tarafına yerleştirin ve pipetin optik fibere dokunduğundan emin olun.Kaplama işlemini başlatmak için 20 nanolitre ipek/AAV çıkar, damlacıkoptik fibere yapışır ve fiber ve pipet in arabiriminde kalmasını sağlar. İpek/AAV kururken damlacıkları lif ucunun ucuna doğru hafifçe yakınlayın ve pipet ucunu tıkamamak için enjeksiyon pipetini kurutma damlacığıyla temas halinde tutun. İlk bolus neredeyse tamamen kuruduğunda, başka bir 20 nanolitre atmak ve konik boyunca damlacık wicking devam edin.Bir önceki adımı, az miktarda ipek/AAV çıkararak ve çözeltiyi yavaş yavaş konik tarafına kurutarak tekrarlayın. Kurutunca, ortaya çıkan ipek filmin in şeklini ve konumunu yüksek güçlü bir mikroskop altında değerlendirin. GRIN lens implantlarının kapaması için, ipek/AAV'yi bir GRIN lens implantına tek bir enjeksiyonda yatırın.Kurutunca, filmin lens yüzeyini kapladığından emin olmak için yüksek güçlü bir mikroskop altında elde edilen ipek filmin şeklini ve konumunu değerlendirin. Cam kranial pencereleri kaplamak için, damlacık tüm cam yüzeyi kapsayacak şekilde yayılır, böylece üç milimetrelik yuvarlak kapak kayma yüzeyine ipek / AAV beş mikrolitrelik damlacık el pipet. Kuruduktan sonra, ipek/AAV kaplı optik lifleri, cihazları yerleştirmeden önce 125 torr ve dört santigrat derecede soğutulmuş vakum kurutucusunda saklayın.Florofor etiketli optogenetik proteinlerin floresan görüntüleri, ipek/AAV filmlerinin ifade derecesinin bir ölçüsünü sağlar ve tipik optik lifler 200 nanolitre ipek/AAV'yi kolayca barındırabilir. Uygulama ile, deneyciler implante liflerin ucu etrafında son derece güvenilir ifade elde edebilirsiniz. Kaplamalı kafatası pencereleri ile ilgili iki olası sorun yetersiz ifade ve çözülemeyen ve görüş alanını gizleyen ipek filmlerdir.İfadeyi artırmak için, pencerenin implante edilmesinden ve/veya filmdeki virüs miktarının artırılmasından önce durektomi yapılabilir. En iyi ifade, sırasıyla ipek ve stok-titre AAV bir-dört karışımı kullanılarak elde edildi. Kaplamalı pencerelerdeki ipek miktarı fiber implantlara göre 10 ila 100 kat daha fazladır ve film dokuya daha az gömülüdür ve bu nedenle ipek filmlerini eritebilecek aynı proteolitik aktivite seviyelerine maruz kalmayabilir.Ancak, bazı ipek varlığı pencerelerin altında ifade elde etmek için gereklidir, büyük olasılıkla tek başına virüs ten yapılmış bir film ameliyat sırasında interstisyel sıvı tarafından yıkanır çünkü. Bu prosedürü uygularken, ipek kaplı implantları tarif ettiğimiz şekilde hazırlamak ve saklamak önemlidir. Yanlış depolama ipek filmlerin özelliklerini değiştirebilir veya viral ifade vektörlerinin etkinliğini azaltabilir.Bu teknik, sinirsel aktivite fareler, sıçanlar, hatta insan olmayan primatlar gibi memelilerin beyinlerinde duyusal ve bilişsel işleme sürücüler keşfetmek için sistem nöroloji alanında araştırmacılar için büyük yarar olabilir. Viral ekspresyon vektörleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldivenler, gözlükler ve laboratuvar önlükleri gibi kişisel koruyucu ekipmanlar olabileceğini unutmayın, Adeno ile ilişkili virüsle çalışırken her zaman giyilmelidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Nörobilim

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...