10.2K Views
•
08:53 min
•
January 12th, 2019
DOI :
January 12th, 2019
•0:04
Title
0:47
Plant Growth and Sample Preparation
2:09
Gibberellin4 (GA4) Treatment
3:45
Tissue of Interest Time Course Setup
5:09
3-D Image Analysis
6:36
Results: Representative Endogenous and Exogenous GA Gradients in Arabidopsis Roots and Dark-grown Hypocotyls
7:58
Conclusion
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for planteudvikling inden for fordelingen af vækstregulerende fytokhormoner. Ved at bruge genetisk kodede FRET biosensorer, for eksempel nlsGPS1, som registrerer gibberellins, er det muligt at måle den dynamiske fordeling af vigtige forbindelser i Arabidopsis væv på cellulære opløsning. Generelt, personer nye til dette spørgsmål vil kæmpe, fordi analysere FRET biosensorer indebærer ratiometric billeddannelse, som har øget støj og yderligere analytiske trin i forhold til hensigten metriske billeddannelse.
Begynd med at så ca. 20 steriliserede Arabidopsis frø på 1/2 Murashige og Skoog eller MS agar firkantede plader. Seal pladerne med pore kirurgisk tape og pak dem med aluminiumsfolie i en til tre dages inkubation ved fire grader Celsius for stratificering. Ved rodbilleddannelse overføres pladerne til et vækstkammer i lodret retning i tre dage under de angivne betingelser.
For mørkvoksen hypocotyl overføres pladerne til vækstkammeret for en en-fire timers lyspuls for at synkronisere spiringen. Pak derefter pladerne med aluminiumsfolie, og læg dem ind i vækstkammeret i lodret retning i tre dage. For steady state målinger, tilføje 50 mikroliter mock løsning til en ren mikroskop dias og forsigtigt placere tre nukleare lokaliseret gibberellin perception sensor en eller nlsGPS1 udtrykke planter på diaset.
Derefter spot en dråbe et vakuum fedt på hvert hjørne af en ren dækning slip og forsigtigt sted at dække glide over planter. Forsigtigt tilføje ekstra mock løsning til at fjerne eventuelle luftbobler efter behov. Før gibberellin fire eller GA4 behandling, bruge en 20 milliliter sprøjte fyldt med vakuum fedt og udstyret med en modificeret 200 mikroliter pipette spids med en en millimeter diameter åbning til at tegne en ensartet lagdelt tre og en halv centimeter lang med to og en halv centimeter bred rektangel på en ren glas dias.
Tilføj 50 mikroliter mock opløsning til midten af rektanglet og bruge rene kraftang til at løfte nlsGPS1 udtrykke planter ved undersiden af deres cotyledons for omhyggelig overførsel til mock løsning. Placer en dæksel, der er plettet med vakuumfedt, som netop demonstreret ind i midten af vakuumfedtrektangelet, og fyld forsigtigt beholderen med ekstra mock-opløsning uden at forstyrre planterne. Derefter erhverve billeder af planter på en konfokal mikroskop udstyret med passende lasere til spændende CFP og YFP til at udføre Forster resonans energioverførsel billeddannelse.
For GA4 til behandling skal du fjerne diaset fra mikroskopstadiet og indstille en timer i 20 minutter. Fjern straks mock-opløsningen fra højre side af dækslet, mens du tilføjer 17 mikroliter på en fjerdedel MS væske suppleret med en mikrotand ga4 til venstre side af dækslet, indtil alle mock-opløsningen er blevet udskiftet. Placer derefter glasset glide tilbage på mikroskopet fase og vente yderligere 10 minutter, før erhverve efter GA4 behandling billede.
For at oprette et tidskursus for et væv af interesse, tilføje 200 mikroliter mock løsning til midten af perfusion kanal af en ibidi klæbrig-slide, og forsigtigt placere nlsGPS1 planter i mock løsning som påvist. Brug hæcener til forsigtigt at placere en dæksel slip over planter ved hjælp af bagsiden af de virfæsner til at trykke forsigtigt på de ydre kanter af dækslet slip, indtil det danner en stærk binding med klæbrig materiale i periferien af klæbrig-dias. Brug derefter to 0,8 millimeter indre diameter albue Luer stik og 0,8 millimeter indre diameter stykke silikonerør til at forbinde den klæbrige-slide til en 20 millimeter sprøjte fyldt med mock løsning og til at forbinde dias til en stikkontakt beholder til indsamling af udstrømning løsning.
Tryk forsigtigt stemplet ned for at dispensere nok opløsning til kammeret for at sikre, at der ikke er luftbobler, og læg derefter sprøjten på en programmerbar sprøjtepumpe. Start derefter pumpen for at starte tidsforløbet. For GA4 behandlinger i løbet af kurset, pause pumpen for at stoppe perfusion og erstatte mock buffer indeholder sprøjte med en sprøjte fyldt med en fjerdedel MS væske suppleret med GA4.
I forbindelse med 3D-billedanalyse skal du importere filerne til IMARIS-billedanalysesoftwareprogrammet og åbne guiden Overflader. Indstil baggrunden subtraktion til tre mikron og tærsklen til standard. Under segmenteringen af kernerne skal du passe på ikke at medtage de mange kerner med dæmpet fluorescens, da signal-til-støj-rationen af objektet med næsten baggrundsniveauer af signal vil være for lav til ratiometrisk billedanalyse.
Mask derefter den fælles fiskeripolitik og FRET-emissionskanalerne på grundlag af de overflader, der er skabt ved hjælp af YFP-emissionen. Brug forlængelsen af XT-gennemsnitsintensitetsgraden til at beregne et forhold mellem donor excitation acceptor emission divideret med donor excitation donor emission mellem middelintensitetsværdierne for de enkelte overflader i de to kanaler. Hvis du vil farvelægge de enkelte overflader med nlsGPS1-emissionsforholdet, skal du vælge farvekodning med statistik og angive middelintensitetsforholdet som statistiktype.
Under statistikikonet skal du eksportere forholdet mellem de enkelte værdier fra tabellen og kopiere og indsætte værdierne i et regneark til grafisk repræsentation af dataene. I Arabidopsis-roden er nlsGPS1-emissionsgradienten tegn på lave GA4-niveauer i meristematiske zoner og divisionszoner og høje GA-niveauer i den sene forlængelseszone. I modsætning hertil observeres en emissionsgradient ikke i nlsGPS1 ikke-reagerende rødder, hvilket tyder på, at den endogene GA4-gradient ikke er en artefakt.
En nlsGPS1 emissionsforhold gradient dannes også i mørkvoksne hypokotyler med lave niveauer i cotyledons og den typiske krog og høje niveauer i den hurtigt aflange basale region af hypocotyl. I modsætning hertil observeres der ikke en emissionsgradient i nlsGPS1-allergigivende hypocotyler. Desuden ophobes eksogent leveret GA4 fortrinsvis i forlængelseszonen sammenlignet med opdelingszonen af Arabidopsis-roden, hvilket indikerer, at nlsGPS1 kan anvendes til at studere endogene og eksogene GA-mønstre.
Desuden afslører tidsforløbsanalyse af GA4 behandlet nlsGPS1 kimplanter, en hurtigere ophobning af udefrakommende GA4 i roden forlængelse så i forhold til division zone. Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske at undgå mættede pixels under den kvantitative billeddannelse for at holde billeddannelsesparametrene konstante og minimere drift- og fokusændringsproblemerne under prøven perfusion. Efter denne procedure udarbejdet metoder, ligesom billeddannende rødder vokser i root chip type kontrol profusion enheder kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om, hvordan GA gradienter ændre sig i Arabidopsis rod tips vokser med forskellige satser eller som reaktion på stress Efter dens udvikling, denne teknik banede vejen for forskning inden for plantevækst at udforske den dynamiske fordeling af gibberellins i yderligere arabidopsis thaliana væv og organer.
Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) er den første Förster resonans energi transfer-baseret biosensor til måling af de cellulære niveauer af gibberellin Phytohormoner med en høj spatiotemporelle opløsning. Denne protokol rapporter om metoden til at visualisere og kvantificere cellulære gibberellin niveauer ved hjælp af genetisk kodet nlsGPS1 biosensor i Arabidopsis hypocotyls og roden tips.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved