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January 12th, 2019
DOI :
January 12th, 2019
•0:04
Title
0:47
Plant Growth and Sample Preparation
2:09
Gibberellin4 (GA4) Treatment
3:45
Tissue of Interest Time Course Setup
5:09
3-D Image Analysis
6:36
Results: Representative Endogenous and Exogenous GA Gradients in Arabidopsis Roots and Dark-grown Hypocotyls
7:58
Conclusion
Transcript
यह विधि विकास नियामक फाइटोहोर्मोन के वितरण के बारे में संयंत्र विकास क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वीआरटी बायोसेंसर का उपयोग करके, उदाहरण के लिए एनएलएसएस 1 जो गिबरेलिन का पता लगाता है, सेलुलर समाधान पर अरबीडोप्सिस ऊतकों में महत्वपूर्ण यौगिकों के गतिशील वितरण को मापना संभव है। आम तौर पर, इस मामले में नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे, क्योंकि FRET बायोसेंसर का विश्लेषण करने में रेशियोमेट्रिक इमेजिंग शामिल है जिसने इरादा मीट्रिक इमेजिंग की तुलना में शोर और अतिरिक्त विश्लेषणात्मक कदम बढ़ा दिए हैं।
1/2 मुरशिगे और स्कूग या एमएस एगर स्क्वायर प्लेटों पर लगभग 20 निष्फल अरबीडोप्सिस बीज बोने से शुरू करें। पोर सर्जिकल टेप के साथ प्लेटों को सील करें और उन्हें स्तरीकरण के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के एक से तीन दिनों के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें। रूट इमेजिंग के लिए, प्लेटों को इंगित शर्तों के तहत तीन दिनों के लिए एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें।
अंधेरे-विकसित हाइपोकॉटायल के लिए, अंकुरण को सिंक्रोनाइज करने के लिए प्लेटों को एक से चार घंटे की हल्की नाड़ी के लिए विकास कक्ष में स्थानांतरित करें। फिर प्लेटों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें, और उन्हें तीन दिनों के लिए एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में विकास कक्ष में रखें। स्थिर राज्य माप के लिए, एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए नकली समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से स्लाइड पर रोपण व्यक्त करते हुए तीन परमाणु स्थानीयकृत गिबरेलिन धारणा सेंसर एक या nlsGPS1 रखें।
फिर एक बूंद एक साफ कवर पर्ची के प्रत्येक कोने पर एक वैक्यूम तेल हाजिर और धीरे से रोपण पर पर्ची को कवर करने के लिए जगह है । आवश्यक के रूप में किसी भी हवा बुलबुले को दूर करने के लिए अतिरिक्त नकली समाधान ध्यान से जोड़ने। गिबरेलिन चार या GA4 उपचार से पहले, वैक्यूम तेल से भरे 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें और एक संशोधित 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप से लैस एक मिलीमीटर व्यास खोलने के साथ एक समान रूप से स्तरित तीन और एक आधा सेंटीमीटर लंबे समय तक एक साफ ग्लास स्लाइड पर ढाई सेंटीमीटर चौड़ा आयत आकर्षित करने के लिए ।
आयत के केंद्र में नकली समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और मॉक समाधान में सावधानीपूर्वक हस्तांतरण के लिए अपने कोटिलेडॉन के नीचे से रोपण व्यक्त करने वाले nlsGPS1 को उठाने के लिए स्वच्छ संदंश का उपयोग करें। वैक्यूम तेल आयत के केंद्र में प्रदर्शन के रूप में वैक्यूम तेल आयत के साथ देखा एक कवर पर्ची रखें और ध्यान से रोपण परेशान किए बिना अतिरिक्त नकली समाधान के साथ जलाशय को भरने । फिर फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण इमेजिंग करने के लिए रोमांचक सीएफपी और वाईएफपी के लिए उपयुक्त लेजर से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर रोपण की छवियां प्राप्त करें।
उपचार के लिए GA4 के लिए, माइक्रोस्कोप चरण से स्लाइड निकालें और 20 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें। एक चौथाई एमएस लिक्विड के 17 माइक्रोलीटर को कवर स्लिप के बाईं ओर एक माइक्रो मोलर GA4 के साथ सप्लीमेंट करते हुए कवर स्लिप के दाईं ओर से मॉक सॉल्यूशन को तुरंत हटा दें जब तक कि सभी मॉक सॉल्यूशन को बदल नहीं दिया जाता । फिर ग्लास स्लाइड को माइक्रोस्कोप चरण पर वापस रखें और GA4 उपचार छवि के बाद प्राप्त करने से पहले एक और 10 मिनट इंतजार करें।
ब्याज के ऊतकों के लिए एक समय पाठ्यक्रम स्थापित करने के लिए, एक आईबिदी चिपचिपा-स्लाइड के परफ्यूजन चैनल के केंद्र में नकली समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे प्रदर्शन के रूप में नकली समाधान में nlsGPS1 रोपण रखें। धीरे-धीरे रोपण के पीछे का उपयोग करके रोपण पर एक कवर स्लिप रखने के लिए संदंश का उपयोग करें कवर स्लिप के बाहरी किनारों पर धीरे-धीरे दबाएं जब तक कि यह चिपचिपा-स्लाइड की परिधि पर चिपचिपा सामग्री के साथ एक मजबूत बंधन न बन जाए। इसके बाद, नकली समाधान से भरे 20 मिलीमीटर सिरिंज से चिपचिपा स्लाइड को जोड़ने और बहिर्वाह समाधान एकत्र करने के लिए स्लाइड को एक आउटलेट कंटेनर से जोड़ने के लिए दो ०.८ मिलीमीटर आंतरिक व्यास कोहनी ल्यूयर कनेक्टर और सिलिकॉन ट्यूबिंग के ०.८ मिलीमीटर इनर व्यास के टुकड़े का उपयोग करें ।
धीरे से प्लंजर दबाना कक्ष के लिए पर्याप्त समाधान बांटना सुनिश्चित करने के लिए कि वहां कोई हवा बुलबुले है और फिर एक प्रोग्राम सिरिंज पंप पर सिरिंज लोड । फिर समय पाठ्यक्रम शुरू करने के लिए पंप शुरू करें। समय पाठ्यक्रम के दौरान GA4 उपचार के लिए, पंप को रोकने के लिए परफ्यूजन को रोकने और एक चौथाई एमएस तरल GA4 के साथ पूरक से भरा सिरिंज युक्त नकली बफर की जगह ।
3डी इमेज एनालिसिस के लिए, फाइलों को IMARIS इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में आयात करें और सतहों के जादूगर को खोलें। पृष्ठभूमि घटाव को तीन माइक्रोन और थ्रेसहोल्ड को डिफ़ॉल्ट करने के लिए सेट करें। नाभिक के विभाजन के दौरान ध्यान रखें कि कई नाभिक को मंद फ्लोरेसेंस के साथ शामिल न करें क्योंकि सिग्नल के निकट पृष्ठभूमि स्तर वाले ऑब्जेक्ट के सिग्नल-टू-शोर राशन अनुपातमेट्रिक छवि विश्लेषण के लिए बहुत कम होंगे।
फिर वाईएफपी उत्सर्जन का उपयोग करके बनाई गई सतहों के आधार पर सीएफपी और एफआरटी उत्सर्जन चैनलों को मुखौटा करें। दो चैनलों में व्यक्तिगत सतहों के मतलब तीव्रता मूल्यों के बीच दाता उत्तेजन दाता उत्सर्जन द्वारा विभाजित दाता उत्तेजन स्वीकारकर्ता उत्सर्जन के अनुपात की गणना करने के लिए एक्सटी मतलब तीव्रता अनुपात विस्तार का उपयोग करें। nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात के साथ व्यक्तिगत सतहों रंग के लिए, आंकड़ों के साथ रंग कोडिंग का चयन करें और सांख्यिकी प्रकार के रूप में मतलब तीव्रता अनुपात निर्धारित करते हैं ।
सांख्यिकी आइकन के तहत, तालिका से व्यक्तिगत मूल्यों के अनुपात का निर्यात करें और डेटा के चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए मूल्यों को स्प्रेडशीट में कॉपी करें और चिपकाएं। अरबीडोप्सिस रूट में, NLsGPS1 उत्सर्जन अनुपात ढाल मेरिस्टेमेटिक और डिवीजन जोन में कम GA4 स्तर और देर से विस्तार क्षेत्र में उच्च GA स्तर का संकेत है। इसके विपरीत, एनएलएसएसपी1 गैर-प्रतिक्रियात्मक जड़ों में उत्सर्जन अनुपात ढाल नहीं देखा जाता है, जिससे यह सुझाव दिया जाता है कि अंतर्जात GA4 ढाल एक विरूपण साक्ष्य नहीं है।
एक nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात ढाल भी कोटिलेडोन में कम स्तर और हाइपोकॉटिल के तेजी से विस्तारित बेसल क्षेत्र में ठेठ हुक और उच्च स्तर के साथ अंधेरे में विकसित हाइपोकॉटायल में बनता है। इसके विपरीत, एनएलएसजीपीएसएस1 गैर-प्रतिक्रियात्मक हाइपोकॉटाइल्स में उत्सर्जन अनुपात ढाल नहीं देखा जाता है। इसके अलावा, एक्सोजेनोसली आपूर्ति GA4 अरबीडोप्सिस रूट के डिवीजन जोन की तुलना में विस्तार क्षेत्र में अधिमानतः जमा होता है जो यह दर्शाता है कि एनएलएसजीपीएस1 का उपयोग अंतर्जात और बहिर्जात जीए पैटर्निंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
इसके अलावा, GA4 इलाज nlsGPS1 रोपण के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण, मूल विस्तार में बहिर्जात GA4 के तेजी से संचय से पता चलता है तो डिवीजन क्षेत्र की तुलना में । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय इमेजिंग मापदंडों को स्थिर रखने और नमूना परफ्यूजन के दौरान बहाव और फोकल चेंज के मुद्दों को कम करने के लिए मात्रात्मक इमेजिंग के दौरान संतृप्त पिक्सेल से बचने के लिए याद रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद सविस्तार तरीकों, इमेजिंग जड़ चिप प्रकार नियंत्रण प्रचुरता उपकरणों में बढ़ जड़ों की तरह कैसे GA ढाल अरबी जड़ युक्तियों में परिवर्तन के बारे में अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है विभिन्न दरों पर बढ़ रही है या इसके विकास के बाद तनाव के जवाब में, इस तकनीक संयंत्र के विकास के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए मार्ग प्रशस्त करने के लिए अतिरिक्त Arabidopsis thaliana ऊतकों और अंगों में gibberellins के गतिशील वितरण का पता लगाने ।
Gibberellin धारणा संवेदक 1 (GPS1) एक उच्च phytohormones संकल्प के साथ Gibberellin spatiotemporal के सेलुलर स्तर को मापने के लिए पहली Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण आधारित है । इस प्रोटोकॉल की विधि पर रिपोर्ट करने के लिए कल्पना और nlsGPS1 Arabidopsis hypocotyls और रूट युक्तियों में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग gibberellin का उपयोग करके सेलुलर स्तर बढ़ाता है ।
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