이 방법은 성장 조절 식물 호르몬의 분포에 관한 식물 개발 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기베렐린을 검출하는 nlsGPS1과 같은 유전자 인코딩된 FRET 바이오 센서를 사용하여 세포 용액에서 아기도시스 조직에서 중요한 화합물의 동적 분포를 측정할 수 있습니다. 일반적으로 FRET 생체 센서를 분석하는 것은 의도 메트릭 이미징에 비해 소음과 추가 분석 단계를 증가시킨 비율 이미징을 포함하기 때문에 이 문제에 새로운 개인은 어려움을 겪을 것입니다.
1/2 무라시게와 스쿠그 또는 MS 에이카 스퀘어 플레이트에 약 20개의 살균된 아라비도시스 씨앗을 파종하여 시작합니다. 기공 수술 용 테이프로 접시를 밀봉하고 계층화를 위해 섭씨 4도에서 1 ~ 3 일 동안 알루미늄 호일로 감쌉니다. 루트 이미징의 경우, 표시된 조건하에서 3일 동안 수직 방향으로 플레이트를 성장 챔버로 옮는다.
암조 된 Hypocotyl의 경우, 발아를 동기화하기 위해 1 ~ 4 시간 광 펄스에 대한 성장 챔버로 플레이트를 전송합니다. 그런 다음 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 3일 동안 수직 방향으로 성장 챔버에 넣습니다. 꾸준한 상태 측정을 위해 50 마이크로리터의 모의 용액을 깨끗한 현미경 슬라이드에 추가하고 3개의 핵 국소화 횡설수질 지각 센서 1 개 또는 nlsGPS1을 슬라이드에 부드럽게 배치합니다.
그런 다음 깨끗한 커버 슬립의 각 모서리에 진공 그리스를 떨어 뜨리고 부드럽게 배치하여 묘목 위에 미끄러짐을 덮습니다. 필요에 따라 기포를 제거하기 위해 추가 모의 솔루션을 신중하게 추가합니다. gibberellin 4 또는 GA4 처리 전에, 진공 그리스로 채워진 20 밀리리터 주사기를 사용하고 깨끗한 유리 슬라이드에 2 센티미터 반 긴 균일하게 계층 3 반 센티미터 길이를 그릴 수있는 1 밀리미터 직경의 수정 된 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 장착.
사각형의 중앙에 50 마이크로리터의 모의 용액을 추가하고 깨끗한 집게를 사용하여 코틸레돈의 밑면에 모종을 표현하는 nlsGPS1을 들어 올려 모의 용액으로 조심스럽게 전달합니다. 진공 그리스 사각형의 중앙에 입증된 것처럼 진공 그리스로 발견된 커버 슬립을 놓고 모종을 방해하지 않고 여분의 모의 용액으로 저장소를 조심스럽게 채웁니다. 그런 다음 포스터 공명 에너지 전달 이미징을 수행하기 위해 흥미로운 CFP 및 YFP에 적합한 레이저가 장착 된 공초점 현미경에서 모종의 이미지를 습득합니다.
치료를 위해 GA4의 경우 현미경 단계에서 슬라이드를 제거하고 20 분 동안 타이머를 설정하십시오. 모든 모의 용액이 교체될 때까지 커버 슬립의 왼쪽에 1개의 마이크로 어어 GA4로 보충된 1분기 MS 액체의 17마이크로리터를 추가하면서 커버 슬립의 오른쪽에서 모의 용액을 즉시 제거합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 현미경 단계에 다시 놓고 GA4 치료 영상을 획득하기 전에 또 다른 10 분을 기다립니다.
관심 있는 조직을 위한 타임 코스를 설정하려면 200 마이크로리터의 모의 용액을 ibidi 스티커 슬라이드의 관류 채널의 중앙에 추가하고 nlsGPS1 묘목을 모의 용액에 부드럽게 배치합니다. 집게를 사용하여 포셉의 뒷면을 사용하여 모종 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 끈적끈적한 슬라이드 주변의 끈적끈적한 재료와 강한 결합을 형성할 때까지 커버 슬립의 바깥쪽 가장자리를 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 0.8mm 의 내경 팔꿈치 루어 커넥터 2개와 0.8mm 의 내부 직경 의 실리콘 튜브 조각을 사용하여 끈적 끈적한 슬라이드를 모의 용액으로 채워진 20mm 주사기에 연결하고 슬라이드를 유출 용액을 수집하기 위한 출구 용기에 연결합니다.
플런저를 부드럽게 누르고 챔버에 충분한 용액을 분배하여 기포가 없는지 확인하고 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 로드합니다. 그런 다음 펌프를 시작하여 시간 과정을 시작합니다. 시간 과정 동안 GA4 치료의 경우 펌프를 일시 중지하여 관류를 중지하고 주사기를 함유 한 모의 버퍼를 GA4로 보충 한 1 분기 MS 액체로 채워진 주사기로 교체하십시오.
3D 이미지 분석을 위해 파일을 IMARIS 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 표면 마법사를 엽니다. 배경 빼기를 세 미크론으로 설정하고 임계값을 기본값으로 설정합니다. 핵의 분할 동안 신호의 근거리 수준으로 물체의 신호-잡음 배급이 비율측정 영상 분석을 위해 너무 낮을 것이기 때문에 희미한 형광을 가진 많은 핵을 포함하지 않도록 주의한다.
그런 다음 YFP 방출을 사용하여 생성된 표면을 기반으로 CFP 및 FRET 방출 채널을 마스크합니다. XT 평균 강도 비율 확장을 사용하여 두 채널에서 개별 표면의 평균 강도 값 사이에 기증자 여기 기증자 방출로 나눈 기증자 흥분 수락기 방출의 비율을 계산한다. nlsGPS1 방출 비율로 개별 표면을 채색하려면 통계와 함께 색상 코딩을 선택하고 평균 강도 비율을 통계 유형으로 설정합니다.
통계 아이콘에서 테이블에서 개별 값의 비율을 내보내고 값을 스프레드시트에 붙여 데이터를 그래픽으로 표현합니다. 애기독증 뿌리에서 nlsGPS1 방출비 그라데이션은 후기 신장 영역에서 의 결합 및 분열 영역에서 낮은 GA4 수준과 높은 GA 수준을 나타냅니다. 대조적으로, 내생 GA4 그라데이션은 아티팩트가 아님을 암시하는 nlsGPS1 무응답 뿌리에서 배출비 그라데이션이 관찰되지 않는다.
nlsGPS1 방출 비 그라데이션은 또한 코틸레돈의 낮은 수준과 hypocotyl의 급속하게 길쭉한 기저 영역에서 일반적인 후크 및 높은 수준을 가진 어두운 성장 한 hypocotyls에서 형성됩니다. 대조적으로, 방출 비 그라데이션은 nlsGPS1 불반응성 저혈당에서 관찰되지 않습니다. 더욱이, 외인성 공급GA4는 nlsGPS1이 내인성 및 외인성 GA 패터닝을 연구하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 아라비도시스 뿌리의 분단 영역에 비해 신장 영역에서 우대적으로 축적된다.
또한, GA4 처리 nlsGPS1 묘목의 시간 과정 분석은, 뿌리 신장에 외인성 GA4의 빠른 축적을 밝혀 그래서 분할 영역에 비해. 이 절차를 시도하는 동안 이미징 매개 변수를 일정하게 유지하고 샘플 관류 중 드리프트 및 초점 변화 문제를 최소화하기 위해 정량적 이미징 중에 포화 픽셀을 피하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 루트 칩 유형 제어 구체 장치에서 성장 하는 이미징 뿌리 같은 다른 속도로 성장 하는 애기독시스 루트 팁에서 GA 그라데이션 변경 또는 그것의 개발 후 스트레스에 대 한 응답에 대 한 추가 질문에 대답 하기 위해 수행 될 수 있습니다., 이 기술은 추가 아랍 idopsis thaliana 조직에 횡설설수설의 동적 분포를 탐구 하는 식물 성장 분야에서 연구를 위한 길을 포장.
