10.2K Views
•
08:53 min
•
January 12th, 2019
DOI :
January 12th, 2019
•0:04
Title
0:47
Plant Growth and Sample Preparation
2:09
Gibberellin4 (GA4) Treatment
3:45
Tissue of Interest Time Course Setup
5:09
3-D Image Analysis
6:36
Results: Representative Endogenous and Exogenous GA Gradients in Arabidopsis Roots and Dark-grown Hypocotyls
7:58
Conclusion
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen anleggsutviklingsfeltet om fordelingen av vekstreguleringsmessige fytohormoner. Ved hjelp av genetisk kodet FRET biosensorer, for eksempel nlsGPS1 som oppdager gibberellins, er det mulig å måle dynamisk distribusjon av viktige forbindelser i Arabidopsis vev på cellulær løsning. Generelt vil personer som er nye i denne saken slite, fordi analyse av FRET biosensorer innebærer rasjonering som har økt støy og ytterligere analytiske skritt sammenlignet med intensjonsmetrisk bildebehandling.
Begynn med å så ca 20 steriliserte Arabidopsis frø på 1/2 Murashige og Skoog eller MS agar firkantede plater. Forsegle platene med pore kirurgisk tape og pakk dem med aluminiumsfolie i en til tre dager med inkubasjon ved fire grader Celsius for stratifisering. For rotavbildning, overfør platene til et vekstkammer i vertikal retning i tre dager under de angitte forholdene.
For mørkvoksne Hypocotyl, overfør platene til vekstkammeret for en en til fire timers lyspuls for å synkronisere spiringen. Pakk deretter platene med aluminiumsfolie, og legg dem inn i vekstkammeret i vertikal orientering i tre dager. For steady state målinger, legg til 50 mikroliter mock løsning til et rent mikroskop lysbilde og forsiktig plassere tre kjernefysiske lokaliserte Gibberellin oppfatning sensor en eller nlsGPS1 uttrykker frøplanter på lysbildet.
Deretter ser du et vakuumfett på hvert hjørne av en ren dekkslipp og legg forsiktig over frøplantene. Legg forsiktig til ekstra mock løsning for å fjerne eventuelle luftbobler etter behov. Før gibberellin fire eller GA4 behandling, bruk en 20 milliliter sprøyte fylt med vakuumfett og utstyrt med en modifisert 200 mikroliter pipette tips med en en millimeter diameter åpning for å tegne en jevnt lagdelt tre og en halv centimeter lang med to og en halv centimeter bredt rektangel på et rent glass lysbilde.
Tilsett 50 mikroliter mock løsning til midten av rektangelet og bruk rene tang for å løfte nlsGPS1 uttrykke frøplanter ved undersiden av deres cotyledons for forsiktig overføring til mock løsning. Plasser en dekselslipp oppdaget med vakuumfett som nettopp demonstrert inn i midten av vakuumfettrektangelet og fyll forsiktig reservoaret med ekstra mock-løsning uten å forstyrre plantene. Deretter skaffe bilder av plantene på et konfokal mikroskop utstyrt med passende lasere for spennende CFP og YFP for å utføre Forster resonans energioverføring bildebehandling.
For GA4 for behandling, fjern lysbildet fra mikroskopstadiet og still inn en timer i 20 minutter. Fjern umiddelbart mock-løsningen fra høyre side av dekselslipp mens du legger til 17 mikroliter av en fjerdedel MS væske supplert med en mikro molar GA4 til venstre side av dekselet slip til alle mock løsningen er erstattet. Plasser deretter glasset gli tilbake på mikroskopstadiet og vent ytterligere 10 minutter før du anskaffer behandlingsbildet etter GA4.
For å sette opp et tidskurs for et vev av interesse, legg til 200 mikroliter mock løsning til midten av perfusjonskanalen til en ibidi klebrig-lysbilde, og legg forsiktig nlsGPS1 frøplanter inn i mock-løsningen som demonstrert. Bruk tang til å forsiktig plassere en dekselslipp over plantene ved hjelp av baksiden av tangen til å trykke forsiktig på de ytre kantene av dekselet slip til det danner et sterkt bånd med klebrig materiale på periferien av klebrig-slide. Deretter bruker du to 0,8 millimeter innerdiameter albue Luer-kontakter og 0,8 millimeter innvendig diameter stykke silikonrør for å koble klebrig-slide til en 20 millimeter sprøyte fylt med mock løsning og for å koble lysbildet til en utløpsbeholder for å samle utstrømningsløsningen.
Trykk stempelet forsiktig ned for å dispensere nok oppløsning til kammeret for å sikre at det ikke er luftbobler og deretter laste sprøyten på en programmerbar sprøytepumpe. Start deretter pumpen for å starte tidsforløpet. For GA4 behandlinger i løpet av tidsforløpet, pause pumpen for å stoppe perfusjonen Og erstatte mock buffer som inneholder sprøyte med en sprøyte fylt med en fjerdedel MS væske supplert med GA4.
For 3D-bildeanalyse, importer filene til IMARIS bildeanalyseprogram og åpner overflateveiviseren. Sett bakgrunnsundertraksjonen til tre mikron og terskelen til standard. Under segmentering av kjernene ta vare på ikke å inkludere de mange kjerner med dim fluorescens som signal-til-støy rasjon av objektet med nær bakgrunn nivåer av signal vil være for lav for rasjonsmetrisk bildeanalyse.
Masker deretter CFP- og FRET-utslippskanalene basert på overflatene som er opprettet ved hjelp av YFP-utslippet. Bruk XT-utvidelsen av gjennomsnittlig intensitetsforhold til å beregne et forhold mellom donor eksitasjonssenovitasjonsutslipp delt på donor-eksitasjonsgiverutslippet mellom gjennomsnittsintensitetsverdiene til de enkelte overflatene i de to kanalene. Hvis du vil fargelegge de enkelte overflatene med nlsGPS1-utslippsforholdet, velger du fargekoding med statistikk og angir gjennomsnittlig intensitetsforhold som statistikktype.
Under statistikkikonet eksporterer du forholdet mellom individuelle verdier fra tabellen og kopierer og limer inn verdiene i et regneark for grafisk representasjon av dataene. I Arabidopsis-roten er nlsGPS1-utslippsgradienten et tegn på lave GA4-nivåer i de meristematiske og divisjonssonene og høye GA-nivåer i sen forlengelsessonen. I motsetning observeres ikke en gradient for utslippsforhold i nlsGPS1 ikke-responsive røtter, noe som tyder på at den endogene GA4-graderingen ikke er en artefakt.
En nlsGPS1 utslippsgradient dannes også i mørkdyrkede hypocotyler med lave nivåer i cotyledons og den typiske kroken og høye nivåer i den raskt langstrakte basalregionen av hypocotyl. En gradient for utslippsgradient observeres derimot ikke i nlsGPS1-hypocotylene som ikke svarer. Videre akkumuleres eksogent levert GA4 fortrinnsvis i forlengelsessonen sammenlignet med divisjonssonen til Arabidopsis roten som indikerer at nlsGPS1 kan brukes til å studere endogene og eksogene GA-mønster.
I tillegg avslører tidsanalyse av GA4 behandlet nlsGPS1 frøplanter, en raskere akkumulering av eksogen GA4 i rotavviklingen sammenlignet med divisjonssonen. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å unngå mettede piksler under kvantitativ bildebehandling for å holde bildeparametrene konstante og for å minimere drift- og fokalendringsproblemer under prøveperfusjonen. Etter denne prosedyren utarbeidet metoder, som imaging røtter vokser i rot chip type kontroll overflod enheter kan utføres for å svare på flere spørsmål om hvordan GA gradienter endring i Arabidopsis rot tips vokser i forskjellige priser eller som svar på stress Etter utviklingen, denne teknikken banet vei for forskning innen plantevekst for å utforske den dynamiske fordelingen av gibberellins i flere Arabidopsis thaliana vev og organer.
Gibberellin persepsjon Sensor 1 (GPS1) er det første han selvmord resonans energi overføring-basert biosensor for måling av mobilnettet nivåene av gibberellin phyto-hormoner med et spatiotemporal med høy oppløsning. Denne protokollen rapporter om metoden å visualisere og kvantifisere mobilnettet gibberellin nivåer ved hjelp av genetisk kodet nlsGPS1 biosensor i Arabidopsis hypocotyls og rot tips.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved