Visualisera cellulära Gibberellin nivåer med hjälp av NlsGPS1 Förster resonans energi överföring (bandet) Biosensor

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom anläggningen utvecklingsområdet när det gäller fördelningen av tillväxt reglerande fytohormoner. Genom att använda genetiskt kodade FRET biosensorer, till exempel nlsGPS1 som detekterar gibberelliner, är det möjligt att mäta den dynamiska fördelningen av viktiga föreningar i Arabidopsis vävnader vid den cellulära lösningen. Generellt individer nya i denna fråga kommer att kämpa, eftersom analysera FRET biosensorer innebär ratiometric bildbehandling som har ökat buller och ytterligare analytiska steg jämfört med avsikt metriska avbildning.

Börja med att så cirka 20 steriliserade Arabidopsis frön på 1/2 Murashige och Skoog eller MS agar kvadratplattor. Försegla plattorna med pora kirurgiska tejp och linda dem med aluminiumfolie för en till tre dagars inkubation vid fyra grader Celsius för stratifiering. För rotavbildning, överför plattorna till en tillväxtkammare i vertikal orientering under tre dagar under de angivna förhållandena.

För mörkvuxen Hypocotyl, överför plattorna till tillväxtkammaren för en en till fyra timmars ljuspuls för att synkronisera grobarheten. Linda sedan plattorna med aluminiumfolie, och placera dem i tillväxtkammaren i en vertikal orientering i tre dagar. För steady state mätningar, tillsätt 50 mikroliter av mock lösning till ett rent mikroskop glida och försiktigt placera tre nukleära lokaliserade gibberellin perception sensor en eller nlsGPS1 uttrycker plantor på bilden.

Sedan plats en droppe ett vakuum fett på varje hörn av en ren täcka slip och försiktigt plats för att täcka glida över plantorna. Försiktigt lägga extra mock lösning för att ta bort eventuella luftbubblor som behövs. Innan gibberellin fyra eller GA4 behandling, använd en 20 milliliter spruta fylld med vakuumfett och utrustad med en modifierad 200 microliter pipett spets med en en millimeter diameter öppning för att dra en jämnt skiktad tre och en halv centimeter lång med två och en halv centimeter bred rektangel på en ren glasskiva.

Lägg till 50 mikroliter av mock lösning till mitten av rektangeln och använda rena tlykningar för att lyfta nlsGPS1 uttrycker plantor av undersidan av deras cotyledons för noggrann överföring i mock lösningen. Placera en täckslig fläckig med vakuumfett som just visats i mitten av vakuumfettrektangeln och fyll försiktigt reservoaren med extra hånlösning utan att störa plantorna. Sedan skaffa bilder av plantorna på en confocal mikroskop utrustad med lämpliga lasrar för spännande CFP och YFP att utföra Forster resonans energiöverföring imaging.

För GA4 för behandling, ta bort bilden från mikroskopet scenen och ställa in en timer för 20 minuter. Avlägsna omedelbart mocklösningen från täcksliens högra sida samtidigt som 17 mikroliter av en fjärdedel MS-vätska kompletteras med en mikrome molar GA4 till vänster om luckan tills alla mock-lösningen har bytts ut. Placera sedan glaset glida tillbaka på mikroskopet scenen och vänta ytterligare 10 minuter innan förvärva efter GA4 behandling bild.

För att ställa in en tidskurs för en vävnad av intresse, lägga till 200 mikroliter av mock lösning till centrum av perfusion kanal av en ibidi klibbig-slide, och försiktigt placera nlsGPS1 plantor i mock lösning som visat. Använd tensor för att försiktigt placera en överdragsglidning över plantorna med hjälp av krafttopparnas baksida för att trycka försiktigt på täckets yttre kanter tills det bildar en stark bindning med det klibbiga materialet i periferin av den klibbiga-glidbanan. Därefter använder två 0,8 millimeter innerdiameter armbåge Luer kontakter och 0,8 millimeter innerdiameter bit av silikon slangar för att ansluta klibbig-glid till en 20 millimeters spruta fylld med mock lösning och att ansluta bilden till ett utlopp behållare för insamling av utflöde lösning.

Tryck försiktigt ned kolven för att dosera tillräckligt med lösning till kammaren för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor och sedan lasta sprutan på en programmerbar sprutpump. Starta sedan pumpen för att initiera tidskursen. För GA4-behandlingar under tidskursen, pausa pumpen för att stoppa perfusionen Och sätt tillbaka den mockbuffert som innehåller spruta med en spruta fylld med en fjärdedel MS-vätska kompletterad med GA4.

För 3D-bildanalys, importera filerna till IMARIS bildanalysprogram och öppna ytorna guiden. Ställ in subtraktionen för bakgrunden på tre mikron och tröskelvärdet till standard. Under segmenteringen av atomkärnorna noga med att inte inkludera de många atomkärnor med dunkla fluorescens som signal-till-brus ranson av objektet med nära bakgrundsnivåer av signal kommer att vara för låg för ratiometric bildanalys.

Maskera sedan utsläppskanalerna för den gemensamma fiskeripolitiken och FRET utifrån de ytor som skapas med hjälp av YFP-emissionen. Använd XT medel intensitet förhållandet förlängning att beräkna ett förhållande av givaren excitation acceptor utsläpp dividerat med givaren excitation givaren utsläpp mellan medelvärden intensitet värden för de enskilda ytorna i de två kanalerna. Om du vill färglägga de enskilda ytorna med emissionsförhållandet nlsGPS1 väljer du färgkodning med statistik och ställer in medelintensitetsförhållandet som statistiktyp.

Exportera nyckeltalen för enskilda värden från tabellen under statistikikonen och kopiera och klistra in värdena i ett kalkylblad för grafisk representation av data. I Arabidopsis roten är nlsGPS1 utsläpp förhållandet gradienten vägledande för låga GA4 nivåer i de meristema och division zoner och höga GA-nivåer i den sena töjning zonen. Däremot observeras inte en utsläppsförhållandets gradient i icke-ansvarsfulla NLSGPS1-rötter, vilket tyder på att den endogena GA4-gradienten inte är en artefakt.

En nlsGPS1 emissionskvotsgradient bildas också i mörkvuxna hypocotyls med låga halter i cotyledonerna och den typiska kroken och höga halter i den snabbt långsträckta basala regionen av hypokotylen. Däremot observeras inte en utsläppskvotsgradient i icke-responsiva hypocotyls nlsGPS1. Vidare ackumuleras exogent levereras GA4 företrädesvis i töjningszonen jämfört med division zonen av Arabidopsis roten som anger att nlsGPS1 kan användas för att studera endogena och exogena GA mönstring.

Dessutom tid kurs analys av GA4 behandlas nlsGPS1 plantor, avslöjar en snabbare ackumulering av exogena GA4 i roten töjning så jämfört med division zonen. Samtidigt försöker denna procedur är det viktigt att komma ihåg att undvika mättade pixlar under den kvantitativa avbildningen att hålla avbildning parametrarna konstant och för att minimera drift och kontaktpunkternas förändring frågor under provet perfusion. Efter detta förfarande utarbetade metoder, som imaging rötter växer i root chip typ kontroll profusion enheter kan utföras för att svara på ytterligare frågor om hur GA gradienter förändras i Arabidopsis rot tips växer i olika takt eller som svar på stress Efter dess utveckling, denna teknik banade väg för forskning inom området växttillväxt att utforska den dynamiska fördelningen av gibberellins i ytterligare Arabidopsis thaliana vävnader och organ.