6.8K Views
•
10:56 min
•
April 13th, 2019
DOI :
April 13th, 2019
•0:04
Title
1:02
TEM Preparation Embedding, Ultra-Thin Sectioning and Staining
2:05
Imaging of Corresponding ROIs on the Reference and Look-Up Sections on TEM with Software Packages
5:25
Analyze the TEM images with ImageJ to Document Ultrastructural Features
7:10
Using SerialEM Script to Optimize Elemental Analysis in Brain Samples in Combination with DigitalMicrograph
9:19
Results: Unbiased Approach of Sampling TEM Sections
10:25
Conclusion
Transcript
Een onpartijdig bemonsteringsprotocol is van vitaal belang voor elektronenmicroscopie. Als u wilt kwantificeren op numerieke dichtheid van synapsen of andere structuren in een bepaald hersengebied, het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat het onbevooroordeeld is, en maakt het mogelijk om automatisch elektronenmicrografen te produceren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Deze techniek is ook waardevol in andere onderzoeksgebieden, zoals neurowetenschappen, waar het kan worden gebruikt bij het beoordelen van de sterkte van een neuraal netwerk.
Om ons protocol toe te passen, is het noodzakelijk om ervaring te hebben in elektronenmicroscopische technieken, zoals monstervoorbereiding en het bedienen van een overgangselektronmicroscoop. Het aantonen van onze procedure zal Dr. Stefan Wernitznig zijn, een post-doc van mijn laboratorium. Dit protocol bestaat uit het voorbereiden van hersenmonsters voor elektronenmicroscopie, snijden paren van dunne secties.
Vervolgens wordt beschreven hoe u automatisch een bepaald aantal elektronenmicrografen in een gebied van belang produceren. Vervolgens zal het gebruik maken van een tellen frame om de numerieke dichtheid van structurele functies te beoordelen. Om te beginnen ontleden, fixen, repareren en insluiten van voorbeelden van belang in het insluiten van hars door het volgen van het bijbehorende tekstprotocol.
Plaats het monster vervolgens op een ultramicrotome en produceer 55 nanometer ultradunne seriële secties. Plaats de secties op een sleuf raster met de afmetingen van een millimeter bij twee millimeter, bekleed met piola vorm. Dan, counterstain de ultra dunne secties op de sleuf roosters met behulp van 2%uranyl acetaat gedurende 30 minuten, gevolgd door lood citraat gedurende 30 seconden op kamertemperatuur.
Plaats het raster in de TEM en bekijk de secties op het raster met de TEM met behulp van een lage vergroting om de kwaliteit van de secties te oriënteren en te evalueren. Start vervolgens de TEM-seriesectiesoftware, selecteer Sectie en kies Invoegen om de hoekpunten voor de sectie referentie- en opzoeksectie toe te voegen. Volg de instructies van het pop-upvenster.
Begin met de referentiesectie en ga vervolgens verder met de opzoeksectie. Zorg ervoor dat de randen van de sectie parallel zijn aan de volgende sectie, omdat de punten één en twee worden ingevoerd. Visualiseer vervolgens de referentiesectie onder lage vergroting om het interessegebied te identificeren.
Verplaats de microscoopfase met behulp van TEM-beeldanalyse op de referentiesectie naar meerdere hoekpunten van de ROI om een overzicht van de ROI te maken. Neem de coördinaten van de resulterende veelhoek op met behulp van Random Point Sampling-software. Druk hiervoor op Coördinaten toevoegen in het dialoogvenster van de Random Point Sampling-software op elk punt van de veelhoek dat nodig is om de ROI in de sectie te schetsen.
Definieer en voer vervolgens een geschikte grootte in voor de bemonsteringsgebieden en afstanden tussen de gebieden in de Random Point Sampling-software. Druk vervolgens op Raster berekenen om coördinaten te genereren op een systematische, uniforme, willekeurige manier voor de posities van de micrograaf binnen de veelhoek. Sla de bemonsteringspunten op de referentie- en opzoeksecties op met behulp van de Random Point Sampling-software en de TEM-seriesectiesoftware.
Dit zijn de coördinaten van de montages die achteraf worden geregistreerd. Druk in de Random Point Sampling-software op de volgende positie om de microscoopfase naar de x- en y-coördinaten van elk bemonsteringsgebied in de referentiesectie te verplaatsen. Selecteer vervolgens Locatie en kies Invoegen om deze coördinaten te importeren in de TEM-seriesectiesoftware in de referentiesectie.
Herhaal dit voor alle coördinaten. Als u de coördinaten van de referentiesectie wilt spiegelen op de opzoeksectie, selecteert u Sectie en kiest u Ga naar sectie. Voer het nummer van de opzoeksectie in het dialoogvenster in.
Voor de registratie van de montages schakelt u tussen de referentie- en opzoeksectie, zoals eerder beschreven, en wijzigt u de positie op de referentiesectie met locatie en gaat u naar het nummer. Kies de volgende coördinaat in het dialoogvenster. Voor de SerialEM-montages gaat u bij elke sampling-coördinaat naar Bestand en kies nieuwe montage in het vervolgkeuzemenu.
Selecteer het juiste aantal tegels en het percentage overlappingen in het dialoogvenster. Voor deze studie is een vergroting van 5000 voldoende om de synaptische kenmerken van de studie te herkennen. Maar het beperkte gezichtsveld van de CCD-camera vereiste het maken van montages van twee door twee beelden.
De montages zijn gemaakt naar SerialEM. Voordat u elke montage opneemt, moet u de focus aanpassen of de optie autofocus in de opnamesoftware activeren. Kies de map om het montagebestand op te slaan en start de opname van de montage door op Start in het submenu montage te drukken, aan de linkerkant in SerialEM.
Start de microdissector en bepaal de grootte van het telframe en het aantal segmenten indien nodig. Tel de synapsdichtheid met behulp van de dissector macro. Met behulp van de multi-point tool gelegen in de werkbalk, beperken die synapsen die kruisen met de twee verboden lijnen van de dissector, maar tellen synapsen op de tegenovergestelde acceptatie lijnen.
Markeer elke synaps binnen het telkader dat zichtbaar is in de referentiesectie, maar niet zichtbaar is in de opzoeksectie, met een ovale selectie. Voor het meten van synapsparameters selecteert u alleen de synapsen met een synaptische gespleten georiënteerd in doorsnede die zich op het referentiegedeelte bevindt. Dit moet binnen dezelfde beeldframes worden gebruikt voor de dissector.
Ga vervolgens naar Plug-ins en start vervolgens de plug-in ObjectJ vanuit het vervolgkeuzemenu. Open een nieuw project vanuit het vervolgkeuzedialoogvenster objectJ, waarmee een venster wordt geopend waarmee de gebruiker structuren kan schetsen en markeren met het markeringsgereedschap. Gebruik eerst het markeringsgereedschap om de lengte van het presynaptische membraan en de lengte van de postsynaptische dichtheid te meten door een lijn langs de structuur te tekenen.
Verkrijg vervolgens de gemiddelde breedte van de synaptische gespleten door een veelhoek te tekenen, die zowel het pre- als postsynaptische membraan bedekt. Om het aantal gedokte blaasjes te bepalen, telt u alle blaasjes met een maximale afstand tot het presynaptische membraan van één vesiclediameter of minder. Bepaal vervolgens het aantal ongeveerde blaasjes door de blaasjes te tellen met een maximale afstand van één vesiclediameter van aangemeerde of andere ongedockde blaasjes op dezelfde synaps.
Een aangepaste versie van het protocol maakt elementaire analyses mogelijk op onbevooroordeelde locaties binnen het ultradunne gedeelte. Start hiervoor in de TEM-beeldmodus SerialEM en open een nieuw project. Open vervolgens de Navigator en controleer de instellingen voor de camera in camera- en scriptbesturingselementen voor weergave en opname en startweergave.
Als u een hoekkaart van het ultradunne gedeelte wilt maken, kiest u Punten toevoegen in het venster Navigator. Stel vervolgens de hoekpunten in aan de randen van een ultradun gedeelte. Verplaats het podium naar een hoekpunt door de rechtermuistoets ingedrukt te houden.
Wanneer een hoek van de sectie is bereikt, voegt u een hoekpunt toe met een linkermuisklik. Herhaal de procedure om nog drie hoekpunten toe te voegen. Zorg ervoor dat in het navigatorvenster vak C voor hoekpunten is aangevinkt voor de opgeslagen punten.
Als u de hoekmontage wilt starten, gaat u naar Navigator in de menubalk SerialEM en kiest u Montaging Grids en Setup Corner Montage in het vervolgkeuzemenu. Kies Veelhoek toevoegen in het venster Navigator en schets het interessegebied met meerdere klikken met de rechtermuisknop. Kies vervolgens Raster van punten toevoegen in het vervolgkeuzemenu Navigator en definieer een afstand tussen de punten.
Start het EFTEMSerialEM-script, volg de scriptopdrachten, voer het aantal rasterpunten in zoals weergegeven in de Navigator en voer het aantal acquisitiepunten in. Stel vervolgens de verlichtingsdrempel in, zodat het script rasterbalken kan vermijden. Volg de scriptopdrachten en verplaats het werkgebied handmatig om het gezichtsveld met een kwart van de rasterbalk te bedekken.
Voer volgens de weergegeven waarde een drempelwaarde in die hoger is dan de weergegeven waarde. Wacht tot de punten voor de verwerving zijn geselecteerd en de kookroutine is voltooid. Dit duurt lang en kan 's nachts worden gedaan.
Nadat u hebt ingesteld voor energiegefilterde TEM-elementaire analyse, verwerft u een elementaire kaart met elementspecifieke instellingen. De onbevooroordeelde bemonsteringsbenadering is nuttig voor het tellen en analyseren van synaptische functies in specifieke hersengebieden. Bovendien, de EFTEMSerialEM script voor de SerialEM software maakt het mogelijk om willekeurig te kiezen van de punten van verwerving uit een hele ultra dunne sectie, met als doel het verkrijgen van een energie-gefilterde elektronenmicrograaf op elk van deze punten.
Het script selecteerde willekeurig een aantal punten, vooraf gedefinieerd door de gebruiker uit die gemarkeerd met een indeling. Door het produceren van een testmicrograaf en het controleren van de rangniveaus, controleerde het script of de gekozen punten zich op een zichtbaar deel van de sectie bevonden, waarbij de punten die op rasterbalken zijn geland, werden afgewezen. Het grootste deel van de werkstroom werd behandeld door het script, met minimale interactie van de gebruiker.
Echter, met het monster hier getoond, was er te weinig licht voor de autofocus routine van SerialEM. Daarom, zodra het script verplaatst het stadium naar elk punt, de focus werd aangepast en een elementaire kaart werd gemaakt van ijzer. Het is belangrijk om de regio van belang zorgvuldig te selecteren en ervoor te zorgen dat hetzelfde aantal bemonsteringspunten in elk gebied van belang valt.
Vergeet niet dat veel van de chemische stoffen die worden gebruikt voor de bereiding van specimen giftig zijn. Dus draag een lab jas en beschermende handschoenen en werk onder een rookhoes.
We introduceren een nieuwe workflow voor elektronenmicroscopie onderzoek van hersenweefsel. De methode kan de gebruiker te onderzoeken van neuronale functies op onpartijdige wijze. Voor elementair-analyse presenteren wij ook een script dat de meeste van de workflow voor gerandomiseerde steekproeven automatizes.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved