Name: expression and purification of the human lipid-sensitive cation channel trpc3 for structural determination by single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE

G. Zhao und X. Meng danken wir für die Unterstützung bei der Erfassung der Daten auf die David Van Andel Advanced Cryo-Elektron Mikroskopie-Suite. Wir freuen uns über die VARI High-Performance-Computing-Team für computational Unterstützung. Wir geben unseren Dank an N. Clemente, D. Gebühren, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth und Z. Ruan für Kommentare, die diese Handschrift stark verbessert. Wir danken D. Nadziejka für redaktionelle Unterstützung für diese Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch interne VARI Finanzierung.

1. Umwandlung der DH10α zuständigen Zellen, Bacmid DNA zu produzieren
<ol><li>Das gen des Interesses zu synthetisieren und subclone es in eine überarbeitete Version des pEG-Vektors mit einem Zwilling Strep-Tag, ein His8-Tag und GFP mit ein Thrombin-Spaltstelle am N-Terminus (pFastBacI)-20.</li>
	<li>Kompetente Zellen zu verwandeln, indem man 5 ng Plasmid mit einem gewünschten gen in pFastBacI zu 50 μL der DH10α Zellen in einem 1,5 mL tube und inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Hitze Schoc...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Kumar, R., Thompson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+parathyroid+hormone+secretion+and+synthesis.">The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).</li><li>Sudhof, T. 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Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trp,+a+novel+mammalian+gene+family+essential+for+agonist-activated+capacitative+Ca2++entry.">trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry.</a> Cell. 85 (5), 661-671 (1996).</li><li>Itsuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensing+phosphatase+reveals+temporal+regulation+of+TRPC3/C6/C7+channels+by+membrane+phosphoinositides.">Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides.</a> Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+common+binding+sites+for+calmodulin+and+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+on+the+carboxyl+termini+of+trp+channels.">Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).</li><li>Gonzalez-Cobos, J. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li><li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination.">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frealign:+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM.">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li><li>Chen, V. 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Strukturaufklärung von Proteinen durch Cryo-EM revolutioniert den Bereich der Strukturbiologie in den letzten Jahren, dank der Entwicklung von neuen Kameras und Algorithmen, die erheblich beschleunigt die Strukturaufklärung von Proteinen, die nicht kristallisieren Sie leicht, besonders Membranproteine. Trotz aller Fortschritte in der Cryo-EM-Technik bleibt die Vorbereitung der gereinigten Proteine in Qualität und Quantität ausreichend qualitativ hochwertige Bildgebung oft Erleichterung zeitaufwendig, teuer und schwie...

Kalzium ist in die zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung Kaskaden, Transkription Kontrolle, Neurotransmitter-Freisetzung und Hormon-Molekül Synthese1,2,3beteiligt. Die homöostatische Wartung der cytosolischen freie Kalzium ist entscheidend für die Gesundheit und Funktion der Zellen. Einer der wichtigsten Mechanismen der intrazellulären Calcium-Homöostase ist Store betrieben Kalzium Eintrag (SOCE), ein Prozess, in dem gespeichert Erschöpfung des Kalziums in das endoplasmatische Retikulum (ER) löst die Öffnung von Ionenkanälen auf der Plasmamembran zu erleichtern, die Auffüllung der ER Kalzium, die dann in weiteren Signalisierung4,5,6verwendet werden kann. Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs), die Kalzium-durchlässige Kanäle, die TRP-Superfamilie angehören, wurden als einer der wichtigsten Teilnehmer SOCE7,8,9 identifiziert.
Unter den sieben Mitgliedern der Familie TRPC TRPC3, TRPC6 und TRPC7 bilden eine Untergruppe homolog, und sie sind einzigartig in der Fähigkeit von Lipid sekundäre Messenger Diacylglycerol (DAG), ein Abbauprodukt von Signalisierung Lipid aktiviert werden Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 drückt sich hoch, in glatten Muskulatur und in der zerebralen und zerebelläre Regionen des Gehirns, wo er entscheidende Rolle spielt bei der Signalisierung von Kalzium, die Neurotransmission und Neurogenese12,13auswirken. Dysfunktion des TRPC3 ist mit Störungen des zentralen Nervensystems, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bestimmten Krebsarten wie z. B. Eierstock Adenokarzinom14,15,16verbunden worden. Deshalb verspricht TRPC3 als pharmazeutische Ziel für die Behandlung dieser Krankheiten. Die Entwicklung gezielt Medikamente, die auf TRPC3 wurde durch einen Mangel an Verständnis für die molekulare Aktivierungsmechanismen, einschließlich Lipid Bindung Seiten17,18beschränkt. Wir haben die erste atomarer Auflösung Struktur des menschlichen TRPC3 Kanals (hTRPC3) und seine zwei Lipid-Bindungsstellen im geschlossenen Zustand berichtet, wichtige Einblicke in diese Mechanismen19.
Der entscheidende Faktor für die Bestimmung der Struktur eines Proteins Membran mit hoher Auflösung ist Protein von hoher Qualität zu erhalten. Die entsprechenden Screening von Ausdruck und Reinigung Bedingungen notwendig, hochwertiges Eiweiß zu erhalten kann ein Zeit- und kostenaufwendig Unterfangen sein. Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt im Detail wie ermitteln wir die optimalen Bedingungen für den Ausdruck und die Reinigung des hTRPC3, die in unseren ersten Screening schlecht benommen. Wir präsentieren einige wichtige Punkte zur Problembehandlung und optimieren die Protein-Verhalten, das eine solide Grundlage für unsere Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Studien geschaffen. Wir verwenden eine modifizierte Baculoviral Vektor (pEG), entwickelt von Gouaux und Kollegen, die optimiert ist für das screening-Assays und effiziente Erzeugung von Baculovirus in Säugerzellen20generieren. Dieser Ausdruck-Methode eignet sich für schnelle und kostengünstige Überexpression von Proteinen in der Säugetier-Zelle Membrane. Wir kombinieren die Verwendung dieses Vektors mit einem Fluoreszenz-Detektion Größe-Ausschluss Chromatographie-basierte (FSEC) prescreening Methode21. Diese Methode verwendet einen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tag verschmolzen, das Konstrukt von Interesse und verbessert die Visualisierung des Zielproteins in kleine, ganze Zelle solubilisiert Proben. Dies ermöglicht für das Screening der Proteinstabilität im Beisein von verschiedenen Wasch- und Zusatzstoffe, mit thermostabilizing Mutationen, und ermöglicht die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen aus kleinen transiente Transfektion. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Bedingungen rasch untersucht werden, bevor er zu einer groß angelegten Proteinreinigung. Nach Ausdruck, Screening und Reinigung präsentieren wir ein Protokoll für die Beschaffung und Verarbeitung von Bildern von Cryo-EM, eine de-Novo -Strukturaufklärung des Proteins zu generieren. Wir glauben, dass die hier beschriebenen Vorgehensweisen als verallgemeinerbare Protokoll für strukturelle Studien der TRP-Kanal-Rezeptoren und andere Membranproteine dienen werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEG BacMam vector (pFastBacI)</td>
			<td>addgene</td>
			<td>31488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10&#945; cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46003CR</td>
			<td>for transformation of DH10&#945; cells for Bacmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmam culture plates</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L5919</td>
			<td>for culture of transformed DH10&#945; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker for bacterial cells</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Multitron standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated orbital shaker for insect cells</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reach-in CO2 incubator for mammalian cells</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>3951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top orbital shaker</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SHKE416HP</td>
			<td>used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1535</td>
			<td>for bacterial plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>for plasmid extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593031</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12659017</td>
			<td>insect cells for producing virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12658-027</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10362100</td>
			<td>for transfecting insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>for transfecting mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mm syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>for filtering P1 virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mm filter flasks 500ml resevoir</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>for filtering P2 virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)</td>
			<td>Gene Mate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td>for culturing insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erlenmeyer culture flask (baffled 2L)</td>
			<td>Gene Mate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td>for culturing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>for determining DNA and protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td>mammalian cells for producing protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 expression Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1238-018</td>
			<td>mammalian cell media for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyric Acid Sodium Salt</td>
			<td>Acros</td>
			<td>263195000</td>
			<td>to amplify protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Acros</td>
			<td>215740500</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-100MG</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24125-16-4</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2671-250</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>300410</td>
			<td>detergent - to solubilize protein from membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792527</td>
			<td>to elute protein from resin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALON resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>for affinity purification by His-tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superose6 incease columns</td>
			<td>GE</td>
			<td>29091596; 29091597</td>
			<td>for HPLC and FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence Modular HPLC System</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>See Below</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller Module</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>CBM20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Delivery System</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>LC30AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Detector</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>RF20AXS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler with Cooling</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>SIL20ACHT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure FPLC System with Fractionator</td>
			<td>Akta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thrombin (alpha)</td>
			<td>Haematologic Technologies Incorporated</td>
			<td>HCT-0020 Human alpha</td>
			<td>for cleaving GFP tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>for concentrating protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E478500</td>
			<td>for stabilizing protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mesh carbon-coated copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>grids for negative stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3&#8201;&#956;m size/hole space, 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>grids for Cryo-EM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for preparing sample grids by liquid ethane freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Dura-Cyl</td>
			<td>UN1977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethane gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Model 950</td>
			<td>for cleaning grids before sample freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for negative stain EM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica electron microsocope</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for high-resolution Cryo-EM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gautomatch software</td>
			<td>http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td>
			<td></td>
			<td>to pick particles from micrographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion 2.1 software</td>
			<td>https://github.com/3dem/relion</td>
			<td></td>
			<td>to construct 2D and 3D classification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC software</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>to generate an initial structure model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frealign software</td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
			<td></td>
			<td>to refine particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot software</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
			<td></td>
			<td>to build a model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MolProbity software</td>
			<td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td>
			<td></td>
			<td>to evaluate the geometries of the atomic model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td>for automated serial image stack acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MortionCor2 software</td>
			<td>http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html</td>
			<td></td>
			<td>for motion correction of summed movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCTF software</td>
			<td>https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
			<td>for measuring defocus values in movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix.real_space_refine software</td>
			<td>https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html</td>
			<td></td>
			<td>for real space refinement of the initial 3D model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of the human lipid-sensitive cation channel trpc3 for structural determination by single-particle cryo-electron microscopy

Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs) der kanonischen TRP Unterfamilie sind obstructions kationen-Kanäle, die eine wichtige im Kalzium-Homöostase, insbesondere Shop betrieben Kalzium-Eintrag, ist entscheidend Rolle für die einwandfreie Funktion der Aufrechterhaltung synaptischen Vesikel Release und intrazellulären Signalwege. Dementsprechend waren TRPC Kanäle in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Störungen wie Herzhypertrophie, neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit und neurologische Störungen wie Spinozerebellare Ataxie verwickelt. Deshalb sind TRPC Kanäle ein potenzielles pharmakologische Ziel bei menschlichen Erkrankungen. Die molekularen Mechanismen der Anspritzung in diesen Kanälen sind jedoch noch unklar. Die Schwierigkeit bei der Beschaffung von großen Mengen an stabile, homogene und gereinigtes Protein wurde ein limitierender Faktor in Struktur Entschlossenheit Studien, insbesondere bei Säugetieren Membranproteine wie die TRPC Ionenkanäle. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den großen Ausdruck von Säugetieren Ionen-Kanal Membranproteinen Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie eine modifizierte Baculovirus-gen-Transfer-System und die Reinigung dieser Proteine durch. Weiter präsentieren wir ein Protokoll, Single-Teilchen Cryo-Elektron Mikroskopie Bilder von gereinigtes Protein zu sammeln und diese Bilder zu verwenden, um die Proteinstruktur zu bestimmen. Strukturaufklärung ist eine leistungsfähige Methode für das Verständnis der Mechanismen der gating und Funktion im Ionenkanäle.

Abbildung 1Azeigt einen schematischen Überblick über das Protokoll für die Expression und Reinigung des hTRPC3. Abbildung 1 bzeigt ein Bild der hTRPC3 Bacmid Platte mit idealer weiße Kolonien, ähnlich dem für Bacmid DNA-Reinigung, ausgewählt. Wir fanden, dass 48 h ideal für klare Bluo-gal-Färbung unter Beibehaltung der Präsenz der isolierten Kolonien. Höchstproduktion P2 Virus für hTRPC3, als visualisierte durch GFP F...

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Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Dieses Protokoll ermöglichte es uns, die Struktur des menschlichen TRPC3 zu lösen, ein Mitglied einer wichtigen, aber unterstudierten Familie von Ionenkanälen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Effizienz, mit der sie angewendet werden kann, um eine Vielzahl von Proteinen auszudrücken und zu reinigen, sowohl für strukturelle als auch funktionelle Studien. Diese Methode kann ein effizientes Proteinexpressions- und Reinigungssystem für die Untersuchung der Proteinbiochemie und Biophysik bieten und kann auf eine Vielzahl von Ionenkanälen und anderen Membranproteinen angewendet werden.Überprüfen Sie zunächst die relative Virusexpression, indem Sie die GFP-Fluoreszenz des Virus in einer Probe der Virusproduzierenden Kultur anzeigen. In einem verwirrten Boden Erlenmeyer Kulturkolben von ausreichender Größe, bereiten Sie ein wünschenswertes Volumen einer HEK293 Säugetierzellsuspensionskultur, bei einer Konzentration von 3,5 bis 3,8 Millionen Zellen pro Milliliter im Expressionsmedium, ergänzt mit 1%sterilen FBS. Fügen Sie 8% volumenmäßig der vorbereiteten P2-Virus-Stammlösung hinzu und in einem Orbital Shaker bei 37 Grad Celsius und 135 RPM zu brüten.Nach 12 bis 18 Stunden nach der Infektion 10 Millimolar-Natriumbutyrat hinzufügen, bei 30 Grad Celsius für die Zeit inkubieren, die für eine optimale Proteinexpression erforderlich ist. Danach zentrifugieren Sie bei 2, 880 mal Schwerkraft für 20 Minuten, um die Zellen zu ernten. Waschen und suspendieren Sie die Zellen in etwa 100 Milliliter TBS pro Liter der geernteten Zellen.Zentrifugieren Sie wieder bei 2, 880 mal Schwerkraft für 20 Minuten und sammeln Sie das Zellpellet. Sammeln Sie auch kleine, ein Milliliter Zellpellet Ernten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und löslich für zwei Stunden bei vier Grad Celsius mit Aufregung in Gegenwart von verschiedenen Reinigungsmitteln und /oder Additiven. Klären Sie diese kleinen, solubilisierten Proben durch Ultrazentrifugation bei 235.000-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Führen Sie sie dann als 30-Mikroliter-Proben auf einer SEC-Chromatographie-Säule aus, um die beste Zeit für die Expression und die besten Löslichkeitsbedingungen zu bestimmen. Das Pellet in 100 Milliliter Puffer pro Liter geernteter Zellen auftauen. Sobald die Zellen aufgetaut sind, Pipette oder rühren Sie sie, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist.Lassen Sie die Zellen bei vier Grad Celsius in einem Becher in Eis getaucht für zwei Stunden, während von einem Rührstab gerührt. Als nächstes entfernen Sie alle Zellablagerungen durch Ultrazentrifugation bei 235.000-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Führen Sie eine 30-Mikroliter-Probe des Überstandes auf einer SCC-Säule per HPLC aus, um die Proteinmenge zu verifizieren und das Zielprotein durch GFB-Signalausgang zu visualisieren.Tragen Sie den kobaltaffinen Harz gebundenen Überstand, der das lösliche Protein enthält, auf eine Gravitationssäule auf und sammeln Sie den Durchfluss. Führen Sie eine 30-Mikroliter-Probe des Durchflusses auf einer SCC-Säule durch, um zu überprüfen, ob das Protein an das Harz gebunden ist. Dann waschen Sie das Harz mit 10 SäulenVolumen Puffer.Führen Sie eine 30-Mikroliter-Probe der Wäsche auf einer SCC-Säule durch, um den Proteinverlust zu überprüfen. Mit Puffer, elute das Harz gebunden menschlichen TRPC3. Führen Sie eine 90-Mikroliter-Probe des Eluants, das einbis 100 auf einer SSC-Säule verdünnt wurde, aus, um zu überprüfen, ob das Protein eluiert wurde, und um das Vorhandensein eines GFP-Signals an der Position zu überprüfen, die der Zielproteingröße entspricht.Fügen Sie Thrombin mit einem Verhältnis von 1 bis 20 Mol hinzu und fügen Sie der eluierten Probe 10 Millimolaren EDTA hinzu. Drei Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Danach das Eluant in ein 15 Milliliter Zentrifugalfilterrohr übertragen.Drehen Sie das Rohr bei 2, 800-mal Schwerkraft und bei vier Grad Celsius in fünf Minuten Schritten, um das Eluant auf 500 Mikroliter oder weniger zu konzentrieren. Pipette die Proteinlösung nach oben und unten zwischen Spins, um das Protein wieder auszusetzen und eine Überkonzentration zu verhindern. Laden Sie das Konzentrat im Puffer auf eine SSC-Säule.Führen Sie eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie durch und sammeln Sie 300 Mikroliter-Fraktionen. Kombinieren Sie dann die Spitzenfraktionen, die den TRPC3-Tetramer enthalten, wie durch das UV-Absorptionssignal visualisiert. Und konzentrieren Sie sich wieder auf eine Endkonzentration von mindestens fünf Milligramm pro Milliliter.Der menschliche TRPC3 ist eine ganze Zelllösung, die in einer Vielzahl von Waschmitteln mit einer kritischen Micelle-Konzentration von 0,01 bis 20 Mikromolaren so limbilisiert ist, und wurde in einem DDM/CHS-haltigen Puffer ausgeführt. Obwohl DDM/CHS die höchste Löslichkeit des menschlichen TRPC3 zeigt, erscheint die Spitzenposition zu groß, um der tetramere menschliche TRPC3 zu sein. Nach der Löslichkeit ganzer Zellen wird der Zelllyseabfall entfernt und das gelöste Protein auf eine SSC-Säule geladen und auf HPLC in DDM/CHS-Waschmittel mit Puffer ausgeführt, um die absolute Löslichkeit und das Spitzenvolumen des menschlichen TRPC3 unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zu einer TRPM4-Kontrolle zu vergleichen.Alle verschiedenen waschmittellöslichen TRPC3-Proben weisen Spitzenpositionen um 11,9 Milliliter auf, was wahrscheinlich zu groß ist, da die tetramere Form des menschlichen TRPC3 ein geringeres Molekulargewicht hat als die positive menschliche Kontrolle TRPM4. Anschließend werden zwei verschiedene Löslichkeits- und Laufpuffer getestet, die DDM/CHS und Digitonin enthalten. Der Proteinlauf im Puffer, der Digitonin enthält, liefert den höchsten Peak in einer vernünftigen Position relativ zur Positivkontrolle.Während eine kleine Reinigung mit 25 Millilitern Zellen mehrere breite Spitzen aufweist, zeigt das Protein Merkmale eines einzelnen tetramerischen menschlichen TRPC3-Kanals in 2D-Klassifikation durch Negativfleck. Additive werden dann auf der Grundlage des physiologischen Charakters des menschlichen TRPC3 gescreent. EDTA zeigt einen bemerkenswerten Einfluss auf die Stabilisierung des menschlichen TRPC3 in einer intakten tetramerischen Spitzenposition und hat die Anzahl der Partikel im Kryo-EM-Mikrographen signifikant erhöht und das Rauschen im Hintergrund verringert.Die Qualität der Endergebnisse hängt von einer guten Fehlerbehebung der FSCC-Profile auf HPLC ab. Und nach Abschluss aller Reinigungsschritte schnell, idealerweise an einem einzigen Tag. Nach diesem Eingriff können Strukturelle Bestimmung, Antikörpererzeugung und funktionelle Studien wie Bindungstests oder Elektrophysiologie durchgeführt werden.Diese Technik kann und wurde angepasst, um andere Ionenkanäle und Proteinfamilien zu untersuchen und gereinigte Proteine für Anwendungen jenseits der strukturellen Bestimmung zu produzieren. Es sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen für die Bewirtschaftung von Zellkulturbiogefahren getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten in einer laminaren Strömungshaube, das Tragen von Schutzkleidung und die ordnungsgemäße Entsorgung von Abfällen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extraktion modifizierter Mikrotubuli aus Säugetierzellen zur Untersuchung von Mikrotubuli-Protein-Komplexen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...