Name: expression and purification of the human lipid-sensitive cation channel trpc3 for structural determination by single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE

אנו מודים ג'י זאו, אקס מנג לתמיכה באיסוף נתונים ב דוד ואן אנדל מתקדם הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ Suite. אנו מעריכים את הקבוצה VARI מחשוב עם ביצועים גבוהים עבור תמיכה חישובית. אנחנו נותנים את הכרת התודה שלנו כדי ש קלמנטה, דמי ד, ג' Floramo, הואנג י', י' קים, מולר ג, רוט נולד ב ו צ Ruan עבור הערות השתפרה מאוד כתב היד הזה. אנו מודים Nadziejka ד על העריכה תמיכה כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי VARI פנימי מימון.

1. שינוי של תאים המוסמכת DH10α כדי לייצר Bacmid דנ א
<ol><li>לסנתז את הגן עניין, subclone אותו לתוך גרסה מותאמת של וקטור פג המכיל טווין דלקת-תג, תג His8 וכן GFP עם אתר המחשוף תרומבין בקו ה N טרמינוס (pFastBacI)20.</li>
	<li>להפוך תאים המוסמכת על-ידי הוספת 5 ננוגרם של פלסמיד המכיל גנים הרצוי ב- pFastBacI כדי μL 50 של...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Kumar, R., Thompson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+parathyroid+hormone+secretion+and+synthesis.">The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+neurotransmitter+release.">Calcium control of neurotransmitter release.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).</li><li>Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TRPC+Channels+in+Store-Operated+Calcium+Entry.">Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).</li><li>Smyth, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+store-operated+calcium+entry.">Activation and regulation of store-operated calcium entry.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).</li><li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-Operated+Calcium+Channels.">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li><li>Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC1+is+required+for+functional+store-operated+Ca2++channels.+Role+of+acidic+amino+acid+residues+in+the+S5-S6+region.">TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).</li><li>Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activated+Ca2++influx+via+human+Trp3+stably+expressed+in+human+embryonic+kidney+(HEK)293+cells.+Evidence+for+a+non-capacitative+Ca2++entry.">Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trp,+a+novel+mammalian+gene+family+essential+for+agonist-activated+capacitative+Ca2++entry.">trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry.</a> Cell. 85 (5), 661-671 (1996).</li><li>Itsuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensing+phosphatase+reveals+temporal+regulation+of+TRPC3/C6/C7+channels+by+membrane+phosphoinositides.">Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides.</a> Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+common+binding+sites+for+calmodulin+and+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+on+the+carboxyl+termini+of+trp+channels.">Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).</li><li>Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+in+smooth+muscle+cells.">TRPC channels in smooth muscle cells.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).</li><li>Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+TRPC3-dependent+cation+current+through+the+neurotrophin+BDNF).">Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF).</a> Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).</li><li>Becker, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+screening+of+the+TRPC3+gene+in+cerebellar+ataxia.">Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia.</a> Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).</li><li>Kitajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC3+positively+regulates+reactive+oxygen+species+driving+maladaptive+cardiac+remodeling.">TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling.</a> Scientific Reports. 6, 37001 (2016).</li><li>Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+receptor+potential+channel+C3+contributes+to+the+progression+of+human+ovarian+cancer.">Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer.</a> Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+receptor+potential+cation+3+channel+regulates+melanoma+proliferation+and+migration.">Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration.</a> Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).</li><li>Xia, M., Liu, D., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC3:+A+New+Target+for+Therapeutic+Strategies+in+Chronic+Pain-DAG-mediated+Activation+of+Non-selective+Cation+Currents+and+Chronic+Pain+(Mol+Pain+2014;10:43).">TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43).</a> Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).</li><li>Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+lipid-gated+cation+channel+TRPC3.">Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3.</a> Elife. 7, e36852 (2018).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+to+identify+membrane+protein+expression+and+crystallization+conditions.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions.</a> Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gctf:+Real-time+CTF+determination+and+correction.">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frealign:+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM.">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li><li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination.">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frealign:+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM.">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Green, E. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization,+Expression,+Purification,+and+Crystallization+of+the+Human+Serotonin+Transporter+Bound+to+S-citalopram.">Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).</li><li>Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+from+the+source:+endogenous+preparations+of+molecular+machines.">Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).</li><li>Bayburt, T. H., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Protein+Assembly+into+Nanodiscs.">Membrane Protein Assembly into Nanodiscs.</a> FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).</li><li>Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., L&#252;, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-microscopy+structure+of+a+human+TRPM4+channel.">Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel.</a> Nature. 552, 200-204 (2017).</li><li>Autzen, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc.">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359 (6372), 228-232 (2017).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+calcium-activated,+non-selective+cation+channel+TRPM4.">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+purification+of+ABC+(ATP-binding-cassette)+transporters.">Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters.</a> Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).</li></ol>

קביעת מבנה של חלבונים על ידי הקפאה-EM יש מהפכה בתחום ביולוגיה מבנית בשנים האחרונות, בזכות הפיתוח של מצלמות חדשות ואלגוריתמים המזרזת באופן משמעותי את קביעת מבנה של חלבונים שאינם ברצון crystalize, במיוחד קרום חלבונים. למרות כל התפתחויות אחרונות טכניקת הקפאה-EM, הכנת מספקות איכות וכמות מטוהרים חלב?...

סידן מעורב תהליכים תאיים ביותר כולל איתות אשדים, בקרת שעתוק, שחרור נוירוטרנסמיטר והורמון מולקולה סינתזה1,2,3. קיום cytosolic סידן חינם homeostatic חיוני הבריאות והתפקוד של תאים. אחד המנגנונים העיקריים של הומאוסטזיס סידן תאיים הוא סידן המופעלים באמצעות החנות כניסה (SOCE), תהליך שבו דלדול של הסידן מאוחסנים הגורמים המפעילים (ER) רשתית תוך-פלזמית פתיחת תעלות היונים על קרום פלזמה כדי להקל חידוש מלאי של מיון סידן, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עוד איתות4,5,6. קולטן ארעי פוטנציאליים ערוצים (TRPCs), אשר ערוצי סידן-חדיר השייכים superfamily TRP, זוהו כמשתתף העיקריים ב- SOCE-7,-8,-9 .
בין חברי שבע ממשפחת TRPC, TRPC3, TRPC6 ו- TRPC7 ליצור קבוצת homologue, והם ייחודי ביכולת להיות מופעל על ידי השומנים שליח משני diacylglycerol (DAG), תוצר השפלה של השומנים איתות phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 מתבטאת מאוד שריר חלק, האזורים במוח, אסטרוציטומה של המוח, שבו היא משחקת תפקידים חיוניים ב סידן איתות להשפיע12,עצבית ו נוירוג'נסיס13. תפקוד לקוי של TRPC3 נקשר במערכת העצבים המרכזית, מחלות לב וכלי דם, סרטן מסוימים כגון אדנוקרצינומה השחלות14,15,16. לכן, TRPC3 טומן בחובו הבטחה כמטרה תרופות לטיפול במחלות אלה. הפיתוח של תרופות ממוקדות במיוחד על TRPC3 היה מוגבל בשל חוסר ההבנה של מנגנונים הפעלה המולקולרי שלה, כולל השומנים איגוד אתרי17,18. אנחנו מדווחים על המבנה האטומי ברזולוציה הראשון של הערוץ TRPC3 האנושית (hTRPC3) ואתרי שלה מחייב ליפיד שתי במצב סגור, לספק תובנות חשובות אלה מנגנונים19.
גורם מפתח לקביעת המבנה של חלבון ממברנה ברזולוציה גבוהה הוא לקבל חלבון באיכות גבוהה. ההקרנה המתאימים של ביטוי וטיהור התנאים הדרושים לקבל חלבון איכותי יכול להיות מאמץ זמן רב ויקרות. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתארת בפירוט כיצד אנו מזהים את תנאים אופטימליים כדי להפוך את הביטוי טיהור של hTRPC3, אשר התנהגה בצורה עלובה ההקרנה הראשונית שלנו. אנו מציגים מספר נקודות מפתח כיצד לפתור בעיות ולמטב את ההתנהגות חלבון, אשר בסיס יציב שלנו הקפאה-האלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) מחקרים. אנו משתמשים baculoviral שונה של יצירת וקטור (pEG), שפותחה על ידי Gouaux ועמיתיו, אשר ממוטב עבור הקרנה מבחני והפקת יעיל baculovirus תאים בתרבית של20. שיטה זו ביטוי מתאים ביטוי מהירה וחסכונית של חלבונים קרום התא יונקים. אנו משלבים את השימוש הזה וקטור עם זריחה-זיהוי גודל-הדרה מבוססי וואקום (FSEC) prescreening שיטת21. שיטה זו משתמשת תג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) דבוקה הבונה של עניין ומשפר ויזואליזציה של החלבון היעד בדגימות solubilized קטן, כל תא. זה מאפשר להקרנה של חלבון יציבות בנוכחות חומרי ניקוי שונים, תוספים, עם מוטציות thermostabilizing, והוא מאפשר השימוש של מספר קטן של תאים תקנים ארעי בקנה מידה קטן. בדרך זו, מספר רב של מצבים יכולים להיות במהירות מוקרן לפני שעבר הוא לטיהור חלבון בקנה מידה גדול. בעקבות הביטוי, סינון, טיהור, אנו מציגים פרוטוקול קבלת ועיבוד תמונות מהקפאה-EM כדי להפיק את נחישות דה נובו מבנית של החלבון. אנו מאמינים כי הגישות המתוארות כאן ישמש פרוטוקול להכליל ללימודי מבנית של קולטנים ערוץ TRP וחלבונים אחרים ממברנה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEG BacMam vector (pFastBacI)</td>
			<td>addgene</td>
			<td>31488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10&#945; cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46003CR</td>
			<td>for transformation of DH10&#945; cells for Bacmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmam culture plates</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L5919</td>
			<td>for culture of transformed DH10&#945; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker for bacterial cells</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Multitron standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated orbital shaker for insect cells</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reach-in CO2 incubator for mammalian cells</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>3951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top orbital shaker</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SHKE416HP</td>
			<td>used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1535</td>
			<td>for bacterial plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>for plasmid extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593031</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12659017</td>
			<td>insect cells for producing virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12658-027</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10362100</td>
			<td>for transfecting insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td>for transfecting mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mm syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>for filtering P1 virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mm filter flasks 500ml resevoir</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>for filtering P2 virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)</td>
			<td>Gene Mate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td>for culturing insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erlenmeyer culture flask (baffled 2L)</td>
			<td>Gene Mate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td>for culturing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>for determining DNA and protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td>mammalian cells for producing protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 expression Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1238-018</td>
			<td>mammalian cell media for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyric Acid Sodium Salt</td>
			<td>Acros</td>
			<td>263195000</td>
			<td>to amplify protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Acros</td>
			<td>215740500</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-100MG</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24125-16-4</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2671-250</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>300410</td>
			<td>detergent - to solubilize protein from membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792527</td>
			<td>to elute protein from resin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALON resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>for affinity purification by His-tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superose6 incease columns</td>
			<td>GE</td>
			<td>29091596; 29091597</td>
			<td>for HPLC and FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence Modular HPLC System</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>See Below</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller Module</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>CBM20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Delivery System</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>LC30AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Detector</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>RF20AXS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler with Cooling</td>
			<td>&#34;</td>
			<td>SIL20ACHT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure FPLC System with Fractionator</td>
			<td>Akta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thrombin (alpha)</td>
			<td>Haematologic Technologies Incorporated</td>
			<td>HCT-0020 Human alpha</td>
			<td>for cleaving GFP tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>for concentrating protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E478500</td>
			<td>for stabilizing protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mesh carbon-coated copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>grids for negative stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3&#8201;&#956;m size/hole space, 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>grids for Cryo-EM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for preparing sample grids by liquid ethane freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Dura-Cyl</td>
			<td>UN1977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethane gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Model 950</td>
			<td>for cleaning grids before sample freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for negative stain EM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica electron microsocope</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>for high-resolution Cryo-EM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gautomatch software</td>
			<td>http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td>
			<td></td>
			<td>to pick particles from micrographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion 2.1 software</td>
			<td>https://github.com/3dem/relion</td>
			<td></td>
			<td>to construct 2D and 3D classification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC software</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>to generate an initial structure model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frealign software</td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
			<td></td>
			<td>to refine particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot software</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
			<td></td>
			<td>to build a model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MolProbity software</td>
			<td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td>
			<td></td>
			<td>to evaluate the geometries of the atomic model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td>for automated serial image stack acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MortionCor2 software</td>
			<td>http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html</td>
			<td></td>
			<td>for motion correction of summed movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCTF software</td>
			<td>https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
			<td>for measuring defocus values in movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix.real_space_refine software</td>
			<td>https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html</td>
			<td></td>
			<td>for real space refinement of the initial 3D model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of the human lipid-sensitive cation channel trpc3 for structural determination by single-particle cryo-electron microscopy

ערוצי פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPCs) תת TRP הקנוני הם ערוצים הקטיון nonselective לשחק תפקיד חיוני הומאוסטזיס סידן, ערך סידן במיוחד המופעלים על החנות, אשר חיוני לשמירה על תפקוד תקין של שלפוחית סינפטית שחרור, תאיים איתות המסלולים. בהתאם לכך, ערוצי TRPC היו מעורבים במגוון רחב של מחלות האדם כולל מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה, הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון, הפרעות רגשיות ונוירולוגיות כגון אטקסיה spinocerebellar. לכן, ערוצי TRPC מייצגים יעד פוטנציאליים תרופתי למחלות אנושיות. עם זאת, המנגנון המולקולרי של gating בערוצים אלה עדיין אינם ברורים. הקושי בהשגת כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, הומוגני ויציב כבר גורם מגביל במחקרים נחישות מבנה, במיוחד עבור ממברנה יונקים חלבונים כגון תעלות היונים TRPC. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי בקנה מידה גדול של יון בתרבית של ערוץ קרום חלבונים באמצעות מערכת העברת הגן ששונה baculovirus ולטיהור חלבונים אלה על-ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. בהמשך נציג פרוטוקול כדי לאסוף יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ תמונות של חלבון מטוהרים וכדי להשתמש בתמונות אלה כדי לקבוע את מבנה החלבון. מכשור לקביעת קשיות ומבנה היא שיטה עוצמה להבנת המנגנונים של gating ותפקוד בתוך תעלות יונים.

סקירה סכמטי של הפרוטוקול עבור הביטוי ולטיהור hTRPC3 מוצג איור 1A. תמונה של hTRPC3 bacmid לצלחת עם מושבות לבן אידיאלי, הדומה זה שנבחר עבור טיהור DNA bacmid, מוצג איור 1B. . מצאנו שאת 48 שעות הוא אידיאלי עבור Bluo-גל ברור מכתים תוך שמירה על הנוכחות של מושבות המבו?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

פרוטוקול זה איפשר לנו לפתור את המבנה של TRPC3 האנושי, חבר במשפחה חשובה, אך understudied של ערוצי יון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היעילות הגבוהה שבה ניתן ליישם אותה כדי לבטא ולטהר מגוון חלבונים, הן למחקרים מבניים והן למחקרים פונקציונליים. שיטה זו יכולה לספק ביטוי חלבון יעיל מערכת טיהור, לשימוש בחקר ביוכימיה של חלבון ביופיזיקה והוא יכול להיות מיושם על מגוון רחב של ערוצי יונים וחלבוני קרום אחרים.ראשית, בדוק את ביטוי הנגיף היחסי על ידי הצגת פלואורסצנטיות GFP של הנגיף בדגימה של תרבות ייצור הנגיף. בבקבוק תרבות ארלנפייר נמוך ומבולבל בגודל מספיק, הכינו נפח רצוי של תרבות מתלים של תאי יונקים HEK293, בריכוז של 3.5 עד 3.8 מיליון תאים למיליליטר במדיום הביטוי, בתוספת FBS סטרילי של 1%. הוסף 8% לפי נפח של פתרון מלאי וירוס P2 מוכן דגירה שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס ו 135 סל"ד.ב 12 עד 18 שעות לאחר ההדבקה להוסיף 10 מילימולר נתרן butyrate, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך הזמן הדרוש לביטוי חלבון אופטימלי. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2, 880 פעמים כבידה במשך 20 דקות כדי לקצור את התאים. לשטוף ו resuspend התאים בערך 100 מיליליטר של TBS לליטר של תאים שנקטפו.צנטריפוגה שוב ב 2, 880 פעמים כבידה במשך 20 דקות ולאסוף את גלולת התא. גם לאסוף קטן, כדורי תא אחד מיליליטר יבולים בנקודות זמן שונות מתבודד במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה בנוכחות חומרי ניקוי שונים ו / או תוספים. להבהיר אלה דגימות מנוכלות תאים שלמים קטנים על ידי אולטרהצנטריות ב 235, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר מכן, הפעל אותם כ-30 דגימות מיקרוליטר בעמודת כרומטוגרפיה של SEC, כדי לקבוע את הזמן הטוב ביותר לביטוי ואת תנאי המיסות הטובים ביותר. להפשיר את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ לליטר של תאים שנקטפו. לאחר התאים מופשרים, פיפטה או מערבבים אותם כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני.תן לתאים להתבודד בארבע מעלות צלזיוס בפקעת שקועה בקרח במשך שעתיים תוך ערבוב על ידי בר ערבוב. לאחר מכן, להסיר את כל פסולת התא על ידי אולטרהצנטריפוגה ב 235, 000 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הפעל דגימת 30 מיקרוליטר של העל-טבעי בעמודת SCC של HPLC כדי לאמת את כמות החלבון ולהמחיש את חלבון היעד באמצעות פלט אות GFB.החל את שרפי זיקה קובלט קשור על טבעי המכיל את החלבון מנוכר על עמוד הכבידה ולאסוף את הזרימה דרך. הפעל מדגם 30 microliter של זרימה דרך על עמודת SCC כדי לוודא החלבון מחייב את רשף. לאחר מכן, לשטוף את וסף עם 10 כרכים עמודה של מאגר.הפעל מדגם 30 microliter של לשטוף על עמודת SCC כדי לבדוק אובדן חלבון. באמצעות מאגר, להשתיק את שרף מאוגד TRPC3 האנושי. הפעל מדגם 90 microliter של eluant כי כבר מדולל אחד עד 100 על עמודת SSC כדי לבדוק כי החלבון כבר eluted ולאמת את נוכחותו של אות GFP במיקום המתאים לגודל חלבון היעד.מוסיפים את טרומבין ביחס של 1 עד 20 טוחנות ומוסיפים 10 מילימולרים של EDTA לדגימה האלוטה. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר מכן, להעביר את eluant לצינור מסנן צנטריפוגלי 15 מיליליטר.סובב את הצינור בכבידה של פי 2, 800 וב-4 מעלות צלזיוס במרווחים של חמש דקות כדי לרכז את האלונט ל-500 מיקרוליטרים או פחות. פיפטה פתרון החלבון למעלה ולמטה בין ספינים כדי resuspend החלבון ולמנוע ריכוז יתר. טען את הריכוז בעמודת SSC במאגר.הפעל כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר ולאסוף 300 שברי microliter. לאחר מכן, שלב את שברי השיא המכילים את הטטרמר TRPC3 כפי שהודמיין על ידי אות ספיגת UV. ולהתרכז שוב לריכוז סופי של לפחות חמישה מיליגרם למיליליטר.TRPC3 האנושי הוא תא שלם מנושל במגוון של חומרי ניקוי עם ריכוז micelle קריטי של 0.01 כדי 20 micromolars, ו נוהלה במאגר DDM / CHS המכיל. למרות DDM / CHS מראה את המבודדות הגבוהה ביותר של TRPC3 האנושי, מיקום השיא נראה גדול מדי כדי להיות TRPC3 האנושי tetrameric. לאחר מסיסות תאים שלמים פסולת תמיסת התא מוסרת ואת החלבון מסיס נטען על עמודת SSC ולהפעיל על HPLC ב DDM / CHS דטרגנט המכיל חיץ, כדי להשוות את המסיסות המוחלטת ואת נפח השיא של TRPC3 אנושי בתנאים שונים יחסית לבקרת TRPM4.כל דגימות TRPC3 מנושל דטרגנט שונים להראות עמדות שיא סביב 11.9 מיליליטר אשר סביר גדול מדי כי הצורה tetrameric של TRPC3 אנושי יש משקל מולקולרי קטן יותר מאשר TRPM4 שליטה אנושית חיובית. שני מאגרי מינון והפעלה שונים המכילים DDM/CHS ודיגיטונין נבדקים לאחר מכן. החלבון פועל במאגר המכיל דיגיטונין מניב את הפסגה הגבוהה ביותר במיקום סביר יחסית לשליטה החיובית.בעוד טיהור בקנה מידה קטן באמצעות 25 מיליליטר של תאים מראה כמה פסגות רחבות, החלבון מראה תכונות של ערוץ TRPC3 אנושי tetrameric יחיד בסיווג 2D על ידי כתם שלילי. תוספים מוקרנים לאחר מכן בהתבסס על האופי הפיזיולוגי של TRPC3 האנושי. EDTA מראה השפעה יוצאת דופן על ייצוב TRPC3 האנושי במצב שיא tetrameric שלם והגדיל באופן משמעותי את מספר החלקיקים במיקרוגרף cryo-EM והפחית את הרעש ברקע.איכות התוצאות הסופיות תלויה בפתרון בעיות טוב של פרופילי FSCC ב- HPLC. ועל השלמת כל צעדי הטיהור במהירות, באופן אידיאלי ביום אחד. נחישות מבנית, ייצור נוגדנים, מחקרים פונקציונליים כגון, בדיקות מחייבות או אלקטרופיזיולוגיה יכול להתבצע לאחר הליך זה.טכניקה זו יכולה והותאמה לחקר תעלות יון ומשפחות חלבון אחרות ולייצר חלבונים מטוהרים ליישומים מעבר לנחישות מבנית. יש לנקוט באמצעי הזהירות המתאימים לניהול biohazards של תרבות התאים כגון עבודה במכסה המנוע של זרימה למינארית, לבישת ביגוד מגן, סילוק נכון של פסולת.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...