Name: analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00
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这项工作得到了 "德意志论坛" sfb 854/tp11 至 k. d. f 的赠款。

根据马格德堡 ovgu 大学医学院医学院的所有准则, 所有涉及使用动物的实验都已得到德国萨克森-安哈勒 (萨克森-安哈尔特) 的批准。
1. mzb 细胞纯化
<ol><li>
分离白细胞。
	<ol>
<li>牺牲8到16周龄的老鼠, 切除脾脏16。将脾脏分解为5毫升的冰凉细胞缓冲液 [磷酸盐缓冲盐水 (pbs) + 0.5% 无脂肪酸的牛血清白蛋白 (bsa)], 方法是使用组织分离器或将脾脏轻轻?...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged.">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li><li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1,+ICAM-2,+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest,+polarization,+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium.">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li><li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration.">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li><li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces.">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone.">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li><li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li><li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+way+out:+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li><li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginal+zone+B+cells:+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes.">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li><li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling.">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).</li><li>ImageJ. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018)</li><li>. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018)</li><li>. Chemotaxis and Migration Tool Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018)</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>. Manual Tracking Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018)</li><li>. ibidi Pump System Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html</a> (2018)</li></ol>

我们在这里描述了一种方法来分析细胞的迁移, 检测剪切流的力量, 并通过改变它们的迁移来响应。对 mzb 的分析表明, mzb 在 icam-1 上自发迁移, 在流动的情况下, 会向上迁移流动。在前面的工作中, 我们展示了 mzb 不会在 vcam-1 上向上迁移流, 而是保持固定在适当的位置。小鼠脾边缘区主要含有 icam-1, 而红浆中含有 icam-1 和 vcam-1。从这些数据中可以推断, mzb 会在边缘区向上迁移流动, 但不会在红色纸浆...

免疫细胞是人体中运动最强的细胞, 往往必须与血液和淋巴流动的剪切力抗衡。然而, 关于白细胞1、2、3、4、5的剪切力诱导迁移的研究相对较少。我们在这里提出了一个可靠的定量协议, 以分析免疫细胞在体外流动的反应。执行检测不需要制造组件, 所有设备和耗材均可在市场上获得。该协议, 包括细胞纯化和迁移分析, 可以在一天内完成。最后, 尽管我们描述了边缘区 b 细胞 (mzb) 的迁移, 但该协议可以用来分析其他类型免疫细胞的迁移。因此, 使用该方法系统地分析广泛的白细胞, 并对其进行全面的条件分析是可行的。
mzb 是 b 细胞的群体, 在小鼠体内, 仅存在于毛囊内部和边缘区 6、7、8、9之间的脾脏和穿梭。边缘区域是一层大约5-10 个厚的免疫细胞。细胞层包裹毛囊, 主要由 mzb 和巨噬细胞组成, 但也包括不变的自然杀手 t (inkt) 细胞、树突状细胞 (dc) 和中性粒细胞等10。边缘区域的细胞暴露在来自脾动脉的单向血流中, 这些血流终止于卵泡周围的边缘窦。血液从边缘窦的洞中通过边缘区域流动, 然后收集在红色果肉中的静脉窦, 并恢复到循环11。血液的自由流动在 mzb 上冲走, 使它们暴露在血液中携带的抗原中。mzb 通过在边缘区域和毛囊内部之间自动穿梭, 将抗原带入毛囊, 而毛囊不受血液影响。因此, 当 mzb 向毛囊穿梭时, 它们必须迁移血流12的剪切力 (图 1a).
在这个协议中, 我们描述了如何定量地确定免疫细胞 (如 mzb) 在体外对无流动或高流量的反应, 以揭示它们是如何被编程在体内迁移的。在第一步中, mzb 从老鼠脾脏中纯化, 使用磁珠与市售试剂盒中的抗体结合。新隔离的 mzb 被引入流动室滑块的井中, 允许安装在整合素配体上, 并使用泵系统暴露在迁移缓冲流中 (图 2 a)。这些细胞是使用延时视频显微镜系统成像的。然后使用免费的 imagej 插件 mtrack2 13, 14对图像进行分析, 以自动跟踪细胞。然后, 可以使用免费的 ibidi 趋化工具15对轨迹进行量化, 以确定各种参数, 包括速度、直线度和迁移指数。这些值可用于确定迁移抑制剂、细胞刺激器、趋化因子和其他影响迁移的化学品对剪切流诱导迁移的影响, 以了解控制体内免疫细胞运动的力量。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZB and FOB cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21 / CD 35, clone 7G6, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23, clone B3B4, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS 1x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA albumin fraction V, fatty acid-free</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#34;0052.3&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro

边缘区 b 细胞 (mzb) 是一种 b 细胞的群体, 它们位于包裹毛囊的小鼠脾边缘区。要到达毛囊, mzb 必须迁移血液流动的剪切力。本文提出了一种分析这种流动诱导的 mzb 体外迁移的方法。首先, mzb 从小鼠脾脏中分离出来。其次, mzb 在流动室滑块中的整合素配体上进行了确定, 暴露在剪切流中, 并在迁移过程中在显微镜下成像。第三, 迁移 mzb 的图像使用 imagej 的 mtrack2 自动单元跟踪插件进行处理, 并使用 ibidi 趋化工具对生成的单元跟踪进行量化。迁移数据揭示了细胞移动的速度、它们改变方向的频率、剪切流矢量是否影响其迁移方向以及涉及哪些整合素配体。虽然我们使用 mzb, 该方法可以很容易地适应分析任何白细胞的迁移, 响应剪切流的力量。

我们使用上面概述的协议比较了 mzb 在 icam-1 涂层幻灯片上的迁移, 没有流动 (0 dyn/cm2), 暴露在剪切流 (4 dyncm2) 中。使用 mtrack2 自动跟踪细胞, 并在无流动 (0 dyn/2) 和 (4 dyn/cm 2) 的细胞迁移电影上覆盖生成的轨道文件, 以显示轨道的分布和形状 (图 4a)。然后将单元轨道导入到 ibidi 趋化工具 (ict) 中, 以生成每部电影的跟踪情...

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Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

边缘区 b 细胞 (mzb) 通过调整其迁移路径的方向来响应剪切流的力。该协议演示了如何使用流体单元、泵、显微镜成像系统和自由软件记录和分析迁移。

小鼠边缘区 b 细胞剪切流诱导迁移的体外分析

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

此方法可以帮助理解免疫细胞迁移领域中的关键问题，例如细胞骨架如何发送剪切力，以及整流体配体和化疗素如何影响白细胞的流动迁移。这种技术的主要优点是，它是一种新型的迁移检测，初学者很容易执行。它只使用市售设备和试剂以及自由软件。虽然此方法可以提供对边缘区域 B 细胞的洞察，但它也可以应用于其他免疫细胞，如激活的 T 细胞。在实验前一天，解冻一个 ICAM-1 的等分，并在 PBS 中稀释至每毫升 5 微克的最终浓度。然后，将 30 微升 ICAM-1 添加到流滑梯所需的腔室。将滑梯放入潮湿的室内，将其设定在摄氏四度，在一夜之间孵育。第二天，在一个井中加入100微升PBS，然后从井的另一个井中提取100微升，来清洗水室。然后，在腔室中加入100微升的阻尼缓冲液，并在室温下在潮湿室中孵化滑梯90分钟。接下来，在一个井中加入100微升PBS，将其从另一个井中取走，然后向腔室添加100微升迁移缓冲液，清洗腔室。该幻灯片现在可以使用。在室温下将其存放在潮湿室，直到实验进行。首先，插入流体泵，并连接流体单元。然后，打开泵软件。接下来，用5到10毫升的迁移缓冲液清洗一次管子。这大约需要一分钟。然后，在两个储液罐中平均添加 11.7 毫升迁移缓冲液，并清除气泡。现在，将管子从连接器件夹住约 10 厘米，将流体单元放在加热孵化室的显微镜上。在软件中，将幻灯片选择设置为微幻灯片 VI 0.4，将管选项设置为白色。此外，将所需的剪切应力设置为每平方厘米约 4 个 dynes，将成像时间设置为 30 分钟。然后，通过将值输入泵软件，设置所需的流速和剪切应力。接下来，预热显微镜孵化室、流体单元和迁移缓冲液等值至37摄氏度。加热后，测试流体泵，确保迁移缓冲液在储液罐中来回流动，并且系统中没有气泡。首先，分离白细胞，并净化边缘区B细胞，如随附的文本协议所述。然后，用乙醇抑制的组织清洁幻灯片底部。将30微升的细胞悬浮液加入腔室的一个井中，然后从另一个井中提取30微升存储的迁移缓冲液。盖住幻灯片，孵育30分钟，让细胞连接。接下来，缓慢地将预热迁移缓冲区添加到幻灯片的每个井中，直到正半月板从井中升起。使用移液器尖端清除任何气泡。与影响细胞粘附的因素保持一致非常重要，因此将缓冲液和细胞保持 37 度，避免在将缓冲液移入腔室时使用过度的力。将幻灯片夹到显微镜阶段，然后从连接器件上拆体管的未标记侧。然后，用迁移缓冲液填充油管的端，直到无气泡的正半月板从端出来。翻转油管的端，并将其插入流室的顶井。在保持管子夹紧的同时，重复管的标记端的过程。现在，将成像系统切换到"实时"模式，然后选择幻灯片中间的视图字段。在这里，将焦点对等对细胞进行设置，然后稍微去聚焦，以增强细胞的黑色轮廓并产生白色内部。黑色背景和白色中心将更容易在自动跟踪程序中使用。设置成像序列程序，使用 10 倍干燥目标，每 5 秒录制一张图像，30 分钟。然后，开始录制。从油管上拆下夹子，然后打开泵。这将导致非粘附细胞洗掉，粘附细胞开始迁移。在成像程序结束时，标记并保存影片。如果使用抑制剂或细胞迁移的修饰剂，可以在将细胞悬浮液放在幻灯片上之前将其添加到细胞悬浮液中的细胞或流体单元中的迁移缓冲液中。要开始自动迁移跟踪分析，请打开 ImageJ 程序。将MTrack2_kt文件复制到 ImageJ 插件文件夹。在"插件"菜单下，选择"编译并运行"。然后，重新启动 ImageJ，插件应出现在插件菜单中。从 ImageJ 中的单元格迁移影片中打开图像堆栈，并处理此处显示的图像，以便将视频从彩色帧转换为高对比度图像，将单元格显示为白色背景上的黑色对象。接下来，锐化图像两次，对图像进行脱皮，然后将图像转换为八位。在"图像"菜单中，转到"调整亮度/对比度"子菜单，然后将"对比度"滑块置于最大对比度。这会使单元格在黑色背景上显示为白色对象。然后，返回"调整阈值"子对象，以确保单元格在白色背景上显示为黑色对象。现在，运行自动细胞跟踪插件MTrack2 kt。在选项屏幕上，将最小颗粒大小设置为 1 个像素，将粒子大小最大设置为 30 像素。将速度值设置为 10 像素，尽管在相隔 5 秒的连续帧上，边缘区域 B 单元格通常不会超过两个像素。细胞轨道现在准备使用伊比迪化学工具进行分析。这两个字段显示了在 ICAM-1 涂层幻灯片上播种的边际区域 B 细胞的迁移路径。使用本文中描述的方法使用 MTrack2 自动跟踪单元格。在左侧，细胞在静态条件下被成像，在右侧细胞暴露在每平方厘米四丁的剪切流中。单个单元格轨道可以导入到 ibidi Chemotaxis 工具中，以生成每个影片的轨道图。在这里，单个单元格轨道为红色，表示它们在源点下游结束，如果结束为上游，则为黑色。此处显示了对四个单独影片的单元格轨迹的分析，这些影片的流量和没有流条件。这包括两个条件的平均方向迁移指数、单元速度、路径直线度和最终直线距离。观看此视频后，您应该清楚地了解如何对边缘区域 B 细胞向剪切流的方向迁移以及如何自动跟踪细胞进行成像。在此过程期间，可以执行其他方法（如 TIRF 显微镜）来回答其他问题，例如细胞骨架和集成素如何响应剪切应力？

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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激活的B细胞CD40的小鼠模型

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

科研

免疫与感染

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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迁移人T淋巴细胞分离，培养和分析<em在体外</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

纯净小鼠的B细胞的诱导和评估类开关重组

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

在体外对HIV - 1核心脱壳

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

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小鼠牙龈细胞的分离，处理和分析

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

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在小鼠B淋巴细胞染色体畸变所PNA-FISH快速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

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B组的小鼠模型<em&gt;链球菌</em&gt;阴道定植

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A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

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The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

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