Name: preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل بمنحه إلى MLS وجائزة الباحث الصيف إلى MAK من مكتب البحوث والدراسات العليا في جامعة ميشيغان الوسطى. البكتيريا الزرقاء التي تم توفيرها زيمبا ومختبر العوالق، وجزء من المركز "الدراسات الساحلية"، تكساس A & M جامعة في كوربوس كريستي. يوجلينويدس التي تم توفيرها بمختبر تريمير، وجامعة ولاية ميشيغان.

1-الإعداد والتثبيت
<ol><li>إعداد البكتيريا الزرقاء.<ol>
<li>تنمو الثقافات أونيالجال في وسائل الإعلام F/224،25 في درجة حرارة 28 درجة مئوية في 14:10 ح الخفيفة دورة الظلام. نقل الثقافة يكفي لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل أن بعد السماح لمدة 15 دقيقة على تسوية، بيليه البكتيرية ?...

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).</li><li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy.">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li><li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM)+Protocols+for+Problematic+Plant,+Oomycete,+and+Fungal+Samples.">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System.">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li><li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment.">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li><li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm.">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Miquel Guennoc, ., C, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy.">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li><li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors.">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li><li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering.">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).</li><li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles.">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li><li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors.">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li><li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone:+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+(and+hard+inorganic+material).">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li><li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+for+materials+characterization.">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li><li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varietal+heavy+mineral+analysis+of+sediment+provenance,+Lower+Cretaceous+Scotian+Basin,+eastern+Canada.">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li><li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy.">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li><li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy.">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy.">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).</li><li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action.">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).</li><li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).</li><li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy:+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method.">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li><li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatotoxic+cyanobacteria:+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments.">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li><li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria.">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li><li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+of+Cyanobacteria+are+there?+Using+a+discovery+curve+to+predict+the+species+number.">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li><li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucilage+acts+to+adhere+cyanobacteria+and+cultured+plant+cells+to+biological+and+inert+surfaces.">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li><li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy,+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li><li>Kom&#225;rek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+taxonomic+revision+of+planktic+nostocacean+cyanobacteria:+a+short+review+of+genera.">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li><li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle.">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li><li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila.">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li><li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo.">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).</li></ol>

هنا يمكننا وصف بروتوكول باستخدام وزارة شؤون المرأة للحصول على معلومات مفصلة حول الخصائص المورفولوجية الخارجية من ثلاثة أنواع من الكائنات الحية أن الآخرين يمكن أن تنطبق على دراسة السمات لأنواع عديدة من الكائنات الحية أو الأنسجة. في كل خطوة من البروتوكول، هناك نقاط محتملة للخطأ التي قد تن?...

المسح الإلكتروني المجهري (SEM) يستخدم مركزة شعاع من الإلكترونات ذات الطاقة العالية لإنشاء صورة من الإلكترونات الثانوية التي تظهر مورفولوجية والطوبوغرافيا ل نموذج1. يمكن استخدام وزارة شؤون المرأة لمباشرة تحديد الحجم الفعلي عينة والبنية السطحية، وشكل ثلاثي الأبعاد، ويوفر دقة أكبر وأكبر عمق الميدان مقارنة بالفحص المجهري الخفيفة. نموذج آخر الميكروسكوب الإلكتروني (م)، يستخدم مجهر إلكتروني (TEM) تركز الإلكترونات التي تمر من خلال العينة، توليد الصور مع التفاصيل الدقيقة للهيكل الداخلي. في حين تيم بدقة أعلى من الضوء أو وزارة شؤون المرأة، ويمكن استخدامها لحل هياكل صغيرة مثل ذرة واحدة، فقد العيوب الرئيسية الثلاثة: إعداد عينة واسعة النطاق ومجال رؤية صغيرة وعمق ضحل من الميدان2،3. على الرغم من أن البعض تصور وجود بروتوكولات استخدام وزارة شؤون المرأة لدراسة محددة الخلايا أو العضيات، أو الأنسجة4،5،6،،من78،9، 10 ، هذا البروتوكول فريدة من نوعها في ذلك يمكننا وصف الأساليب التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية من أجل تقييم الخصائص المورفولوجية.
ووزارة شؤون المرأة قد وجدت تطبيقات واسعة النطاق لفحص المواد غير العضوية، بما في ذلك جسيمات نانوية11،12،13من البوليمرات، والعديد من التطبيقات في العلوم الجيولوجية والصناعية، والمواد14، 15،16. في علم الأحياء، استخدمت وزارة شؤون المرأة منذ فترة طويلة كوسيلة لفحص العينات البيولوجية بدءاً من البروتينات الفردية لكل الكائنات17،18. وزارة شؤون المرأة ذات قيمة خاصة لأنه يمكن استخدام التفاصيل السطحية المورفولوجية لإبلاغ الاكتشافات العلمية. تحليل وزارة شؤون المرأة طريقة سريعة وغير مكلفة وبسيطة للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل وحجم، والخصائص السطحية لمجموعة واسعة من العينات البيولوجية.
عادة يعمل وزارة شؤون المرأة تحت التفريغ العالي (10-6 عربة الحد الأدنى) لدعم متماسك شعاع من الإلكترونات عالية السرعة، لا يسمح أي السوائل (الماء، الزيوت، الكحول) في قاعة عينة، كسوائل منع تشكيل فراغ. وهكذا، يجب أن المجففة جميع العينات التي درست باستخدام SEM، عادة باستخدام سلسلة متدرجة من إيثانول تليها عملية تجفيف لإزالة في الإيثانول. هناك عدة طرق لتجفيف الأنسجة البيولوجية لاستخدامها في وزارة شؤون المرأة، بما في ذلك تجفيف الهواء، ليوفيليزيشن، واستخدام جهاز (وثيقة البرنامج القطري) التجفيف النقطة الحرجة، أو الكيميائية التجفيف باستخدام t-بوتيل الكحول (TBA) أو، هيكساميثيلديسيلازاني (همدس)19 20 , 21 , 22-في معظم الأحيان، اختيار أسلوب التجفيف التجريبية منذ كل عينة بيولوجية قد تتفاعل بشكل مختلف لكل أسلوب التجفيف. لأي نموذج معين، كل هذه الأساليب قد يكون من المناسب، حتى مقارنة مزايا وعيوب كل منها ويكون مفيداً في تحديد الأسلوب المناسب.
بينما الهواء تجفيف عينة في درجة حرارة الغرفة أو في فرن تجفيف (60 درجة مئوية) هو الأسلوب الأبسط، معظم العينات البيولوجية تظهر الأضرار التي يسببها تجفيف مثل شريفلينغ وانهيار، أدى إلى تشويه للعينة. عملية lyophilization أيضا إزالة الماء (أو الجليد) من عينة، ولكن يتطلب عينات لتكون مجمدة في فلاش وتوضع تحت الفراغ لإزالة الثلج عن طريق عملية التسامي، من المحتمل أن تكون ضارة العينة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون المستخدم الوصول إلى ليوفيليزير. الأسلوب الأكثر استخداماً للتجفيف عينات لوزارة شؤون المرأة نقطة حرجة التجفيف (وثيقة البرنامج القطري). في وثيقة البرنامج القطري، يتم استبدال الإيثانول في عينة السائل من ثاني أكسيد الكربون (CO2)، وتحت درجة حرارة معينة وضغط الظروف المعروفة النقطة الحرجة (31.1 درجة مئوية وهذه المبادرة 1,073)، أول أكسيد الكربون2 يبخر دون خلق التوتر السطحي، مما المحافظة على فعالية الميزات البنيوية والهيكلية للعينة. بينما وثيقة البرنامج القطري هو عموما الطريقة القياسية، فقد عدة عيوب. أولاً، العملية تتطلب الوصول إلى نقطة حرجة مجفف، التي ليست مكلفة فقط، بل يتطلب أيضا استخدام ثاني أكسيد الكربون السائل. ثانيا، أن حجم العينة التي يمكن أن تجفف يقتصر على حجم الدائرة النقطة الحرجة مجفف. وثالثاً، يمكن أن يسبب تبادل السوائل خلال وثيقة البرنامج القطري الاضطرابات التي يمكن أن تلحق الضرر العينة.
تجفيف المواد الكيميائية ويوفر مزايا عديدة أكثر من وثيقة البرنامج القطري ويخدم كبديل مناسب أصبح يستخدم على نطاق واسع في إعداد نموذج وزارة شؤون المرأة. ويتيح استخدام ديهيدرانتس الكيميائية مثل القابلات التقليديات وهمدس بديلاً سريعة وغير مكلفة وبسيطة لأساليب أخرى، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة. ونحن مؤخرا أظهرت أن لم يكن هناك فرق في سلامة الأنسجة أو جودة الصورة النهائية التقاطها عند استخدام وثيقة البرنامج القطري أو القابلات التقليديات كأسلوب التجفيف في نسيج الشبكية المورفولوجية الكبار23. وخلافا لوثيقة البرنامج القطري، القابلات التقليديات وهمدس لا تتطلب أداة تجفيف أو السائل CO2 وتوجد أية قيود على الحجم العينة أن تجفف. بالإضافة إلى الحصول على المواد الكيميائية، فقط غطاء الأبخرة الكيميائية القياسية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة (القفازات، ومعطف مختبر، ونظارات واقية) المطلوبة لإكمال عملية التجفيف. بينما كل من القابلات التقليديات وهمدس القابلة للاشتعال، يضاف أقل سمية وأقل تكلفة (حوالي 1/3 تكلفة همدس) من همدس.
في هذه المقالة، نحن تصف كيفية إصلاح وتغسل ويذوي، جاف، جبل، وتفل معطف والصورة ثلاثة أنواع من الكائنات الحية: البكتيريا الزرقاء (ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، جولينكينا sp.، و sp. غير معروف)، يوجلينويدس اثنين من جنس مونومورفينا (أينيجماتيكا م. و. م. بسيودوبيروم)، وذبابة الفاكهة (melanogaster المورفولوجية). هذه الكائنات تمثل نطاقا واسعاً في الحجم (0.5 ميكرومتر إلى 4 مم) والتنوع الخلوية (وحيدة الخلية إلى متعددة الخلايا)، ولكن كلها بسهولة قابلة للتحليل ووزارة شؤون المرأة مع اختلافات صغيرة فقط بحاجة لإعداد العينات. هذا البروتوكول يصف الأساليب لاستخدام الجفاف الكيميائية والتحليل ووزارة شؤون المرأة للنظر في تفاصيل المورفولوجي لثلاثة أنواع من الكائنات الحية، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع في دراسة كثير العضوي وأنواع الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1285px;" width="1284">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">&#160;gold&#8211;palladium</td>
			<td style="width:373px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:395px;">91212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver conductive adhesive 503</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12686-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 &#956;m, polycarbonate, black</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum weighing dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (12 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (25 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adhesive tabs&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>76760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">conductive carbon adhesive tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">F/2 media</td>
			<td style="width:373px;">Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin</td>
			<td style="width:395px;">https://utex.org/products/f_2-medium</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AF6 media</td>
			<td style="width:373px;">Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td>
			<td style="width:395px;">https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soil water medium</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>153785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hummer 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hitachi 3400N-II SEM&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td style="width:395px;">https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&#38;md=sms2-1&#38;sd=sms2-1-2&#38;gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE</td>
			<td>The company doesn&#39;t appear to sell this model any longer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)

المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) هي تقنية متاحة على نطاق واسع تم تطبيقه لدراسة العينات البيولوجية بدءاً من البروتينات الفردية إلى الخلايا والأنسجة والعضيات والكائنات كلها حتى. ويركز هذا البروتوكول على طريقتين التجفيف الكيميائية هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) والكحول تي-بوتيل (يضاف) وتطبيقها لتصوير الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة على حد سواء باستخدام sem. في هذه المقالة، نحن تصف كيفية إصلاح وتغسل ويذوي، جاف، جبل، وتفل معطف والصورة ثلاثة أنواع من الكائنات الحية: البكتيريا الزرقاء (ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، جولينكينا sp.، و sp. غير معروف)، يوجلينويدس اثنين من جنس مونومورفينا (أينيجماتيكا م. و. م. بسيودوبيروم)، وذبابة الفاكهة (melanogaster المورفولوجية). والغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقة سريعة وغير مكلفة وبسيطة للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل وحجم، والخصائص السطحية للعينات التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية من أجل الخصائص المورفولوجية تقييم. النجاح في إنجاز هذا البروتوكول يسمح للآخرين باستخدام SEM لتصور عينات بتطبيق هذه التقنيات على النظام الخاص بهم.

البكتيريا الزرقاء هي مجموعة بدائية من الكائنات الحية ذات الأهمية الحاسمة للكربون على الصعيد العالمي، والأكسجين، ودورات النيتروجين28،29. أنواع البكتيريا الزرقاء306000 المقدرة، الأكثر غمد موسيلاجينوس التي تغطي وتوصيل الخلايا مع...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

تحليل وزارة شؤون المرأة طريقة فعالة للمساعدة في تحديد الأنواع أو التمييز المظهرية. هذا البروتوكول يصف الأساليب لدراسة التفاصيل المورفولوجية الخاصة ثلاثة أنواع تمثيلية من الكائنات الحية وستطبق على نطاق واسع لدراسة ملامح كثيرة العضوي وأنواع الأنسجة.

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

يركز هذا البروتوكول على طريقتين للتجفيف الكيميائي، سداسي البروميثيديسيلازان وتكحول تي بوتيل وتصويرهما لكل من الكائنات الحية الprokaryotic وekaryotic باستخدام SEM. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب استخدام معدات التجفيف المتخصصة مثل مجفف النقاط الحرجة لإعداد العينات للتحليل. يصف هذا البروتوكول طرق استخدام الجفاف الكيميائي وتحليل SEM لثلاثة أنواع من الكائنات الحية ولكنه ينطبق بشكل عام على فحص العديد من أنواع الكائنات الحية والأنسجة.إثبات الإجراء سيكون ماديسون كون، طالبة جامعية من مختبري. للبدء، وإعداد البكتيريا الزرقاء عن طريق التثبيت بين عشية وضحاها. ثم، نقلها إلى 10 مل الترشيح تلاعب تحتوي على مرشح البولي 25 مل.ختم الذراع الجانبي والقمع من تلاعب الترشيح مع سدادات مطاطية لاحتواء الثقافة في القمع. بعد إزالة كل من سدادات، وإزالة المثبت عن طريق كنس لطيف على قارورة الترشيح. لإعداد euglenoids الطحالب وحيدة الخلية، وإصلاحها عن طريق إضافة 3 قطرات من 4٪ أوزميوم تتراوكسيد مباشرة إلى الثقافة التي تم نقلها سابقا إلى 10 مل الترشيح تلاعب.بعد حضانة لمدة 30 دقيقة، وإزالة كل من سدادات وإزالة المثبت عن طريق كنس لطيف على قارورة الترشيح. غسل euglenoids ثابت ثلاث مرات مع 5 مل من 0.1 م الفوسفات العازلة الرقم pH 7.0 في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق لكل مع الحفاظ على القارورة والقمع مغلقة مع سدادات لعقد الغسيل. بعد إزالة كل من سدادات، وإزالة كل غسل عن طريق فراغ لطيف على قارورة الترشيح.لتجفيف العينة مع الحفاظ على الغمر المستمر، استخدم سلسلة الإيثانول متدرج لمدة عشر دقائق في حجم 5 مل في القمع مع الحفاظ على القارورة والقمع مغلقة مع سدادات لاحتواء الإيثانول في القمع. بعد إزالة كل من سدادات فراغ بلطف على قارورة الترشيح لإزالة الإيثانول. نقل العينة إلى طبق وزنها الألومنيوم المتاح التي تحتوي على ما يكفي فقط 100٪ الإيثانول لتغطية العينة.لتنفيذ التجفيف الكيميائي لل euglenoids باستخدام TBA، استبدال أول حل الإيثانول 100٪ في طبق الألومنيوم مع حل 1 إلى 1 من TBA و 100٪ الإيثانول لمدة عشرين دقيقة. ثم، استبدال 1 إلى 1 الحل مع 100٪ TBA لمدة عشرين دقيقة وكرر العملية مرتين. إزالة TBA واستبدالها فقط بما فيه الكفاية الطازجة 100٪ TBA لتغطية العينة.وضع الطبق في أربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق لتجميد TBA. نقل العينة إلى جهاز حفّام فراغ مع حزم هلام المجمدة للحفاظ على TBA المجمدة. استخدام مضخة دوارة لإخلاء والحفاظ على فراغ للسماح للعينة لتجف عن طريق التسامي فراغ من TBA المجمدة لمدة ثلاث ساعات على الأقل.لتركيب البكتيريا الزرقاء في euglenoids، تسمية الجزء السفلي من 25 مم تصاعد الألومنيوم كعب للإشارة إلى ما يجري وضعها على القمة. ثم ضع كل مرشح على علامة تبويب لاصقة الكربون المضمون إلى أعلى كعب. لإعداد drosophila melanogaster ، غمر الذباب المذبف في 1 مل من المثبت لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية ، والتأكد من أنها مغمورة تماما.استخدام ماصة زجاجية لإزالة المثبت. غسل عينة Drosophila ثابتة في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge ثلاث مرات مع 1 مل من 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحرارة 7.2 في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. استخدام ماصة زجاجية لإزالة كل غسل، مع الحرص على عدم إزالة العينة.ثم، وتجفيف العينة في أنبوب microfuge في حجم 1 مل باستخدام سلسلة الإيثانول متدرج لمدة عشر دقائق لكل من. استخدام ماصة زجاجية لإزالة كل غسل، مع الحرص على عدم إزالة العينة. الحفاظ على العينة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع ما يكفي فقط 100٪ الإيثانول لتغطية ذلك.لتنفيذ التجفيف الكيميائي للذباب باستخدام HMDS، استبدل أولاً محلول الإيثانول بنسبة 100٪، بمحلول 1 إلى 2 من HMDS و100٪ إيثانول لمدة عشرين دقيقة. ثم استبدال الحل مع حل 2 إلى 1 من HMDS و 100٪ الإيثانول لمدة عشرين دقيقة. وأخيراً، استبدل هذا الحل بـ 100٪ HMDS لمدة عشرين دقيقة ثم كرر العملية مرة واحدة.نقل العينة التي هي في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل و HMDS في طبق وزنها الألومنيوم المتاح. استبدل 100٪ HMDS مع ما يكفي من 100٪ HMDS الطازجة لتغطية العينة. ضع العينة داخل طبق الألومنيوم مباشرة في غطاء أبخرة كيميائية لتجف بغطاء فضفاض مثل صندوق لمنع الحطام من السقوط على العينة والسماح له بالجفاف لمدة 12 إلى 24 ساعة.لتركيب دروسوفيليا، قم بتسمية الجزء السفلي من كعب تصاعد الألومنيوم. استخدام ملاقط الدقة لوضع الذباب المجفف في الموضع المطلوب على علامة تبويب لاصقة الكربون المضمون إلى أعلى كعب تحت مجهر تشريح. تطبيق الفضة لاصق موصل حول الحواف الخارجية من كعب.استخدم مسواك لتوصيل الطلاء الفضي بالذباب، مع ضمان التوصيلية، والتأكد من أن الطلاء لا يلمس منطقة التصوير المرغوبة. ضع كعب في مربع حامل كعب روتين، ثم ضع مربع حامل كعب الروتين المفتوح في جهاز تجفيف والسماح للطلاء الفضي بالجفاف لمدة ثلاث ساعات على الأقل. لإعداد جهاز الطلاء sputter، أداء 4 إلى 5 الهبات من غاز الأرجون.بناءً على العينات التي سيتم تغليفها، عيّن جهاز ضبط الوقت إلى إعدادات مختلفة كما هو موضح في المخطوطة. معطف بصقة كعب التالية تعليمات المصنعين. وأخيراً، تقوم عينات الصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسحي الذي يتضمن كاشفاً ثانوياً للإلكترونات مع إعدادات تعتمد على العينة المستخدمة.إعداد ناجحة من البكتيريا الزرقاء ل SEM باستخدام هذا البروتوكول ينتج الصور حيث تفاصيل الخلية، بما في ذلك الشكل والملمس من السطح مرئية وكذلك صمغ من mucilage والإسقاطات من الخلايا. صورة SEM لأنواع المياه العذبة الخيطية من كولورادو تظهر صمغًا مرئيًا من المثاث. صورة SEM لبكتيريا المياه العذبة من أوهايو تكشف عن الخلايا الفردية التي تشكل في بعض الأحيان المستعمرات التي عقدت معا من قبل طبقة رقيقة من mucilage.خيوط تشبه نتوءات تمتد من الخلايا الفردية. تظهر صور الأنواع الخيطية غير المعروفة من مصب ملوحة عالية في المياه الساحلية في تكساس خلايا فردية ومقسمة. تم استخدام SEM لتصور شرائط بيليكل من نوعين مختلفين من Euglenoid.عند مقارنة Monomorphina و Aenigmatica مع monomorphina البيروم الزائفة ، وترتيب الهليلة مرئية من شرائط بيليكل التي تظهر في نهاية الخلفي لتشكيل ذيل ، والمساعدة في في فيلوجيني لإنهاء. تظهر صور SEM للعيون الدوزوفيليا العادية مجموعة من الشعيرات والعدسات مرتبة ولكن التعبير عن البروتينات المرتبطة بمرض الزهايمر يخلق النمط الظاهري الخشن للعين. الجينات التي تقمع أو تعزز النمط الظاهري الخشن للعين قد تلعب دورًا فسيولوجيًا في تطور المرض.وفيما يلي أمثلة على احتمال سقوط حفرة لتجنب، بما في ذلك مثال على هيكل انهار العين من تقنية التجفيف غير السليمة وشحن الإلكترون من الترميز غير كافية sputter التي تظهر أثناء الحصول على الصور. استخدمت البروتوكولات الموصوفة هنا كائنات حية ذات تواطؤ محترم إلى حد كبير ، ومع ذلك فإن جميعها قابلة لتحليل SEM لجمع معلومات مورفولوجية مفيدة تعد حاسمة لاكتشافات علمية تغطي العديد من التخصصات الفرعية لعلم الأحياء. لا ننسى أن العمل مع الكحول تي- بوتيل، سداسي الميثيليديسيلازان، وتيتروسيد الأوزميوم يمكن أن تكون خطرة وينبغي دائماً مراعاة تدابير السلامة المناسبة لحماية المستخدمين، وخاصة الطلاب الذين سيتم التعامل مع هذه المواد الكيميائية.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

سير عمل التصوير المقطعي للصفيف للحصول المستهدف على معلومات الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...