Name: preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud til MLS og en sommer Scholar Award til MAK fra Office for forskning og studier ved Central Michigan University. Cyanobakterier blev leveret af Zimba og plankton lab, en del af Center for kystnære undersøgelser, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids blev leveret af Triemer lab, Michigan State University.

1. forberedelse og fiksering
<ol><li>Forberede cyanobakterier.<ol>
<li>Vokse unialgal kulturer i F/2 medier24,25 ved en temperatur på 28 ° C på en 14:10 h lys mørke cyklus. Overføre tilstrækkelig kultur til en 1,5 mL microcentrifuge tube, sådan, at efter at tillade 15 min at bosætte sig, den bakterielle pellet er ca. 0,05 mL i størrelse. Fjerne medier og erstatte med 1,5 mL af fiksativ (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfat buffer pH 7,0), forsigtigt vende...

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).</li><li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy.">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li><li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM)+Protocols+for+Problematic+Plant,+Oomycete,+and+Fungal+Samples.">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System.">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li><li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment.">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li><li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm.">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Miquel Guennoc, ., C, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy.">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li><li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors.">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li><li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering.">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).</li><li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles.">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li><li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors.">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li><li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone:+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+(and+hard+inorganic+material).">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li><li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+for+materials+characterization.">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li><li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varietal+heavy+mineral+analysis+of+sediment+provenance,+Lower+Cretaceous+Scotian+Basin,+eastern+Canada.">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li><li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy.">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li><li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy.">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy.">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).</li><li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action.">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).</li><li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).</li><li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy:+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method.">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li><li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatotoxic+cyanobacteria:+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments.">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li><li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria.">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li><li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+of+Cyanobacteria+are+there?+Using+a+discovery+curve+to+predict+the+species+number.">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li><li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucilage+acts+to+adhere+cyanobacteria+and+cultured+plant+cells+to+biological+and+inert+surfaces.">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li><li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy,+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li><li>Kom&#225;rek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+taxonomic+revision+of+planktic+nostocacean+cyanobacteria:+a+short+review+of+genera.">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li><li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle.">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li><li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila.">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li><li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo.">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).</li></ol>

Her beskrev vi en protokol bruger SEM for at indhente detaljerede oplysninger om eksterne morfologiske karakteristika af tre typer af organismer, som andre kan anvende til at undersøge funktioner af mange typer af organismer eller væv. Inden for hvert enkelt trin i protokollen er der potentielle point af fejl, der måtte opstå og diskuteres i detaljer nedenfor.
Mens diskenheder for fiksativ og vasker givet her er specifikke, bør generelt fiksativ og vasker være 5-10 x volumen af prøven. ...

En scanning elektron mikroskop (SEM) bruger en fokuseret stråle af højenergi elektroner til at generere et billede fra sekundære elektroner, der viser morfologi og topografi af en prøve1. SEM kan bruges til direkte bestemme den fysiske størrelse af en prøve, overfladestruktur, og tre-dimensionelle form, og tilbyder højere opløsning og større dybdeskarphed i forhold til lysmikroskopi. En anden form for elektronmikroskopi (EM), transmissions elektronmikroskopi (TEM) bruger fokuseret elektroner, der passerer gennem prøven, generere billeder med fine detaljer af interne struktur. Mens TEM har højere opløsning end lys eller SEM og kan bruges til at løse strukturer så lille som enkelt atomer, det har tre store ulemper: omfattende prøveforberedelse, et mindre synsfelt og lavvandede dybde af feltet2,3. Selv om andre visualiseret protokoller findes ved hjælp af SEM for at undersøge specifikke celler, organeller eller væv4,5,6,7,8,9, 10 , denne protokol er unik, idet vi beskriver metoder, der kan anvendes bredt på en lang række organismer til morfologiske vurdering.
SEM har fundet bred programmer for behandlingen af uorganiske materialer herunder nanopartikler11,12, polymerer13og talrige anvendelser i geologiske, industrielle og materielle sciences14, 15,16. I biologi, har SEM længe været brugt som en metode til at undersøge biologiske prøver spænder fra individuelle proteiner til hele organismer17,18. SEM er af ganske særlig værdi fordi morfologiske overflade detaljer kan bruges til at informere videnskabelig opdagelse. SEM analyse er en hurtig, billig og enkel metode til at få detaljerede oplysninger om struktur, størrelse og overfladekarakteristika for en bred vifte af biologiske prøver.
Fordi en SEM normalt opererer under højt vakuum (10-6 Torr minimum) til at støtte en sammenhængende stråle af højhastighedstog elektroner, er ingen væsker (vand, alkoholer, olier) tilladt i prøve salen, da væsker forhindrer, at et vakuum formning. Således skal alle prøver undersøgt ved hjælp af SEM være dehydreret, typisk ved hjælp af en gradueret ethanol serie efterfulgt af en tørringsproces fjerne ethanol. Der er flere metoder til tørring biologiske væv til brug i SEM, herunder lufttørring, ingot, brug af et kritisk punkt tørring (CPD) enhed, eller kemiske tørring ved hjælp af Thomsen-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftest, udvælgelse af en tørring metode er empiriske da hver biologisk prøve kan reagere forskelligt på hver tørring metode. For enhver given prøve, kan alle disse metoder være passende, så sammenligne fordele og ulemper ved hver er nyttige i at vælge den relevante metode.
Mens lufttørring en prøve ved stuetemperatur eller i et varmeskab (60 ° C) er den enkleste metode, de fleste biologiske prøver viser tørring-induceret skade som shriveling og sammenbrud, medfører forvridning af modellen. Processen med ingot også fjerner vand (eller is) fra en prøve, men kræver prøver at være flash-frosset og placeret under vakuum til at fjerne is via processen af sublimering, potentielt skadelige prøven. Derudover skal brugeren have adgang til en lyophilizer. Den hyppigst anvendte metode til tørring prøver for SEM er kritiske punkt tørring (CPD). I CPD, er ethanol i en stikprøve erstattet med flydende kuldioxid (CO2) og under specifikke temperatur og trykforholdene kendt som det kritiske punkt-(31,1 ° C og 1.073 psi), CO-2 fordamper uden at skabe overfladespænding, hvorved effektivt fastholde de morfologiske og strukturelle elementer i prøven. Mens CPD er generelt den standardmetode, har det flere ulemper. Først, processen kræver adgang til et kritisk punkt tørretumbler, der er ikke kun dyre, men også kræver anvendelsen af flydende kuldioxid. Andet, størrelsen af den prøve, der kan tørres er begrænset til størrelsen afdeling af det kritiske punkt tørretumbler. Tredje, udvekslingen af væsker under CPD kan forårsage uro, der kan skade prøven.
Kemiske tørring tilbyder mange fordele i forhold til CPD og fungerer som et egnet alternativ, der er ved at blive udbredt i SEM prøveforberedelse. Brugen af kemiske dehydrants såsom TBA og HMDS tilbyder en hurtig, billig og enkel alternativ til andre metoder, mens den stadig vedholdt den strukturelle integritet af prøven. Vi viste for nylig, at der var ingen forskel i integriteten af væv eller kvaliteten af det endelige billede fanget ved brug af CPD eller TBA som tørring metode i voksen Drosophila retinale væv23. I modsætning til CPD, TBA og HMDS kræver ikke en tørring instrument eller flydende CO2 og der er ingen begrænsning på størrelsen af prøven tørres. Ud over at opnå kemikalierne, er kun en standard kemisk stinkskab og passende personlige værnemidler (handsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller) kræves for at fuldføre tørringsprocessen. Mens både TBA og HMDS er brandfarlige, TBA er mindre giftige og billigere (ca. 1/3 udgifterne til HMDS) end HMDS.
I denne artikel vil vi beskrive hvordan man fix, vaske, dehydrere, tørre, montere, sputter frakke og image tre typer af organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. og en ukendt sp.), to euglenoids fra slægten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og bananfluen (Drosophila melanogaster). Disse organismer repræsenterer en bred vifte i størrelse (0,5 µm til 4 mm) og cellulære mangfoldighed (encellede til flercellede), men alle er let indstillet til SEM analyse med kun små variationer til prøvepræparation. Denne protokol beskriver metoder til at bruge kemiske dehydrering og SEM analyse for at undersøge morfologiske oplysninger om tre typer af organismer og ville gælde generelt at undersøge mange kropsligt og vævstyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1285px;" width="1284">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">&#160;gold&#8211;palladium</td>
			<td style="width:373px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:395px;">91212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver conductive adhesive 503</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12686-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 &#956;m, polycarbonate, black</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum weighing dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (12 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (25 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adhesive tabs&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>76760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">conductive carbon adhesive tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">F/2 media</td>
			<td style="width:373px;">Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin</td>
			<td style="width:395px;">https://utex.org/products/f_2-medium</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AF6 media</td>
			<td style="width:373px;">Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td>
			<td style="width:395px;">https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soil water medium</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>153785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hummer 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hitachi 3400N-II SEM&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td style="width:395px;">https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&#38;md=sms2-1&#38;sd=sms2-1-2&#38;gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE</td>
			<td>The company doesn&#39;t appear to sell this model any longer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)

Scanning elektronmikroskopi (SEM) er et almindeligt tilgængelige teknik, der er blevet anvendt til at undersøge biologiske enheder spænder fra individuelle proteiner til celler, væv, organeller og endda hele organismer. Denne protokol fokuserer på to kemiske tørring metoder, hexamethyldisilazane (HMDS) og Thomsen-butyl alkohol (TBA) og deres anvendelse til billeddannelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af SEM. I denne artikel vil vi beskrive hvordan man fix, vaske, dehydrere, tørre, montere, sputter frakke og image tre typer af organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. og en ukendt sp.), to euglenoids fra slægten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og bananfluen (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokol er at beskrive en hurtig, billig og enkel metode til at få detaljerede oplysninger om struktur, størrelse og overfladekarakteristika for enheder, der kan anvendes bredt på en lang række organismer til morfologiske vurdering. Vellykket gennemførelse af denne protokol vil tillade andre at bruge SEM for at visualisere prøver ved at anvende disse teknikker på deres system.

Cyanobakterier er en prokaryot gruppe af organismer, der er afgørende for de globale kulstof, ilt og kvælstof cyklusser28,29. Af anslået 6000 arter af cyanobakterier30har mest en slimet kappe, der dækker og forbinde cellerne sammen og til andre strukturer31, som sammen med figuren, kan blive løst mikroskopisk32. Cellestørrelse, form og pigmenter nuværen...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemiske tørring til morfologisk analyse i Scanning elektronmikroskopi (SEM)

SEM analyse er en effektiv metode til at støtte i identifikation af arter eller fænotypiske forskelsbehandling. Denne protokol beskriver metoder til at undersøge specifikke morfologiske oplysninger for tre repræsentative typer af organismer og ville gælde generelt at undersøge egenskaber i mange kropsligt og vævstyper.

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Denne protokol fokuserer på to kemiske tørremetoder, Hexamethyldisilazane og T-butylalkohol, og deres anvendelse af billeddannelse både prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af SEM. Den største fordel ved denne teknik er, at det ikke kræver brug af specialiseret tørreudstyr såsom en kritisk punkttørrer til at forberede prøver til analyse. Denne protokol beskriver metoderne til anvendelse af kemisk dehydrering og SEM-analyse af tre typer organismer, men vil i det store og hele kunne anvendes til undersøgelse af mange organisme- og vævstyper.Demonstration af proceduren vil være Madison Koon, en bachelor studerende fra mit laboratorium. For at starte, forberede cyanobakterier ved natten fiksering. Derefter overføres dem til en 10 ml filtreringsplatform, der indeholder et polycarbonat 25 ml filter.Se sidearmen og tragten af filtreringsriggen med gummipropper for at indeholde kulturen i tragten. Når begge propper er fjernet, fjernes fikseringsegne ved skånsom støvsugning på filtreringskolben. For at forberede encellede alger euglenoider, fastsætte dem ved at tilføje 3 dråber 4%osmium tetroxid direkte til den kultur, der tidligere er blevet overført til en 10 ml filtrering rig.Efter 30 minutters inkubation fjernes begge propper, og fikseringsegne fjernes ved skånsom støvsugning på filtreringskolben. De faste euglenoider vaskes tre gange med 5 ml 0,1 M fosfatbuffer pH 7.0 ved stuetemperatur i ti minutter, samtidig med at kolben og tragten lukkes med propperne for at holde vasken. Efter fjernelse af begge propper fjernes hver vask ved hjælp af skånsomt vakuum på filtreringskolben.Prøven skal dehydreres, samtidig med at den kontinuerlige nedsænkning bevares, og der anvendes en gradueret ethanolserie i ti minutter i et volumen på 5 ml i tragten, samtidig med at kolben og tragten lukkes med propperne for at indeholde ethanolen i tragten. Efter fjernelse af begge propper støvsuges forsigtigt på filtreringskolben for at fjerne ethanol. Prøven overføres til en engangs aluminiumsvejeskål, der indeholder lige nok 100%ethanol til at dække prøven.For at udføre kemisk tørring af euglenoider ved hjælp af TBA, først erstatte 100% ethanol opløsning i aluminium skålen med en 1 til 1 opløsning af TBA og 100% ethanol i tyve minutter. Derefter erstattes 1 til 1-opløsningen med 100% TBA i tyve minutter, og gentag processen to gange. Fjern TBA og erstatte med lige nok frisk 100% TBA til at dække prøven.Placer fadet ved fire grader celsius i ti minutter for at fryse TBA. Overfør prøven til en vakuumudsiccator med frosne gelpakninger for at holde TBA frosset. Brug en roterende pumpe til at evakuere og vedligeholde vakuum, så prøven kan tørre ved vakuumnamering af den frosne TBA i mindst tre timer.For at montere cyanobakterier i euglenoids, mærke bunden af en 25 mm aluminium montering stub at angive, hvad der bliver placeret på toppen. Placer derefter hvert filter på en carbon klæbende fane fastgjort til toppen af stubben. For at forberede Drosophila melanogaster, nedsænke bedøvet fluer i 1 ml fiksativ i to timer ved fire grader celsius, og sørg for at de er helt nedsænket.Brug en glaspipette til at fjerne fiksativet. Den faste Drosophila-prøve vaskes i et 1,5 ml mikrocentrifugerør tre gange med 1 ml 0,1 M fosfatbuffer, pH 7.2 ved stuetemperatur i ti minutter. Brug en glaspipette til at fjerne hver vask, og pas på ikke at fjerne prøven.Derefter dehydrere prøven i et mikrofugerør i et volumen på 1 ml ved hjælp af en gradueret ethanolserie i ti minutter hver. Brug en glaspipette til at fjerne hver vask, og pas på ikke at fjerne prøven. Hold prøven i 1,5 ml mikrocentrifugerør med lige nok 100% ethanol til at dække det.For at udføre kemisk tørring af fluerne ved hjælp af HMDS skal 100% ethanolopløsningen først udskiftes med en 1 til 2 opløsning af HMDS og 100% ethanol i tyve minutter. Derefter udskiftes opløsningen med en 2 til 1 opløsning af HMDS og 100% ethanol i tyve minutter. Endelig erstatte denne løsning med 100% HMDS i tyve minutter og derefter gentage processen én gang.Prøven, der er i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og HMDS, overføres til en engangs aluminiumsvejeskål. Udskift 100%HMDS med lige nok frisk 100% HMDS til at dække prøven. Prøven anbringes direkte i aluminiumsskålen i en kemisk røghætte for at tørre med et løst låg, f.eks.For at montere Drosophila, mærke bunden af en aluminium montering stub. Brug præcision pincet til at placere de tørrede fluer i den ønskede position på en carbon klæbende fane fastgjort til toppen af en stub under en dissekere mikroskop. Påfør sølv ledende lim omkring de ydre kanter af stubbe.Brug en tandstikker til at forbinde sølvmalingen til fluerne, så du sikrer ledningsevne, og sørg for, at malingen ikke berører det ønskede billedområde. Læg stubbene i en stubholderboks, og anbring derefter den åbne stubholderboks i en ekssiccator, og lad sølvmalingen tørre i mindst tre timer. For at forberede sputter belægning apparat, udføre 4 til 5 skyl af argon gas.Afhængigt af de prøver, der skal belagt, skal du indstille timeren til forskellige indstillinger som beskrevet i manuskriptet. Sputter pels de stubbe efter producentens anvisninger. Endelig billedprøver ved hjælp af en scanning elektron mikroskop, der omfatter en sekundær elektron detektor med indstillinger, der afhænger af den anvendte prøve.Vellykket forberedelse af cyanobakterier til SEM ved hjælp af denne protokol gav billeder, hvor detaljer af cellen, herunder form og tekstur af overfladen er synlige samt en kappe af slim og fremskrivninger fra cellerne. SEM billede af en filamentous ferskvandsarter fra Colorado viser en synlig kappe af slim. SEM billede af en ferskvandsbakterier fra Ohio afslører individuelle celler, som undertiden danner kolonier holdt sammen af et tyndt lag af slim.Filament-lignende fremspring strækker sig fra de enkelte celler. Billeder af ukendte filamentøse arter fra en høj saltholdighed flodmunding i Texas kystnære farvande viser individuelle og dividere celler. SEM blev brugt til at visualisere pellicle strimler af to forskellige Euglenoid arter.Når man sammenligner Monomorphina og Aenigmatica med Monomorphina pseudo pyrum, den synlige spiralformede arrangement af pellicle strimler, der opstår i den bageste ende til at danne en hale, støtte i phylogeny til opsigelse. SEM billeder af normale drosophila øjne viser en bestilt vifte af børster og linser, men udtryk for proteiner forbundet med Alzheimers sygdom skabe uslebne øje fænotype. Gener, der undertrykker eller forbedrer det uslebne øje fænotype kan spille en fysiologisk rolle i sygdomsprogression.Her er eksempler på potentielle pit falls at undgå, herunder et eksempel på den kollapsede struktur i øjet fra forkert tørring teknik og elektron opladning fra utilstrækkelig sputter kodning, der vises under billedet erhvervelse. De protokoller, der er beskrevet her udnyttede organismer, der meget meget med respekteret meddelagtighed, men alle er modtagelige for SEM analyse for at indsamle nyttige, morfologiske oplysninger, der er afgørende for videnskabelige opdagelser spænder over mange sub discipliner i biologi. Glem ikke, at arbejde med T-Butyl alkohol, Hexamethyldisilazane, og osmium tetroxid kan være farligt, og de relevante sikkerhedsforanstaltninger bør altid overholdes for at beskytte brugerne, især studerende, der vil håndtere disse kemikalier.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy af udblødt Tissue at visualisere den ekstracellulære matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Undersøgelse af Supramolekylær Organisationen af ​​photosynthetic Membraner inden Freeze-brækkede Leaf Væv af Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protokoller for Problematisk Plant, ægsporesvampe, og Fungal Prøver

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Forberedelse og Observation af Thick Biologiske prøver ved scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Arraytomografiarbejdsgang for målrettet anskaffelse af volumenoplysninger ved hjælp af scanningselektronmikroskopi

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...