Name: preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי מענק ה-MLS, פרס מלומד הקיץ יגיעו למשרד של מחקר, לימודים לתואר שני ושלישי באוניברסיטת מישיגן סנטרל. כחוליות סופקו על ידי Zimba, המעבדה פלנקטון, חלק ממרכז ה עבור מחקרים לאורך החוף, טקסס A & M באוניברסיטת קורפוס קריסטי. Euglenoids סופקו על ידי המעבדה Triemer, אוניברסיטת מדינת מישיגן.

1. קיבוע והכנה
<ol><li>להכין כחוליות.<ol>
<li>גדלים unialgal תרבויות F/2 מדיה24,25 בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס על 14:10 h אור מחזור כהה. העברת תרבות מספיק צינור microcentrifuge 1.5 mL כזה לאחר המאפשר 15 דקות להתיישב, בגדר חיידקי הוא כ- 0.05 מ ל גודל. מסיר את המדיה ואת החלף 1.5 מיליליטר מקבע (1.25...

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).</li><li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy.">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li><li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM)+Protocols+for+Problematic+Plant,+Oomycete,+and+Fungal+Samples.">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System.">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li><li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment.">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li><li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm.">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Miquel Guennoc, ., C, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy.">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li><li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors.">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li><li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering.">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).</li><li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles.">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li><li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors.">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li><li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone:+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+(and+hard+inorganic+material).">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li><li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+for+materials+characterization.">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li><li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varietal+heavy+mineral+analysis+of+sediment+provenance,+Lower+Cretaceous+Scotian+Basin,+eastern+Canada.">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li><li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy.">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li><li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy.">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy.">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).</li><li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action.">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).</li><li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).</li><li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy:+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method.">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li><li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatotoxic+cyanobacteria:+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments.">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li><li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria.">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li><li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+of+Cyanobacteria+are+there?+Using+a+discovery+curve+to+predict+the+species+number.">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li><li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucilage+acts+to+adhere+cyanobacteria+and+cultured+plant+cells+to+biological+and+inert+surfaces.">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li><li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy,+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li><li>Kom&#225;rek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+taxonomic+revision+of+planktic+nostocacean+cyanobacteria:+a+short+review+of+genera.">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li><li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle.">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li><li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila.">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li><li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo.">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).</li></ol>

כאן אנחנו תיאר פרוטוקול באמצעות SEM כדי להשיג מידע מפורט אודות מאפיינים מורפולוגיים חיצוני של שלושה סוגים של אורגניזמים אחרים יכולים להחיל לבחון תכונות של סוגים רבים של אורגניזמים או רקמות. בתוך כל שלב של הפרוטוקול, יש נקודות פוטנציאליות של השגיאה שעלולים להתעורר, הם דנו בפירוט בהמשך.
<p c...

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) משתמשת ממוקדת קרן אלקטרונים אנרגיה גבוהה כדי ליצור תמונה של אלקטרונים משני המציג את הטופוגרפיה של מדגם1ומורפולוגיה. SEM יכול לשמש לקביעת ישירות מהגודל הפיזי של מדגם, מבנה השטח, ואת צורה תלת-ממדית, מציע רזולוציה גדולה יותר, גדול יותר עומק שדה לעומת מיקרוסקופ אור. צורה נוספת של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משתמש ממוקד אלקטרונים שעוברים הדגימה, יצירת תמונות עם פרטים עדינים של המבנה הפנימי. בעוד TEM יש רזולוציה גבוהה יותר מאשר אור או SEM והוא יכול לשמש כדי לפתור מבנים קטן כמו אטומים בודדים, יש שלושה יתרונות: הכנת הדוגמא נרחב השדה מבט קטן, לעומק רדוד של שדה2,3. למרות השני דמיינו פרוטוקולים קיימים באמצעות SEM לבחון ספציפית תאים, organelles או רקמות4,5,6,7,8,9, 10 , פרוטוקול זה הוא ייחודי בכך אנו מתארים שיטות שבהן ניתן להחיל באופן כללי על מגוון רחב של אורגניזמים להערכת מורפולוגי.
SEM מצא יישומים נרחב לבחינת חומרים אנאורגניים כולל חלקיקים11,12, פולימרים13ויישומים רבים מדעי גיאולוגי, התעשייתי גשמי14, 15,16. בביולוגיה, SEM שימש זמן כשיטה לבדיקת דגימות ביולוגיות ועד חלבונים בודדים כל האורגניזמים17,18. SEM הוא בעל ערך מסוים כי מורפולוגי פרטים פני השטח יכול לשמש כדי ליידע את תגלית מדעית. ניתוח SEM הוא שיטה פשוטה, זולה ומהירה כדי לקבל מידע מפורט על מבנה, גודל, מאפייני השטח של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות.
כי SEM בדרך כלל פועל תחת ואקום גבוה (10-6 טנדר של גוה של מינימום) כדי לתמוך קוהרנטי קרן אלקטרונים במהירות גבוהה, אין נוזלים (מים, שמנים, כהלים) מותר בבית הבליעה הדגימה, כמו נוזלים למנוע ואקום ויוצרים. לפיכך, כל הדגימות שנבדקו באמצעות SEM חייב להיות מיובש, בדרך כלל באמצעות סדרה מדורגת אתנול ואחריו תהליך הייבוש כדי להסיר האתנול. ישנן מספר שיטות של ייבוש רקמות ביולוגיות לשימוש ב- SEM, לרבות ייבוש האויר, lyophilization, שימוש של המכשיר (שיקגו) ייבוש נקודה קריטית או כימי ייבוש באמצעות t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך) או hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. לרוב, בחירה של שיטת הייבוש הוא אמפירי מאז כל דגימה ביולוגית עשוי להגיב באופן שונה על כל שיטת הייבוש. עבור כל דגימה נתון, כל שיטות אלו עשוי להיות מתאים, אז השוואה בין היתרונות והחסרונות של כל אחד הוא שימושי בחירת השיטה המתאימה.
בעוד אוויר ייבוש מדגם בטמפרטורת החדר או בתנור ייבוש (60 ° C) היא השיטה הפשוטה ביותר, רוב דגימות ביולוגיות הראה יבוש-induced נזק כגון מצמקים, לכווץ, והתוצאה היא עיוות של הדגימה. התהליך של lyophilization גם מסיר מים (או קרח) מדגם, אבל דורש דוגמאות להיות קפואה והניח תחת ואקום להסיר את הקרח באמצעות תהליך סובלימציה, ולהערך המדגם. בנוסף, המשתמש חייב להיות גישה איזה שהוא לופילייזר. השיטה הנפוצה ביותר עבור dehydrating דוגמאות עבור SEM הוא נקודה קריטית ייבוש (שיקגו). האתנול במדגם רופאות, מוחלף עם נוזלי דו תחמוצת הפחמן (CO2), ותחת טמפרטורה מסוימת ומצבי לחץ ידוע בתור נקודה קריטית (31.1 מעלות צלזיוס ו 1,073 psi), CO2 מאדה מבלי ליצור מתח, ובכך ביעילות שמירה על התכונות מבנים מורפולוגיים של המדגם. בעוד רופאות הוא בדרך כלל השיטה הרגילה, יש מספר חסרונות. ראשית, התהליך מחייב גישה נקודה קריטית מייבש, אשר הוא לא רק יקר, אבל גם מחייבת שימוש נוזלי פחמן דו-חמצני. שנית, גודל המדגם כי ניתן לייבש מוגבל לגודל החדר של הנקודה הקריטית מייבש. שלישית, חילופי נוזלים במהלך רופאות יכולות לגרום מערבולת אשר יכולים לגרום נזק המדגם.
ייבוש כימי יתרונות רבים על שיקגו ומשמש חלופה הופכת נפוצה בעוד SEM הכנת הדוגמא. שימוש dehydrants כימיים כגון יפורסם HMDS מציע אלטרנטיבה מהירה, זולה ופשוטה בשיטות אחרות, תוך שמירה על שלמות המבנה של המדגם. לאחרונה הראינו כי לא היה הבדל באינטגריטי של הרקמה או את איכות התמונה הסופית שנתפסו בעת שימוש רופאות או יפורסם כשיטת ייבוש דרוזופילה למבוגרים רקמת רשתית23. בניגוד רופאות, יפורסם בהמשך, HMDS אינם מצריכים מכשיר ייבוש או נוזלי CO2 , אין הגבלה על הגודל המדגם להיות מיובשים. בנוסף לקבלת הכימיקלים, נדרשים רק הוד fume כימי סטנדרטי, ציוד מגן אישי המתאים (כפפות, חלוק המעבדה ו בטיחות משקפי מגן) כדי להשלים את תהליך הייבוש. בעוד יפורסם והן HMDS דליק, יפורסם הוא פחות רעילים פחות יקר (כ- 1/3 העלות של HMDS) מאשר HMDS.
במאמר זה, אנו נתאר כיצד לתקן, מייבשים, יבש, הר, להתיז את המעיל, וקונטה תמונה שלושה סוגים של אורגניזמים: כחוליות (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ו sp. לא ידוע), euglenoids שני סוג Monomorphina (Aenigmatica מ' ומ pseudopyrum), ואת זבוב הפירות (דרוזופילה melanogaster). אורגניזמים אלה מייצגים מגוון רחב של גודל (0.5 מיקרומטר עד 4 מ מ) והמגוון הסלולר (חד-תא ל multicellular), אך כל נתונות בקלות ניתוח SEM עם וריאציות קטנות רק לצורך הכנה הדגימה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לשימוש התייבשות כימי וניתוח SEM לבחון פרטים מורפולוגי של שלושה סוגים של אורגניזמים ויהיה בהרחבה החלים על בחינת רבים organismal סוגי רקמות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1285px;" width="1284">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">&#160;gold&#8211;palladium</td>
			<td style="width:373px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:395px;">91212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver conductive adhesive 503</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12686-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 &#956;m, polycarbonate, black</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum weighing dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (12 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (25 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adhesive tabs&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>76760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">conductive carbon adhesive tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">F/2 media</td>
			<td style="width:373px;">Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin</td>
			<td style="width:395px;">https://utex.org/products/f_2-medium</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AF6 media</td>
			<td style="width:373px;">Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td>
			<td style="width:395px;">https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soil water medium</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>153785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hummer 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hitachi 3400N-II SEM&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td style="width:395px;">https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&#38;md=sms2-1&#38;sd=sms2-1-2&#38;gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE</td>
			<td>The company doesn&#39;t appear to sell this model any longer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)

סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) היא הנפוצה טכניקה שהוחלו ללמוד דגימות ביולוגיות ועד חלבונים בודדים תאים, רקמות, organelles, אורגניזם שלם אפילו. פרוטוקול זה מתמקד שתי שיטות הייבוש כימי, hexamethyldisilazane (HMDS) ו- t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך), ויישומם הדמיה של אורגניזמים הן prokaryotic והן האיקריוטים תוך שימוש ב- SEM. במאמר זה, אנו נתאר כיצד לתקן, מייבשים, יבש, הר, להתיז את המעיל, וקונטה תמונה שלושה סוגים של אורגניזמים: כחוליות (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ו sp. לא ידוע), euglenoids שני סוג Monomorphina (Aenigmatica מ' ומ pseudopyrum), ואת זבוב הפירות (דרוזופילה melanogaster). המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה פשוטה, זולה ומהירה כדי לקבל מידע מפורט על מבנה, גודל, שטח מאפייני דגימות יכול להחיל בהרחבה על מגוון רחב של אורגניזמים עבור מורפולוגי הערכה. סיומו המוצלח של פרוטוקול זה יאפשר לאחרים להשתמש SEM להמחיש דוגמאות על-ידי החלת טכניקות אלה במערכת שלהם.

כחוליות הם קבוצה prokaryotic של אורגניזמים החיים הם קריטיים אל פחמן גלובל, חמצן, חנקן מחזורים28,29. המינים 6000 המשוערת של כחוליות30, וברובם יש נדן mucilaginous לכסות, לחבר את התאים ותוקנו מבנים אחרים31, אשר יחד עם הצורה, יכול להיות ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

ניתוח SEM הוא שיטה יעילה כדי לסייע לזן או פנוטיפי אפליה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבחינת המסוימות מורפולוגי של שלושה סוגי האורגניזמים נציג ויהיה בהרחבה החלים על בחינת תכונות של רבים organismal סוגי רקמות.

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

פרוטוקול זה מתמקד בשתי שיטות ייבוש כימיות, הקסמתילדיסילאזאן ואלכוהול T-butyl והיישום שלהם הדמיה הן אורגניזמים פרוקריוטיים ואיקריוטיים באמצעות SEM. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שימוש בציוד ייבוש מיוחד כגון מייבש נקודה קריטי להכנת דגימות לניתוח. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לשימוש התייבשות כימית וניתוח SEM של שלושה סוגים של אורגניזמים, אך יהיה ישים באופן נרחב לבדיקת סוגים רבים של אורגניזמים ורקמות.הפגנת ההליך תהיה מדיסון קון, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין ציאנובקטריה על ידי קיבעון לילה. לאחר מכן, להעביר אותם לתוך אסדת סינון 10 מ"ל המכיל פוליקרבונט 25 מ"ל מסנן.לאטום את הצד ואת המשפך של אסדת הסינון עם פקקי גומי כדי להכיל את התרבות במשפך. לאחר הסרת שני פקקים, להסיר את התיקון על ידי שאיבת אבק עדינה על בקבוק הסינון. כדי להכין euglenoids אצות חד-תאיות, לתקן אותם על ידי הוספת 3 טיפות של 4%osmium tetroxide ישירות לתרבות שהועברה בעבר לתוך אסדת סינון 10 מ"ל.לאחר דגירה של 30 דקות, הסר את שני העצורים והסר את התיקון על ידי שאיבת אבק עדינה על בקבוק הסינון. לשטוף את euglenoids קבוע שלוש פעמים עם 5 מ"ל של 0.1 M פוספט חיץ pH 7.0 בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות כל תוך שמירה על הבקבוק ואת המשפך סגור עם פקק להחזיק את הכביסה. לאחר הסרת שני פקקים, להסיר כל לשטוף על ידי ואקום עדין על בקבוק הסינון.כדי לייבש את המדגם תוך שמירה על טבילה רציפה, השתמש בסדרת אתנול מדורגת במשך עשר דקות בנפח של 5 מ"ל במשפך תוך שמירה על הבקבוק והמשפך סגורים עם העצורים כדי להכיל את האתנול במשפך. לאחר הסרת שני פקקים בעדינות ואקום על בקבוק הסינון כדי להסיר אתנול. מעבירים את הדגימה לצלחת שקילה חד פעמית מאלומיניום המכילה מספיק אתנול 100% כדי לכסות את הדגימה.כדי לבצע ייבוש כימי של euglenoids באמצעות TBA, תחילה להחליף את הפתרון 100%אתנול בצלחת אלומיניום עם 1 כדי 1 פתרון של TBA ו 100% אתנול במשך עשרים דקות. לאחר מכן, החלף את הפתרון 1 עד 1 ב- 100%TBA למשך עשרים דקות וחזור על התהליך פעמיים. הסר TBA והחלף עם מספיק טרי 100%TBA כדי לכסות את המדגם.מניחים את המנה על ארבע מעלות צלזיוס במשך עשר דקות כדי להקפיא את TBA. מעבירים את הדגימה ליירד ואקום עם חבילות ג'ל קפואות כדי לשמור על TBA קפוא. השתמש במשאבה סיבובית כדי לפנות ולשמור על ואקום כדי לאפשר לדגימה להתייבש על ידי סובלימציה ואקום של TBA קפוא לפחות שלוש שעות.כדי להרים ציאנובקטריה באוגלנואידים, סמן את החלק התחתון של 25 מ"מ אלומיניום הרכבה stub כדי לציין מה ממוקם על גבי. לאחר מכן מקם כל מסנן על לשונית דבק פחמן מאובטחת בחלק העליון של ה stub. כדי להכין Drosophila melanogaster, לטבול זבובים הרדמה ב 1 מ"ל של תיקון במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, לוודא שהם שקועים לחלוטין.השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את התיקון. לשטוף את מדגם Drosophila קבוע בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 0.1 M פוספט חיץ, pH 7.2 בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר כל לשטוף, נזהר לא להסיר את המדגם.לאחר מכן, לייבש את המדגם בצינור microfuge בנפח של 1 מ"ל באמצעות סדרת אתנול מדורגת במשך עשר דקות כל אחד. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר כל לשטוף, נזהר לא להסיר את המדגם. שמור את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם מספיק אתנול 100% כדי לכסות אותו.כדי לבצע ייבוש כימי של הזבובים באמצעות HMDS, החלף תחילה את תותב האתנול 100%עם פתרון 1 עד 2 של HMDS ו 100%אתנול במשך עשרים דקות. לאחר מכן החלף את הפתרון עם פתרון 2 ל 1 של HMDS ו 100%אתנול במשך עשרים דקות. לבסוף, החלף פתרון זה ב- 100%HMDS למשך עשרים דקות ולאחר מכן חזור על התהליך פעם אחת.מעבירים את הדגימה שנמצאת בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מ"ל ו HMDS לתוך צלחת שקילה אלומיניום חד פעמי. החלף את 100% HMDS עם מספיק טרי 100% HMDS כדי לכסות את המדגם. מניחים את המדגם בתוך צלחת האלומיניום ישירות ברדס אדים כימי להתייבש עם מכסה רופף כגון קופסה כדי למנוע פסולת ליפול על המדגם ולאפשר לו להתייבש במשך 12 עד 24 שעות.כדי להר דרוסופילה, סמן את החלק התחתון של תותב הרכבה מאלומיניום. השתמש פינצטה מדויקת כדי למקם את הזבובים היבשים במיקום הרצוי על לשונית דבק פחמן מאובטח לראש ספח תחת מיקרוסקופ ניתוח. החל דבק מוליך כסף סביב הקצוות החיצוניים של stubs.השתמשו בקיסם כדי לחבר את צבע הכסף לזבובים, כדי להבטיח מוליכות, ולוודא שהצבע לא נוגע באזור ההדמיה הרצוי. מניחים את stubs בתיבת מחזיק יתן, ולאחר מכן מניחים את תיבת מחזיק סטוב פתוח במייבש ולאפשר צבע כסף להתייבש לפחות שלוש שעות. כדי להכין את מנגנון ציפוי sputter, לבצע 4 עד 5 סומק של גז ארגון.בהתאם לדגימות שיש לצפות, הגדר את שעון הזמן להגדרות שונות כמתואר בכתב היד. Sputter מצופה את ספלים בעקבות הוראות היצרנים. לבסוף, דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה הכולל גלאי אלקטרונים משני עם הגדרות התלויות המדגם בשימוש.הכנה מוצלחת של ציאנובקטריה עבור SEM באמצעות פרוטוקול זה הניבה תמונות שבהן פרטים של התא, כולל צורה ומרקם של פני השטח גלויים, כמו גם נדן של ריר והקרנות מהתאים. תמונת SEM של מיני מים מתוקים סיסיליים מקולורדו מראה נדן גלוי של ריר. תמונת SEM של חיידק מים מתוקים מאוהיו חושפת תאים בודדים שלעיתים יוצרים מושבות המוחזקות יחד על ידי שכבה דקה של ריר.בלטים דמויי תכלת נמשכים מהתאים הבודדים. תמונות של מינים סיביות לא ידועים מ שפך מליחות גבוהה במימי החוף של טקסס מראות תאים בודדים ומפרידים. SEM שימש כדי לדמיין את רצועות pellicle של שני מינים אוגלנואידים שונים.כאשר משווים מונומורפינה ו Aenigmatica עם מונומורפינה פסאודו pyrum, הסידור סלילי גלוי של רצועות pellicle להגיח בקצה האחורי כדי ליצור זנב, לסייע פילוגניה לסיום. תמונות SEM של עיניים drosophila נורמלי להראות מערך מסודר של זיפים עדשות אבל ביטוי של חלבונים הקשורים למחלת אלצהיימר ליצור פנוטיפ העין המחוספסת. גנים המדכאים או משפרים את פנוטיפ העין המחוספסת עשויים למלא תפקיד פיזיולוגי בהתקדמות המחלה.להלן דוגמאות לנפילות בור פוטנציאליות שיש להימנע מהן, כולל דוגמה למבנה הקרוס של העין מטכניקת ייבוש לא נכונה וטעינת אלקטרונים מקידוש לא מספיק של sputter המופיע במהלך רכישת תמונה. הפרוטוקולים המתוארים כאן השתמשו באורגניזמים בעלי שותפות מכובדת, אך כולם נוחים לניתוח SEM כדי לאסוף מידע שימושי ומורפולוגי שהוא קריטי לתגליות מדעיות המשתרעות על פני דיסציפלינות משנה רבות של ביולוגיה. אל תשכח כי עבודה עם אלכוהול T-Butyl, Hexamethyldisilazane, ו osmium tetroxide יכול להיות מסוכן ואת אמצעי הבטיחות המתאימים תמיד יש לראות כדי להגן על משתמשים, במיוחד סטודנטים אשר יהיה טיפול בכימיקלים אלה.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...