Name: preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning MLS og en sommer Scholar Award til MAK fra Office for forskning og høyere grads studier ved Central Michigan University. Cyanobakterie ble levert av den Zimba og plankton lab, del av Center for kyst studier, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids ble levert av Triemer lab, Michigan State University.

1. forberedelse og fiksering
<ol><li>Forberede Cyanobakterie.<ol>
<li>Vokser unialgal kulturer i F/2 media24,25 ved en temperatur på 28 ° C på en 14:10 h lys mørke syklus. Overføre tilstrekkelig kultur til en 1,5 mL microcentrifuge rør slik at etter at 15 min å avgjøre, bakteriell pellets er omtrent 0,05 mL i størrelse. Fjerne media og erstatte med 1,5 mL bindemiddel (1,25% glutaraldehyde, 0.1 M fosfat buffer pH 7.0), forsiktig Inverter flere ganger og...

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).</li><li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy.">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li><li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM)+Protocols+for+Problematic+Plant,+Oomycete,+and+Fungal+Samples.">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System.">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li><li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment.">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li><li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm.">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Miquel Guennoc, ., C, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy.">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li><li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors.">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li><li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering.">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).</li><li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles.">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li><li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors.">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li><li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone:+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+(and+hard+inorganic+material).">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li><li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+for+materials+characterization.">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li><li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varietal+heavy+mineral+analysis+of+sediment+provenance,+Lower+Cretaceous+Scotian+Basin,+eastern+Canada.">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li><li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy.">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li><li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy.">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy.">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).</li><li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action.">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).</li><li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).</li><li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy:+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method.">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li><li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatotoxic+cyanobacteria:+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments.">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li><li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria.">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li><li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+of+Cyanobacteria+are+there?+Using+a+discovery+curve+to+predict+the+species+number.">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li><li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucilage+acts+to+adhere+cyanobacteria+and+cultured+plant+cells+to+biological+and+inert+surfaces.">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li><li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy,+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li><li>Kom&#225;rek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+taxonomic+revision+of+planktic+nostocacean+cyanobacteria:+a+short+review+of+genera.">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li><li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle.">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li><li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila.">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li><li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo.">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).</li></ol>

Her beskrev vi en protokoll som SEM for å få detaljert informasjon om eksterne morfologiske kjennetegn av tre typer organismer som andre kan bruke til å undersøke funksjonene i mange typer organismer eller vev. I hvert trinn av protokollen er det steder feil som kan oppstå og diskuteres i detalj nedenfor.
Mens volumene for bindemiddel og vasker gitt her er bestemt, skal generelt bindemiddel og vasker 5-10 x volumet av prøven. Fiksering, vask og dehydrering tidene er basert på vår erfar...

En scanning elektron mikroskop (SEM) bruker en fokusert stråle av kraftkrevende elektroner generere et bilde fra videregående elektroner som viser morfologi og topografi eksempel1. SEM kan brukes til direkte bestemmer den fysiske størrelsen av en prøve, overflatestruktur, tredimensjonal form, og tilbyr større oppløsning og større dybdeskarphet sammenlignet * lys. En annen form for elektronmikroskop (EM), overføring elektronmikroskop (TEM) bruker fokusert elektroner som passerer gjennom utvalget, genererer bilder med fine detaljer av intern struktur. Mens TEM har høyere oppløsning enn lys eller SEM og kan brukes til å løse strukturer så liten som enkelt atomer, har tre store ulemper: omfattende utvalg forberedelse, en liten synsfelt og en grunne dybde på feltet2,3. Selv om andre visualisert protokoller eksisterer ved hjelp av SEM undersøke bestemte celler, organeller eller vev4,5,6,7,8,9, 10 , denne protokollen er unik i at vi beskriver metoder som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer morfologiske vurdering.
SEM har funnet bred programmer for å undersøke uorganisk materiale inkludert nanopartikler11,12, polymerer13og mange programmer i geologiske, industrielle og materielle vitenskap14, 15,16. I biologi, har SEM lenge vært brukt for å undersøke biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til hele organismer17,18. SEM er av spesiell verdi fordi morfologiske detaljer fra overflaten kan brukes til å informere vitenskapelige funn. SEM er en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner et bredt spekter av biologiske prøver.
Fordi en SEM normalt opererer under høyvakuum (10-6 Torr minimum) å støtte en sammenhengende stråle av høyhastighets elektroner, tillates ingen væske (vann, oljer, alkoholer) i eksemplet kammeret, som væsker hindre et vakuum dannes. Således, alle prøver undersøkt ved hjelp av SEM må bli dehydrert vanligvis bruke en gradert etanol serie etterfulgt av en tørkeprosessen fjerne etanol. Det finnes flere metoder for tørking biologisk vev for bruk i SEM, inkludert luft tørker, lyophilization, bruk av et kritisk punkt tørking (CPD) enhet eller kjemiske tørking t-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftest utvalg av tørking metode er empirisk siden hvert biologiske utvalg kan reagere forskjellig på hver tørking metode. For enhver gitt prøven, alle disse metodene vil være riktig så sammenligne fordeler og ulemper av hver er nyttig i å velge den riktige metoden.
Air tørking et utvalg ved romtemperatur eller i tørking ovn (60 ° C) er den enkleste metoden, de fleste biologiske prøver viser tørking-indusert skade som shriveling og kollaps, som resulterer i forvrengning av prøven. Prosessen med lyophilization også fjerner vann (eller is) fra en prøve, men krever å være flash-frosne og plassert under vakuum fjerne is via prosessen med sublimering, potensielt skadelige prøven. I tillegg må brukeren ha tilgang til en lyophilizer. Den vanligste metoden for dehydrating prøver for SEM er kritisk punkt tørking (CPD). CPD, er etanol i en prøve erstattet med flytende karbondioksid (CO2), og under bestemte temperatur og trykk forhold kjent som kritisk punkt (31,1 ° C og 1073 psi), CO2 fordamper uten å opprette overflatespenning, og dermed effektivt opprettholde de morfologiske og strukturelle funksjonene av utvalget. CPD er vanligvis standard metode, har den flere ulemper. Først krever prosessen tilgang til et kritisk punkt tørketrommel, som er ikke bare dyrt, men også nødvendiggjør bruk av flytende karbondioksid. Andre er størrelsen på prøven som kan tørkes begrenset til kammeret størrelsen på det kritiske punktet tørketrommel. Tredje, utveksling av væsker under CPD kan forårsake turbulens som kan skade prøven.
Kjemisk tørking gir mange fordeler over CPD og fungerer som et egnet alternativ som er blitt mye brukt i SEM eksempel forberedelse. Bruk av kjemiske dehydrants som TBA og HMDS tilbyr en rask, billig og enkelt alternativ til andre metoder, samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til prøven. Vi har nylig viste at det var ingen forskjell i integriteten til vev eller kvaliteten på det endelige bildet tatt når du bruker CPD eller TBA som tørking metode i voksen Drosophila netthinnen vev23. I motsetning til CPD, TBA og HMDS krever ikke en tørking instrument eller flytende CO2 , og det er ingen begrensning på størrelsen på utvalget å. I tillegg til å skaffe kjemikalier, må et standard kjemiske avtrekksvifte og riktig personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) fullføre tørkeprosessen. Mens både TBA og HMDS er brannfarlig, TBA er mindre giftig og billigere (ca 1/3 kostnaden for HMDS) enn HMDS.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Disse organismene representerer et bredt spekter (0,5 µm 4 mm) og mobilnettet mangfold (encellede til flercellet), men alle er lett mottakelig for SEM analyse med kun små variasjoner nødvendig for prøven forberedelse. Denne protokollen beskriver metodene for å bruke kjemiske dehydrering og SEM analyse for å undersøke morfologiske detaljene av tre typer organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke mange organismebiologi og vev.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1285px;" width="1284">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">&#160;gold&#8211;palladium</td>
			<td style="width:373px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:395px;">91212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver conductive adhesive 503</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12686-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 &#956;m, polycarbonate, black</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum weighing dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (12 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (25 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adhesive tabs&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>76760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">conductive carbon adhesive tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">F/2 media</td>
			<td style="width:373px;">Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin</td>
			<td style="width:395px;">https://utex.org/products/f_2-medium</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AF6 media</td>
			<td style="width:373px;">Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td>
			<td style="width:395px;">https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soil water medium</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>153785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hummer 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hitachi 3400N-II SEM&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td style="width:395px;">https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&#38;md=sms2-1&#38;sd=sms2-1-2&#38;gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE</td>
			<td>The company doesn&#39;t appear to sell this model any longer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)

Skanning elektronmikroskop (SEM) er en allment tilgjengelig teknikk som brukes for å studere biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til celler, vev, organeller og hele organismer. Denne protokollen fokuserer på kjemiske drying metodene, hexamethyldisilazane (HMDS) og t-butyl alkohol (TBA) og deres bruk bildebehandling av både prokaryotic og eukaryotic organismer med SEM. I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokollen er å beskrive en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner prøver som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer for morfologiske vurdering. Vellykket gjennomføring av denne protokollen vil tillate andre å bruke SEM for å visualisere prøver ved å bruke disse teknikkene på deres system.

Cyanobakterie er en prokaryote organismer som er kritiske til globale karbon, oksygen og nitrogen sykluser28,29. Av anslått 6000 arter av Cyanobakterie30, de fleste har en Slim skjede som dekker og koble cellene sammen og andre strukturer31, som sammen med figuren, kan løses mikroskopisk32. Cellestørrelse, form og pigmenter finnes skille individuelle arter ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Utarbeidelse av Prokaryotic og Eukaryotic organismer med kjemiske tørking for morfologisk analyse skanning elektronmikroskop (SEM)

SEM er en effektiv metode for å hjelpe i arter identifikasjon eller fenotypiske diskriminering. Denne protokollen beskriver metodene for å undersøke bestemte morfologiske detaljer av tre representant organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke funksjonene i mange organismebiologi og vev.

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Denne protokollen fokuserer på to kjemiske tørkemetoder, Heksametyldisilazan og T-butylalkohol og deres anvendelse avbildning både prokaryotiske og eukaryotiske organismer ved hjelp av SEM. Den største fordelen med denne teknikken er at den ikke krever bruk av spesialisert tørkeutstyr som en kritisk punkttørker for å forberede prøver for analyse. Denne protokollen beskriver metodene for bruk av kjemisk dehydrering og SEM-analyse av tre typer organismer, men vil være bredt aktuelt for å undersøke mange organisme- og vevstyper.Å demonstrere prosedyren vil være Madison Koon, en lavere student fra laboratoriet mitt. For å starte, forberede cyanobakterier ved overnatting fiksering. Deretter overfører du dem til en 10 ml filtreringsrigg som inneholder et polykarbonat 25 ml filter.Forsegle sidearmen og trakten på filtreringsriggen med gummipropper for å inneholde kulturen i trakten. Etter å ha fjernet begge proppene, fjern fikseringen ved forsiktig støvsuging på filtreringskolben. For å forberede encellede alge euglenoider, fikse dem ved å legge til 3 dråper 4% osmium tetroxide direkte til kulturen som tidligere har blitt overført til en 10 ml filtreringsrigg.Etter en 30 minutters inkubasjon fjerner du begge proppene og fjerner fikseringen ved å forsiktig støvsuge på filtreringskolben. Vask de faste euglenoidene tre ganger med 5 ml fosfatbuffer pH 7,0 ved romtemperatur i ti minutter hver mens du holder kolben og trakten lukket med proppene for å holde vasken. Etter å ha fjernet begge proppene, fjern hver vask ved skånsom vakuum på filtreringskolben.For å dehydrere prøven samtidig som du opprettholder kontinuerlig nedsenking, bruk en gradert etanolserie i ti minutter i et volum på 5 ml i trakten samtidig som kolben og trakten lukkes med proppene for å inneholde etanol i trakten. Etter å ha fjernet begge proppene forsiktig støvsuge på filtrering kolben for å fjerne etanol. Overfør prøven til en engangs aluminiumsveierett som inneholder akkurat nok 100% etanol til å dekke prøven.For å utføre kjemisk tørking av euglenoidene ved hjelp av TBA, må du først erstatte 100% etanoloppløsning i aluminiumsfatet med en 1 til 1-løsning av TBA og 100% etanol i tjue minutter. Deretter erstatter du 1 til 1-løsningen med 100% TBA i tjue minutter og gjentar prosessen to ganger. Fjern TBA og bytt ut med akkurat nok fersk 100% TBA til å dekke prøven.Plasser parabolen på fire grader celsius i ti minutter for å fryse TBA. Overfør prøven til en vakuumdesiccator med frosne gelpakker for å holde TBA frosset. Bruk en roterende pumpe til å evakuere og vedlikeholde vakuum slik at prøven tørker ved vakuum sublimering av den frosne TBA i minst tre timer.For å montere cyanobakterier i euglenoider, merk bunnen av en 25 mm aluminiummonteringsstubbe for å indikere hva som plasseres på toppen. Plasser deretter hvert filter på en karbonlimtappe festet til toppen av stubben. For å forberede Drosophila melanogaster, senk bedøvede fluer i 1 ml fikseringsmiddel i to timer ved fire grader celsius, og sørg for at de er helt nedsenket.Bruk en glasspipette til å fjerne fikseringsmiddelet. Vask den faste Drosophila-prøven i et 1,5 ml mikrocentrifugerør tre ganger med 1 ml fosfatbuffer, pH 7,2 ved romtemperatur i ti minutter. Bruk en glasspipette til å fjerne hver vask, vær forsiktig så du ikke fjerner prøven.Deretter dehydrerer prøven i et mikrodrivstoffrør i et volum på 1 ml ved hjelp av en gradert etanolserie i ti minutter hver. Bruk en glasspipette til å fjerne hver vask, vær forsiktig så du ikke fjerner prøven. Hold prøven i 1,5 ml mikrocentrifugerør med akkurat nok 100% etanol til å dekke den.For å utføre kjemisk tørking av fluene ved hjelp av HMDS, må du først erstatte 100% etanolløsning med en 1 til 2-løsning av HMDS og 100% etanol i tjue minutter. Deretter erstatter du løsningen med en 2 til 1-løsning av HMDS og 100% etanol i tjue minutter. Til slutt erstatter du denne løsningen med 100 % HMDS i tjue minutter, og gjentar deretter prosessen én gang.Overfør prøven som er i et 1,5 ml mikro sentrifugerør og HMDS til en engangs aluminiumsveierett. Erstatt 100% HMDS med akkurat nok friske 100% HMDS til å dekke prøven. Plasser prøven i aluminiumsfatet direkte i en kjemisk røykhette for å tørke med et løst lokk som en boks for å hindre at rusk faller på prøven og la den tørke i 12 til 24 timer.For å montere Drosophila, merk bunnen av en aluminiummontering stub. Bruk presisjons pinsett for å plassere de tørkede fluene i ønsket posisjon på en karbonlimtappe festet til toppen av en stubbe under et dissekerende mikroskop. Påfør sølv ledende lim rundt de ytre kantene av stubber.Bruk en tannpirker til å koble sølvmalingen til fluene, sikre konduktivitet, og sørg for at malingen ikke berører ønsket bildeområde. Plasser stubbene i en stubbeholderboks, og plasser deretter den åpne stub holderboksen i en desiccator og la sølvmalingen tørke i minst tre timer. For å forberede sputter belegg apparatet, utfør 4 til 5 flushes av argongass.Avhengig av prøvene som skal belagt, setter du timeren til forskjellige innstillinger som beskrevet i manuskriptet. Sputter belegg sstuene etter produsentens instruksjoner. Til slutt, bildeprøver ved hjelp av et skanneelektronmikroskop som inkluderer en sekundær elektrondetektor med innstillinger som avhenger av prøven som brukes.Vellykket fremstilling av cyanobakterier for SEM ved hjelp av denne protokollen ga bilder der detaljer om cellen, inkludert form og tekstur av overflaten er synlige, samt en kappe av mucilage og projeksjoner fra cellene. SEM bilde av en filamentous ferskvannsarter fra Colorado viser en synlig kappe av mucilage. SEM bilde av en ferskvannsbakterier fra Ohio avslører individuelle celler som noen ganger danner kolonier holdt sammen av et tynt lag av mucilage.Filamentlignende fremspring strekker seg fra de enkelte cellene. Bilder av ukjente filamentøse arter fra en høy saltholdig elvemunning i Texas kystfarvann viser individuelle og dele celler. SEM ble brukt til å visualisere pellicle strimler av to forskjellige Euglenoid arter.Når man sammenligner Monomorphina og Aenigmatica med Monomorphina pseudo pyrum, den synlige spiralformede ordningen av pellicle strimler som dukker opp på bakre slutten for å danne en hale, hjelp i fylogeny til oppsigelse. SEM-bilder av normale drosophila øyne viser et bestilt utvalg av børster og linser, men uttrykk for proteiner forbundet med Alzheimers sykdom skaper grov øye fenotype. Gener som undertrykker eller forbedrer grov øyefenotype kan spille en fysiologisk rolle i sykdomsprogresjon.Her er eksempler på potensielle pit faller å unngå, inkludert et eksempel på den kollapsede strukturen i øyet fra feil tørking teknikk og elektron lading fra utilstrekkelig sputter koding som vises under bildeoppkjøp. Protokollene beskrevet her benyttet organismer som svært sterkt med respektert medvirkning, men alle er mottagelige for SEM analyse for å samle nyttig, morfologiske informasjon som er avgjørende for vitenskapelige funn som spenner over mange sub disipliner av biologi. Ikke glem at arbeid med T-Butyl alkohol, Hexamethyldisilazane, og osmium tetroxide kan være farlig og de riktige sikkerhetstiltakene bør alltid observeres for å beskytte brukere, spesielt studenter som skal håndtere disse kjemikaliene.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Skanning elektronmikroskopi av oppmalte Tissue å visualisere den ekstracellulære matriks

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Studerer Supramolecular Organisering av foto Membraner innen Freeze frakturerte Leaf Vev av Cryo-scanning elektronmikroskopi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Skanning elektronmikroskopi (SEM) Protokoller for Problema Plant, eggsporesopper, og Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Utarbeidelse og Observasjon av Thick biologiske prøver av Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserte eksempel forberedelse til overføring elektronmikroskop

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Matrisetomografiarbeidsflyt for målrettet anskaffelse av voluminformasjon ved hjelp av skanningselektronmikroskopi

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...