Name: preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Bu eser MLS ve bir yaz bilim adamı Ödülü için bir hibe MAK için Office araştırma ve Central Michigan Üniversitesi'nde yüksek lisans çalışmaları finanse edildi. Siyanobakteriler kıyı çalışmaları, Texas A & M Üniversitesi'nde Corpus Christi için Zimba ve plankton lab, merkezi parçası tarafından temin edildi. Euglenoids Triemer lab, Michigan State University tarafından temin edildi.

1. hazırlık ve fiksasyon
<ol><li>Siyanobakteriler hazırlayın.<ol>
<li>F/2 medya24,25 28 ° c sıcaklıkta kültürlerde unialgal 14:10 s büyümek ışık karanlık döngüsü. Yerleşmek 15 dk sonra izin, bakteriyel Pelet boyutu yaklaşık 0.05 mL öyle ki yeterli kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Medyayı çıkarın ve sabitleştirici (%1.25 oxazolidin, 0.1 M fosfat tampon pH 7,0) 1,5 mL ile değiştirin, yavaşça birkaç kez ters çevir ve ...

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).</li><li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy.">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li><li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM)+Protocols+for+Problematic+Plant,+Oomycete,+and+Fungal+Samples.">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System.">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li><li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment.">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li><li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm.">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li><li>Miquel Guennoc, ., C, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy.">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li><li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors.">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li><li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering.">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).</li><li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles.">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li><li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors.">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li><li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone:+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+(and+hard+inorganic+material).">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li><li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+for+materials+characterization.">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li><li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varietal+heavy+mineral+analysis+of+sediment+provenance,+Lower+Cretaceous+Scotian+Basin,+eastern+Canada.">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li><li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy.">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li><li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy.">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy.">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).</li><li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action.">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).</li><li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).</li><li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy:+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method.">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li><li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatotoxic+cyanobacteria:+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments.">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li><li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria.">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li><li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+of+Cyanobacteria+are+there?+Using+a+discovery+curve+to+predict+the+species+number.">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li><li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucilage+acts+to+adhere+cyanobacteria+and+cultured+plant+cells+to+biological+and+inert+surfaces.">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li><li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy,+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li><li>Kom&#225;rek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+taxonomic+revision+of+planktic+nostocacean+cyanobacteria:+a+short+review+of+genera.">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li><li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure.">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li><li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle.">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li><li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila.">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li><li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo.">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).</li></ol>

Burada biz SEM diğer birçok türde organizmalar veya doku özelliklerini incelemek için uygulayabileceğiniz organizmalar üç tür dış morfolojik özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için bir iletişim kuralı'nı nitelendirdi. Her adımda Protokolü'nün, noktalarıdır potansiyel hata ortaya çıkabilir ve aşağıda ayrıntılarıyla ele alınmıştır.
Genel olarak bu birim için sabitleştirici ve burada verilen yıkar belirli olmakla birlikte, sabitleştirici ve yıka...

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) yüksek enerjili elektronların odaklanmış ışın demeti ikincil elektron Morfoloji ve örnek1topografya gösteren bir görüntü oluşturmak için kullanır. SEM doğrudan bir örnek, yüzey yapısı ve üç boyutlu şekil ve teklifler daha fazla çözünürlüğünü fiziksel boyutunu ve daha büyük ışık mikroskobu ile karşılaştırıldığında alan derinliğini belirlemek için kullanılabilir. Elektron mikroskobu (EM) başka bir formu, iç yapısının ince detayları ile görüntüleri oluşturma örneği üzerinden geçmek odaklı elektron transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanır. TEM ışık veya SEM daha daha yüksek çözünürlüğe sahip ve yapıları tek atomları küçük çözümlemek için kullanılan iken, üç önemli dezavantajları vardır: geniş numune hazırlama, küçük bir görüş alanı ve sığ derinliği alanı2,3. Diğer görüntülenir, ancak belirli hücreleri, organelleri veya doku4,5,6,7,8,9, incelemek için SEM kullanarak protokoller bulunmaktadır 10 , biz geniş organizmalar morfolojik değerlendirmesi için geniş bir ürün yelpazesi uygulanabilir yöntemleri tarif bu protokolü benzersizdir.
SEM nano tanecikleri11,12, polimerler13ve çok sayıda uygulama jeolojik, endüstriyel ve Malzeme Bilimleri14' te, gibi inorganik maddeler incelenmesi için geniş uygulamalar buldu 15,16. Biyolojide, SEM uzun bireysel proteinler bütün organizmalar17,-18arasında değişen biyolojik örnekleri inceleyerek bir yöntem olarak kullanılmıştır. Morfolojik yüzey detayları bilimsel keşif bilgilendirmek için kullanılabilir çünkü SEM belirli değeri var. SEM çözümleme yapısı, boyut ve biyolojik örnekleri geniş bir yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için hızlı, ucuz ve basit bir yöntemdir.
Bir SEM normalde tutarlı bir yüksek hızlı elektron huzmesi desteklemek için yüksek vakum altında (10-6 Torr en az) çalıştığından, hiçbir sıvı (su, yağlar, alkoller) gibi sıvılar bir vakum önleyebilirsiniz örnek odasında izin verilir. Böylece, tüm örnekleri SEM kullanarak muayene, genellikle etanol kaldırmak için bir kurutma işlemi tarafından izlenen bir kademeli etanol serisi kullanan susuz gerekir. Biyolojik dokuların kullanılmak üzere hava kurutma, lyophilization, kritik nokta kurutma (GBM) aygıt veya t-butil alkol (TBA) veya hexamethyldisilazane (HMDS)19, kullanarak kurutma kimyasal kullanımı da dahil olmak üzere SEM, kurutma birkaç yöntem vardır 20 , 21 , 22. biyolojik her örnek farklı kurutma her yönteme tepki bu yana çoğu zaman, bir kurutma yöntemi ampirik seçimdir. Avantajları ve dezavantajları karşılaştırarak uygun yöntem seçiminde yararlı bu yüzden herhangi bir verilen örnek için tüm bu yöntemlerin uygun olabilir.
Oda sıcaklığında veya kurutma fırın (60 ° C) bir örnek kurutma hava en basit yöntem olmakla birlikte, çoğu biyolojik örnekler kuruyup gibi kurutma-indüklenen zarar göster ve daraltmak, numune bozulma sonucu. Lyophilization süreci aynı zamanda su (veya buz) bir örnek kaldırır ama flaş dondurulmuş olmak örnekleri gerektirir ve vakum altında buz üzerinden kaldırmak için örnek zararlı süblimasyon, işlemi yerleştirilen. Buna ek olarak, Kullanıcı bir lyophilizer erişimi olmalıdır. Örnekleri SEM için dehydrating en sık kullanılan kritik noktası (GBM) kurutma yöntemidir. CPD içinde örnek bir etanol ile sıvı karbondioksit (CO2) ve belirli sıcaklık ve basınç koşulları kritik nokta (31,1 ° C ve 1,073 psi), CO2 yüzey gerilimi, böylece oluşturmadan buharlaştırır olarak bilinen altında değiştirilir etkili bir şekilde örnek morfolojik ve yapısal özelliklerini koruyarak. CPD genellikle standart yöntem olmakla birlikte, birçok sakıncaları vardır. İlk olarak, süreci önemli olan sadece pahalı değil ama aynı zamanda sıvı karbondioksit kullanımı gerektirir noktası kurutma makinesi, erişim gerektirir. İkinci olarak, kurutulmuş örnek boyutu kurutma makinesi kritik nokta Oda boyutu sınırlıdır. Üçüncü olarak, CPD sırasında sıvı alışverişi örnek zarar verebilir türbülans neden olabilir.
Kimyasal kurutma CPD birçok avantaj sunar ve yaygın SEM örnek hazırlanmasında kullanılır hale uygun bir alternatif olarak hizmet vermektedir. TBA ve HMDS gibi kimyasal dehydrants kullanımı hala örnek yapısal bütünlüğünü koruyarak diğer yöntemleri için hızlı, ucuz ve basit bir alternatif sunmaktadır. Biz son zamanlarda doku veya CPD veya TBA yetişkin Drosophila Retina doku23yılında kurutma yöntemi olarak kullanırken yakalanan son görüntü kalitesini bütünlüğünü hiçbir fark olduğunu gösterdi. CPD, aksine TBA ve HMDS kurutma bir enstrüman veya sıvı CO2 gerekmez ve kurutulmuş için örnek boyutu sınır yoktur. Kimyasallar alma ek olarak, yalnızca standart kimyasal duman hood ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, önlük ve koruyucu gözlük) kurutma işlemi tamamlamak için gereklidir. TBA ve HMDS yanıcı olmakla birlikte, daha ucuz ve daha az toksik TBA (yaklaşık 1/3 HMDS maliyetini) HMDS daha.
Bu makalede, biz tamir, yıkama, kurutmak, Kuru, mount, ceket şaplatın ve organizmalar üç tür görüntü açıklanmıştır: Siyanobakteriler (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ve bilinmeyen bir sp.), cins Monomorphina gelen iki euglenoids (M. aenigmatica ve M. pseudopyrum) ve meyve sineği (Drosophila melanogaster). Bu organizmaların boyutu (4 mm için 0.5 µm) ve hücresel çeşitlilik (tek için çok hücreli hücreli) geniş bir temsil, henüz tüm numune hazırlama için gerekli sadece küçük farklılıklar nedeniyle kolayca SEM analiz için mükellef bulunmaktadır. Bu iletişim kuralı organizmalar üç tür morfolojik ayrıntıları incelemek için kimyasal su kaybı ve SEM çözümlemesi kullanarak yöntemlerini açıklar ve birçok organizma incelenmesi için genel olarak geçerli olacaktır ve doku türleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1285px;" width="1284">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">&#160;gold&#8211;palladium</td>
			<td style="width:373px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:395px;">91212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver conductive adhesive 503</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12686-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 &#956;m, polycarbonate, black</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 &#956;m, polycarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum weighing dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (12 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">aluminum mounting stubs (25 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adhesive tabs&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>76760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">conductive carbon adhesive tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">F/2 media</td>
			<td style="width:373px;">Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin</td>
			<td style="width:395px;">https://utex.org/products/f_2-medium</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AF6 media</td>
			<td style="width:373px;">Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td>
			<td style="width:395px;">https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soil water medium</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>153785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hummer 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td>
			<td>No Catalog number given - see link&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hitachi 3400N-II SEM&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td style="width:395px;">https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&#38;md=sms2-1&#38;sd=sms2-1-2&#38;gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE</td>
			<td>The company doesn&#39;t appear to sell this model any longer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (sem)

Elektron mikroskobu (SEM) tarama biyolojik örnekler bireysel proteinler hücre, doku, organelleri ve hatta bütün organizmalar için arasında değişen çalışma uygulanan yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu protokol iki kimyasal kurutma yöntemi, hexamethyldisilazane (HMDS) ve t-butil alkol (TBA) ve görüntüleme için uygulama prokaryotik ve ökaryotik organizmaların SEM kullanarak odaklanmaktadır Bu makalede, biz tamir, yıkama, kurutmak, Kuru, mount, ceket şaplatın ve organizmalar üç tür görüntü açıklanmıştır: Siyanobakteriler (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ve bilinmeyen bir sp.), cins Monomorphina gelen iki euglenoids (M. aenigmatica ve M. pseudopyrum) ve meyve sineği (Drosophila melanogaster). Bu iletişim kuralının amacını yapısı, boyut ve geniş organizmalar için geniş bir ürün yelpazesi uygulanabilir örneklerin yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için hızlı, ucuz ve basit bir yöntem tarif etmektir morfolojik değerlendirme. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması diğerleri sistemlerine bu teknikleri uygulayarak örnekleri görselleştirmek için SEM kullanmak izin verir.

Siyanobakteriler küresel karbon, oksijen ve azot döngüsü28,29kritik organizmaların prokaryotik bir grubuz. Siyanobakteriler30yaklaşık 6000 tür, en kapak ve hücreleri birbirine bağlamak mukoza bir kılıf var ve diğer yapılar için olabilen şekliyle birlikte31, mikroskobik32çözüldü. Hücre boyutu, şekli ve pigmentler mevcut bireysel tür ayır...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM at JoVE.com

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

SEM analiz tür kimlik ya da fenotipik ayrımcılık yardım etmek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı organizmalar üç temsilcisi tür özel morfolojik detayları inceleyerek yöntemlerini açıklar ve birçok organizma özelliklerinin incelenmesi için genel olarak geçerli olacaktır ve doku türleri.

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Bu protokol iki kimyasal kurutma yöntemi, Hexamethyldisilazane ve T-butil alkol ve uygulama görüntüleme hem prokaryotik ve ökaryotik organizmalar SEM kullanarak odaklanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, analiz için numune hazırlamak için kritik bir nokta kurutucu gibi özel kurutma ekipmanlarının kullanılmasını gerektirmemesidir. Bu protokol, üç tür organizmanın kimyasal dehidratasyon ve SEM analizini kullanma yöntemlerini açıklamaktadır, ancak birçok organizma ve doku tipinin incelenmesinde genel olarak uygulanabilir olacaktır.Prosedürü gösteren Madison Koon, benim laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olacak. Başlamak için, gece fiksasyon tarafından siyanobakteriler hazırlamak. Daha sonra, polikarbonat 25 mL filtre içeren 10 mL filtrasyon teçhizatına aktarın.Huni de kültürü içerecek şekilde lastik durdurucular ile filtrasyon teçhizatının yan kolunu ve hunini kapatın. Her iki stoper ikaldıktan sonra, filtrasyon şişesi üzerinde nazik vakumlama tarafından fiksatif kaldırın. Tek hücreli alg euglenoids hazırlamak için, daha önce 10 mL filtrasyon teçhizat içine transfer edilmiş kültürdoğrudan% 4 osmiyum tetroksit 3 damla ekleyerek bunları düzeltmek.30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her iki stoperi çıkarın ve filtrasyon şişesinde hafif vakumlama ile fiksatifi çıkarın. Sabit euglenoidleri 5 mL 0,1 M fosfat tamponu pH 7.0 ile oda sıcaklığında on dakika boyunca yıkayın ve şişeyi stoperlerle birlikte kapalı tutun. Her iki stoper ikaldıktan sonra, filtrasyon şişesi üzerinde nazik vakum ile her yıkama çıkarın.Sürekli daldırma korurken numuneyi susuz bırakmak için, hunide şişe ve huniyi kapalı tutarken hunide 5 mL'lik bir hacimde on dakika boyunca derecelendirilmiş bir etanol serisi kullanın. Her iki stoper çıkardıktan sonra hafifçe etanol kaldırmak için filtrasyon şişesi vakum. Numuneyi, numuneyi kapsayacak kadar %100 etanol içeren tek kullanımlık alüminyum tartı kabına aktarın.TBA kullanarak euglenoids kimyasal kurutma gerçekleştirmek için, ilk yirmi dakika boyunca TBA 1-1 çözeltisi ve% 100 etanol ile alüminyum çanak% 100 etanol çözeltisi değiştirin. Daha sonra, 1'e 1 çözeltisini yirmi dakika boyunca %100 TBA ile değiştirin ve işlemi iki kez tekrarlayın. TBA'yı çıkarın ve numuneyi kaplayacak kadar taze %100 TBA ile değiştirin.TBA dondurmak için on dakika boyunca dört derece santigrat çanak yerleştirin. TBA dondurulmuş tutmak için dondurulmuş jel paketleri ile bir vakum kurutucu için örnek aktarın. En az üç saat boyunca dondurulmuş TBA vakum süblimasyon tarafından örnek kurumasını sağlamak için tahliye ve vakum korumak için bir döner pompa kullanın.Euglenoids siyanobakteriler monte etmek için, üstüne yerleştirilen ne olduğunu belirtmek için 25 mm alüminyum montaj saplama alt etiket. Daha sonra her filtreyi saplamanın üstüne sabitlenmiş bir karbon yapıştırıcı sekmesine yerleştirin. Drosophila melanogaster hazırlamak için, tamamen sular altında olduğundan emin olmak için, dört derece santigrat iki saat boyunca fiksatif 1 mL anestezi sinekler batırın.Fiksatif kaldırmak için bir cam pipet kullanın. Sabit Drosophila örneğini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte üç kez 0,1 M fosfat tamponu, pH 7,2'yi oda sıcaklığında on dakika yıkayın. Her yıkama kaldırmak için cam bir pipet kullanın, örnek kaldırmak için dikkatli olmak.Daha sonra, her biri on dakika boyunca dereceli bir etanol serisi kullanarak 1 mL hacimde bir mikrofuge tüp örnek dehydrate. Her yıkama kaldırmak için cam bir pipet kullanın, örnek kaldırmak için dikkatli olmak. Numuneyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte ,%100 etanolle kaplayacak kadar saklayın.HMDS kullanarak sineklerin kimyasal kurumasını gerçekleştirmek için, ilk olarak %100 etanol çözeltisini 20 dakika boyunca 1-2 HMDS çözeltisi ve %100 etanol ile değiştirin. Daha sonra çözeltiyi 2-1 hmds çözeltisi ve %100 etanol ile yirmi dakika değiştirin. Son olarak, bu çözümü yirmi dakika boyunca %100 HMDS ile değiştirin ve işlemi bir kez tekrarlayın.1,5 mL mikro santrifüj tüp ve HMDS'deki numuneyi tek kullanımlık alüminyum tartı kabına aktarın. 100%HMDS'yi numuneyi kaplayacak kadar taze %100 HMDS ile değiştirin. Numunenin üzerine düşmesini önlemek için bir kutu gibi gevşek bir kapakla kuruması için numuneyi doğrudan kimyasal bir duman kaputuna yerleştirin ve 12 ila 24 saat kurumasını bekleyin.Drosophila monte etmek için, bir alüminyum montaj saplama alt etiket. Kurutulmuş sinekleri, bir kesme mikroskobu altında sapının üstüne sabitlenmiş karbon yapışkan sekmesine istenilen konuma yerleştirmek için hassas cımbız kullanın. Saplamaların dış kenarlarına gümüş iletken yapıştırıcı uygulayın.Gümüş boyayı sineklere bağlamak için kürdan kullanın, iletkenliği sağlayarak boyanın istenilen görüntüleme alanına dokunmamasını sağlar. Saplamalarbir saplama tutucu kutusuna yerleştirin ve sonra açık saplama tutucu kutusunu bir kurutucuya yerleştirin ve gümüş boyanın en az üç saat kurumasını bekleyin. Püskürtme kaplama aparatı hazırlamak için, argon gazı 4-5 floş gerçekleştirin.Kaplanacak örneklere bağlı olarak, zamanlayıcıyı el yazmasında açıklandığı gibi farklı ayarlara ayarlayın. Sputter, üreticilerin talimatlarına uyarak saplamalara kat. Son olarak, kullanılan örneğe bağlı ayarlara sahip ikincil bir elektron dedektörü içeren taramalı elektron mikroskobu kullanan görüntü örnekleri.Bu protokol kullanarak SEM için siyanobakterilerin başarılı bir şekilde hazırlanması, hücrenin şekli ve dokusu nun yanı sıra hücrelerden gelen bir klik ve projeksiyonların da görülebildiği görüntüler ortaya çıkar. Colorado bir ipliksi tatlı su türlerinin SEM görüntü zamk görünür bir kılıf gösterir. Ohio bir tatlı su bakterileri SEM görüntü bazen zamm ince bir tabaka tarafından bir arada tutulan koloniler oluşturan bireysel hücreleri ortaya koymaktadır.Filament benzeri çıkıntılar tek tek hücrelerden uzanır. Teksas kıyı sularında yüksek tuzluluk haliç bilinmeyen ipliksi türlerin görüntüleri bireysel ve bölen hücreleri göstermektedir. SEM iki farklı Euglenoid türünün pellicle şeritler görselleştirmek için kullanılmıştır.Monomorfin ve Aenigmatica monomorfin psödo pirum ile karşılaştırırken, bir kuyruk oluşturmak için arka ucunda ortaya pellicle şeritler görünür sarmal düzenleme, sonlandırma kliojen yardım. Normal drosophila gözlerin SEM görüntüleri kıllar ve lensler in sıralı bir dizi göstermek ama Alzheimer hastalığı ile ilişkili proteinlerin ekspresyonu kaba göz fenotip oluşturmak. Kaba göz fenotipini bastıran veya geliştiren genler hastalığın ilerlemesinde fizyolojik bir rol oynayabilir.Aşağıda, yanlış kuruma tekniğinden gözün çökmüş yapısıve görüntü edinimi sırasında ortaya çıkan yetersiz püskürtme kodlamasından elektron şarj ı da dahil olmak üzere, kaçınılması gereken potansiyel çukur düşme örnekleri verilmiştir. Burada açıklanan protokoller, çok büyük ölçüde saygın suç ile organizmalar kullanılan, henüz tüm biyoloji birçok alt disiplinleri kapsayan bilimsel keşifler için kritik yararlı, morfolojik bilgi toplamak için SEM analizi için münasip vardır. T-Butyl alkol, Hexamethyldisilazane ve osmium tetroksit ile çalışan tehlikeli olabilir ve uygun güvenlik önlemleri her zaman kullanıcıları korumak için gözlenen gerektiğini unutmayın, özellikle bu kimyasallar ele olacak öğrenciler.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...