Name: high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

ونحن نشكر ج. مولر لاستنساخ كدنا وأعضاء من مختبر فرنسي، وخاصة س. بيرجيلت، لمشورة قيمة ونقاش حماسي. وأيد هذا العمل SFB 646، شبكات تنظيمية في التعبير الجينوم والصيانة (كج, P.B.)، المركز للعلوم البروتين المتكامل (عنوان)، ومدرسة الدراسات العليا للعلوم الكمية ميونيخ (ماجستير). تسلم عنوان دعم الأوقيانوغرافية ألماني (SFB 646، SFB 1064، سيبسم، كبم)، أوند فيما für بونديسمينيستيريوم Forschung (الألمانية: أبيو-سيستيمبيولوجي إيننوفاتيونسويتبيويرب)، هومبولدت-المؤسسة (ألكسندر فون همبولدت، و الأستاذية).

<ol>
	<li>Berg, O. G., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+DNA+binding+sites+by+regulatory+proteins.+Statistical-mechanical+theory+and+application+to+operators+and+promoters.">Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters.</a> Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).</li><li>Hammar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+transcription+factor+dissociation+excludes+a+simple+operator+occupancy+model+for+gene+regulation.">Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation.</a> Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells.">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li><li>Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+expression+patterns+from+regulatory+sequence+in+Drosophila+segmentation.">Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation.</a> Nature. 451, 535-540 (2008).</li><li>Schroeder, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+in+the+segmentation+gene+network+of+Drosophila.">Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila.</a> PLoS Biology. 2, 271 (2004).</li><li>He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+models+of+transcriptional+regulation+by+enhancers:+the+roles+of+synergistic+activation,+cooperative+binding+and+short-range+repression.">Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression.</a> PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).</li><li>Wilson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Transcription+in+Mice+Carrying+Human+Chromosome+21.">Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21.</a> Science. 322, 434-438 (2008).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnaase+footprinting+-+simple+method+for+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-plasmon+resonance+for+gas-detection+and+biosensing.">Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing.</a> Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, (2010).</li><li>Berger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+universal+DNA+microarrays+to+comprehensively+determine+transcription-factor+binding+site+specificities.">Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities.</a> Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).</li><li>Nitta, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+transcription+factor+binding+specificities+across+600+million+years+of+bilateria+evolution.">Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Binding+Specificities+of+Human+Transcription+Factors.">DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Noyes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+characterization+of+factors+that+regulate+Drosophila+segmentation+via+a+bacterial+one-hybrid+system.">A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system.</a> Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).</li><li>Nutiu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+DNA+affinity+landscapes+on+a+high-throughput+sequencing+instrument.">Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument.</a> Nature Biotechnology. 29, (2011).</li><li>Riley, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX.-seq:+a+method+for+characterizing+the+complete+repertoire+of+binding+site+preferences+for+transcription+factor+complexes.">SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes.</a> Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).</li><li>Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+approach+to+measuring+the+binding+energy+landscapes+of+transcription+factors.">A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors.</a> Science. 315, 233-237 (2007).</li><li>Isakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMiLE-seq+identifies+binding+motifs+of+single+and+dimeric+transcription+factors.">SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors.</a> Nature Methods. 14, 316-322 (2017).</li><li>Jung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=True+equilibrium+measurement+of+transcription+factor-DNA+binding+affinities+using+automated+polarization+microscopy.">True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy.</a> Nature Communications. 9, 1605 (2018).</li><li>Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+the+fluorescence+of+macromolecules:+Fluorescent+conjugates+of+ovalbumin+and+bovine+serum+albumin.">Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin.</a> Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Reutern/PySite">https://github.com/Reutern/PySite</a> (2018)</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA">https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</a> (2018)</li><li>Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).</li><li>St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo.">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-220 (1992).</li><li>Pankratz, M., J&#228;ckle, H., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. , 467-516 (1993).</li><li>Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+for+Transcription+Factor+Binding+Site+Identification+Using+Nonindependent+Interactions.">Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions.</a> Genetics. 191, (2012).</li><li>Noureddine, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+functional+impact+of+sequence+variation+on+p53-DNA+interactions+using+a+novel+microsphere+assay+for+protein-DNA+binding+with+human+cell+extracts.">Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts.</a> PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).</li><li>Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithm+for+prediction+of+tumour+suppressor+p53+affinity+for+binding+sites+in+DNA.">Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).</li><li>Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+measurements+of+molecular+interaction+kinetics+on+a+microfluidic+platform.">Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

الهيب فا أسلوب جديد شامل لتحديد المناظر الطبيعية تفضيل ملزمة للتفاعلات TF-الحمض النووي. ومن التدابير الانتماءات الملزمة من حيث الحمض النووي عزر المتغيرات مباشرة، تجنب أي الافتراض أن أفضليات ملزمة تنعكس في تواتر حدوث النوكليوتيدات في مجموعة من موثقات فوق العتبة. القياس يجري في الحل دون التثبيت وتدخل الميكانيكية أو الكيميائية برد فعل ملزم، تقارب شروط التوازن قدر الإمكان. نظام التسليم المراقب يسمح قياس منحنى المعايرة الكامل داخل واحدة جيدا ويزيد الإنتاجية والموثوقية في الوقت نفسه توفير البروتين. يسمح استخدام هدفا مع ارتفاع الفتحة العددية والكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر مع جمع خفيفة عالية كفاءة للكشف عن الضوء الفلورسنت حساسة للغاية. ومن ثم مع هذا الإعداد، فا الصغيرة يتغير منخفضة كما يمكن كشف النائب 10-15 بدقة؛ في الممارسة العملية، وهذا يعني أن أي رد فعل ملزم هو سهولة الكشف عن الزيادة الجماعية بعد ملزم الحد الأدنى (منخفضة كنسبة شامل 2) التي. عادة هذا ليس الحال بالنسبة للنظم التجارية مثل القراء الميكروسكوبية. بسبب حساسية عالية، الورك فا يوسع نطاق ثوابت التفكك التي يمكن قياس موثوق بها في مجموعة بيكومولار. مصممون الطاقات ملزم بدقة على عدة أوامر من ضخامة.
لتقييم نوعية PWMs المنقحة، أجرينا نوعين من التحليل20. نحن اختبار، لخمسة عوامل تجزئة شبكة الجينات، وجيدا كيف يمكن التنبؤ PWMs مختلفة الملامح seq رقاقة تجريبية في مناطق الجينوم 21 تجزئة الجينات. كاختبار ثاني، قمنا باستخدام نموذج التسلسل للتعبير4 أن تتنبأ أنماط التعبير من القدرة على الانقسام على أساس تركيز البروتين وتفضيل ملزمة TFs المشاركة. في كلتا العمليتين، وجدنا أن PWMs الورك فا أقل محددة تؤدي إلى حد كبير أفضل من footprinting أكثر تحديداً و B1H PWMs20.
خلافا لأساليب حيثياته ، الورك فا يتطلب بعض المعرفة المسبقة بالأفضلية المعطاة لفريق العمل ملزم. ومع ذلك، تسلسل توافق معروفة TFs العديد من، والعديد من الأساليب القائمة يمكن توريد منهم13،،من1415. إذا لزم الأمر، تسلسل صحيح الربط الأمثل ويمكن الاطلاع على شكل تكراري.
قمنا باستخدام الحمض النووي إشارة ليغومرات المسمى فلوريسسينتلي مع Cy5 وبوديبي--650. أثبتت هذه الأصباغ أداء جيدا لكرة القدم قياسات نظراً لتباين المنضمة وغير المنضمة المرجع المسمى الحمض النووي الأكبر بين الأصباغ اختبار مختلفة. وهذا ما يضمن طائفة ديناميكية الحد أقصى لقيم كرة القدم. وبصفة عامة، أي صبغة الفلورسنت مع الأسفار عمر ≥ 1 ns يرجح أن يكون مناسباً لكنه يحتاج إلى أن تختبر أولاً. إذا كان ذلك ممكناً، فإنه ينصح باستخدام الأصباغ الاستشعاع في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة للتقليل من البروتين أوتوفلوريسسينسي.
أن الخطوة الأكثر أهمية من الإجراءات التجريبية هي بيبيتينج الهلام في لوحات جيدا. إمكانية تكرار نتائج جيدة يتطلب أحجام جل أن تكون موحدة قدر الإمكان. التغيرات في الارتفاع جل تترجم إلى تغييرات الانتشارية oligomer الحمض النووي تنافسية، وبالتالي تغييرات واضحة في تقارب عند تقييم البيانات. وهذا هو المصدر الرئيسي للفرق في تكرار تقنية. ويحسن استخدام تقنيات بيبيت أو الأتمتة الإلكترونية إمكانية تكرار نتائج. ويمكن تجنب فقاعات الهواء داخل الجل ببطء وعناية بيبيتينج. من المهم أيضا لإضافة جميع الحلول المنافس على رأس الآبار المعايرة مع تأخير صغيرة قدر الإمكان. لإمكانية تكرار نتائج أفضل، يمكن أن يكون آليا العملية برمتها باستخدام روبوت بيبيتينج مع حاضنات الحرارة. هو جزء هام لنقل البروتوكول لأتمتة التحسين اللازمة لدرجة حرارة الحاضنة وأوقات الاحتضان. تأكد لإيجاد توازن أمثل بين لزوجة الهلام (أي. ولا باردة جداً) والاستقرار للبروتينات (أي، لا حار جداً). وهذا يتوقف على حد سواء على سرعة الاستغناء عن المواد الهلامية في الآبار والاستقرار من البروتين المستخدمة.
الهيب فا يجعل استخدام نظام التسليم المراقب ليغومرات الحمض النووي المنافس. لإنشاء منحنيات المعايرة، من الضروري تحديد تركيز الحمض النووي المنافس c(z,t) لكل معطى z-ضع داخل المصفوفة جل والوقت نقطة t. هذا خطوة حاسمة أخرى، نظراً لعزم كس يعتمد مباشرة على c(z,t). وتستخدم لهذا الغرض (الشكل 1د، الشكل 2) معايرة الآبار التي تحتوي على صبغ ملحوظة كجهاز استشعار لتركيز الحمض النووي. عادة، وتكفي 3-5 معايرة الآبار التي تحتوي على ملاحظة للوحة الواحدة. قبل أن يقيم أي الورك فا التجربة، ينبغي إنشاء منحنى معايرة ملحوظة للإنشاء قبل تنفيذ سلسلة معايرة تقليدية من NB حله في [اغروس] هلام مع منافس الحمض النووي لأي تسلسل بتركيزات مختلفة (الرقم 3 )، كما هو موضح بالتفصيل في الخطوة 8. في حالة ربط قوي جداً (كد < 500 م)، يصبح استقراء المستخدمة لتحديد تركيزات منخفضة من منافس الحمض النووي تحد، نظراً لأنها أقل دقة من قياس مباشر. ومع ذلك، ل TFs مع هذه منخفضة ك قد، يمكن استخدام الإعداد الورك فا القيام معايرة تنافسية تقليدية في المخزن المؤقت ملزم دون استخدام مصفوفة [اغروس] هلام (الشكل 5). على سبيل المثال، يمكن إجراء المعايرة كامل واحد بتركيزات مختلفة 12 من الدنا المنافس في صف واحد من لوحة 96-جيدا.
نظام التسليم المراقب أيضا يتطلب سرعة حركية ملزمة TF-الحمض النووي والبروتينات مستقرة، منذ نشر على الرغم من [اغروس] هلام الديناميكية (على الرغم من بطء). يمكن اختبار كل الخصائص مباشرة مع الإعداد الورك فا بالتالي، مع مرور الوقت، اتحاد كرة القدم TFs للفائدة عندما تلتزم منهما المسمى فلوريسسينتلي مرجع الحمض النووي. قياس معدلات كعلى كOFF لعوامل التحقيق، وتبين لهم أن يكون بناء على أمر من ميلي ثانية إلى ثانية20، وفقا لآخر الدراسات30. هذا سريع بما فيه الكفاية لضمان أن تجري القياسات في التوازن. وفي حالة أخرى ردود فعل ملزم بحركية أبطأ، يمكن ضبطها الانتشارية للمنافس بخفض تركيزه أو تقليل حجم المسام هلام. في حالة اختبار TFs، كلها قد ر سريعقبالة (~ ثانية)، وقت قياس إجمالي حوالي 1-2 ساعة كافية لضمان توازن دينامي حراري في كل قياس.
مشكلة محتملة أخرى تتصل بالبروتين هو تشكيل المجاميع البروتين التي قد تغير من قياسات اتحاد كرة القدم. استخدام شروط المخزن المؤقت الأخرى التي تحتوي على إضافات مختلفة (مثل تينسيديس) يمكن أن يمنع تشكيل التجميعية، إذا لزم الأمر.
وقد عملنا على افتراض الخطي لبوم؛ ومع ذلك، يمكن تحجيم الورك فا لتشمل جميع الطفرات النوكليوتيدات دي ممكن في التسلسل إلى توافق في الآراء. وأخيراً، يمكن تكييفها لقياس أنواع أخرى من التفاعلات ملزمة الورك فا. والشرط الأساسي أن يكون متاح جزيء إشارة مناسبة ملزمة بالبروتين الذي يمكن أن يكون المسمى فلوريسسينتلي. مع نظام التسليم المراقب، يمكن إنشاء تدرج لوني تركيز لأي نوع من [ليغند]؛ ولذلك، يمكن قياس تفاعلات البروتين البروتين والبروتين المخدرات مع المثل العالية الدقة والإنتاجية.

ونظرا للدور المركزي لعوامل النسخ (TFs) في تنظيم الجينات، تحديد تفضيلاتهم ملزم بطريقة كمية أمر بالغ الأهمية. الدراسات المنوي قبل فون هيبل عرض فكرة أن TFs تنظيمية تعترف بسرعة الحمض النووي، مثل أن تجليدها يصفها توازن دينامي حراري، بينما يسيطر عليها أحداث المصب تجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي للمروج حركية أبطأ1. في فيفو ملزمة الدراسات التي أجريت مؤخرا تشير إلى أن هذه الصورة يحتمل أكثر تعقيداً2،3؛ ومع ذلك، هذه الافتراضات العامة بمثابة تقديرات تقريبية جيدة، ودعمت العديد من النهج الحسابية العثور على العناصر التنظيمية المستقلة، والتنبؤ بالتعبير عن تسلسل4،،من56. بينما الربط التوازن وبالتالي يعمل بنجاح كمفهوم، الأساليب الحالية لتحديد التفاعلات الحمض النووي TF تركز على ربط خصوصية وعادة لا مباشرة تدبير الانتماءات الملزمة في التوازن. القياس المنتظم لربط TF-الحمض النووي يمثل تحديا تقنيا كبيرا، والأساليب القائمة على عدة قيود مختلفة.
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً بعمق التسلسل (الرقائق-seq)7، التقنية في فيفو الأكثر انتشارا، لا تسمح بقياس الانتماءات الملزمة أو التعريب الدقيق لمواقع داخل أجزاء الجينوم الربط. عدة في المختبر الأساليب، بما في ذلك الدناز footprinting8التنقل الغرواني الكهربي العالي (أمسا)9, السطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)10وعبارة ثيرموفوريسيس11 قادرة على قياس الانتماءات الملزمة، ولكن هم الإنتاجية منخفضة نسبيا. وفي المقابل، تقنيات إنتاجية عالية منها البروتين ملزمة [ميكروارس]12وتقنية HT-سيليكس13،14والبكتيرية المختلطة واحدة (B1H)15 ليست قادرة على قياس الانتماءات الملزمة، وعادة ما تسفر عن الإفراط محددة ملزمة متواليات، الذي يرجع أساسا إلى انتقاء صارمة أو الغسيل الخطوات اللازمة. التطورات الأخيرة تشمل الوجه يضرب تسلسل العميق على أساس16، seq سيليكس17، والمستندة إلى ميكروفلويديكس MITOMI18 أو ابتسامة Seq19، التي تسمح لاستخراج الانتماءات الملزمة المطلقة؛ ومع ذلك، أنها تعتمد على قياس كثافة الأسفار المسماة TF والحمض النووي. الأسفار إشارات، ولذلك يصبح الحد من تركيزات منخفضة البروتين وفي تحديد قيم كد منخفضة (< ~ 10 نانومتر). وعلاوة على ذلك، الربط TF-الحمض النووي في هذه الأساليب يأخذ مكان على سطوح رقيقة، رفع القضايا مع الربط غير محدد و/أو صف السيارات الخلفية، مما يجعل من الصعب على دقة قياس ضعف الربط.
لمعالجة أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتحديد الحمض النووي TF تقارب المناظر الطبيعية في التوازن وفي الحل الذي طالبنا عالية الأداء fluorescence تباين (HiP فا)20. التقنية استناداً إلى فحص تباين (اتحاد كرة القدم) الأسفار المقررة21 ولكن تعديل لقياس ثوابت ملزمة مع حساسية عالية وواسعة النطاق باستخدام المجهر الآلي مخصص وإعداد التحليل.
وترصد المقايسة فا التفاعل بين الأنواع المسماة فلوريسسينتلي (مثل أوليجومير الحمض النووي) لشريك ملزم، في هذه الحالة TF، بقياس الدوران الجزيئية للجزيء المسمى. عند الربط إلى TF، يتناقص سرعة دوران سبب radius هيدرودينامية أعلى والوزن الجزيئي للمجمع ملزمة، مما يؤدي إلى زيادة اتحاد كرة القدم. القياس الدقيق لربط قوي جداً (كد < ~ 1 نانومتر) يتطلب استخدام تركيزات منخفضة من مرجع مسماة، الحمض النووي (ج < ~ 1 نانومتر). وهذا يصعب تحقيقه مع أداة تجارية مثل قارئ ميكروسكوبية قياسية. وباﻹضافة إلى ذلك، فرق كبيرة حجم (10 100 إضعاف) بين المجمعات المنضمة وغير المنضمة ضروري عادة، الذي يحظر القياس للتفاعلات بين المجالات الملزمة TF وقصيرة ليغومرات الحمض النووي، التي عادة ما تكون من الأوزان الجزيئية مماثلة تقريبا . وأخيراً، منحنى معايرة كامل يتطلب عادة إعداد وقياس آبار متعددة تحتوي على سلسلة تركيز للأنواع تيتراتينج.
لمعالجة هذه القضايا، نحن نستخدم إعداد مجهرية ويديفيلد، تعديل لتحقيق كشف عالية الحساسية وتسمح قياسات اتحاد كرة القدم في مختلف المواقف ض من بئر واحدة. وهذا تمكننا من رصد التفاعلات الربط بين أنواع مماثلة من الوزن الجزيئي، ومع ارتفاع الانتماءات. ويتحقق أعلى من الناتج عن طريق قياس اتحاد كرة القدم في لوحة جيدا متعدد الأشكال والاضطلاع سلسلة معايرة أسرة واحدة جيدا باستخدام إيصال نظام الخاضعة للرقابة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام مقايسة ملزمة تنافسية، نحن استخراج ثوابت ملزمة ليس فقط، بل أيضا تركيز البروتين النشط. هذا سمة هامة للمقايسة، نظراً لجزء فقط من جزيئات TF أعرب نشطة بسبب ميسفولدينج البروتين أو تدهور. ويستند الإعداد التجريبية مجهر ابيفلوريسسينسي تجارية مجهزة بمراحل بيزو XY و Z. نحن ترقية النظام مع الإثارة الليزر الخارجي، ثم الكشف عن الاثنين تنبعث مكونات الاستقطاب الخطي على رقاقة الكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر مع الكم عالية الكفاءة للكشف عن الضوء (الشكل 1ب وج 1). النظام يستخدم هدفا فتحه عددية عالية (غ) بالإضافة إلى جهاز استشعار حساسة جداً، ومما يتيح حساسة للغاية فا القياسات. عن طريق تسجيل الأسفار z-المكدسات، ملزمة التفاعلات يمكن أن يقاس على طول محور ع الضوئية عند استخدام مصفوفة متجانسة كواشف مختبر. جميع هذه التعديلات يمكن تنفيذها على نظام موجود لسهولة وفعالية من حيث التكلفة.
نحن نوظف مقايسة تنافسية ملزمة التي تقارب ملزم من أوليجومير الحمض النووي غير مسمى يقاس بالمقارنة مع الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، الذي يخدم كمرجع. وأدرجت TF ومرجع الحمض النووي في تركيزات ثابتة في مصفوفة جل مسامية [اغروس] (المسام حجم ~ 1 ميكرومتر) يشكل بيئة غير التفاعل للربط. المرجع هو المسمى الحمض النووي مع Cy5. هذه الصبغة أثبتت أنها مناسبة تماما للقياسات اتحاد كرة القدم بسبب بقائه fluorescence طويلة نسبيا (~ 1ns) وانبعاث fluorescence في استعملنا الطيف المرئي (خلفية صف السيارات منخفضة). تركيز TF في فائض المولى على مرجع Cy5 الحمض النووي، وضمان أن جميع المراجع الحمض النووي مرتبط بالبروتين. حلاً منافس غير مسمى الحمض النووي ثم تودع على سطح هلام وينشر داخل المصفوفة المسامية، إنشاء الانحدار تركيز ج (z, t) أن التغييرات على z-موقف البؤري والزمن t (الشكل 1أ من الشكل 2أ-2 ج). TF ملزمة للحمض النووي Cy5-المرجع وهكذا يتعرض محلياً بتركيزات مختلفة للمنافس الحمض النووي التي تتنافس للتوثيق، مما يؤدي إلى FA متغيرة بشكل حيوي من الحمض النووي إشارة Cy5 FAREF(z, t) (الشكل 2ب و 2 (ج)).
لتحديد c(z,t) تركيز المنافس، نقيس في آبار منفصلة (معايرة الآبار) اتحاد كرة القدم بشكل حيوي تغيير إشارة "النيل الأزرق" (ملحوظة) فاNB(z, t) (الشكل 2و 3). هذه الصبغة إينتيركالاتيس في الحمض النووي وذلك بمثابة جهاز استشعار الحمض النووي للمنافس الحمض النووي. مع هذا النظام التسليم المراقب، يمكن قياس عشرات ومئات من مختلف الانتماءات الملزمة البروتين الحمض النووي داخل لوحة متعددة جيدا واحدة (96-384 جيدا أو لوحة تنسيق). ثم يتم قياس تسلسلياً حتى تشريد المرجع المسمى الحمض النووي من فريق العمل كاملة. علينا تحديد خصوصية ملزم لعامل معين حسب قياس الانتماءات جميع الطفرات قاعدة واحدة 3 ن من تسلسل توافق طول ن. الهيب فا يتطلب كميات قليلة من البروتين (~ بمولس كل منحنى المعايرة) ويظهر انخفاض تقلب في تحديد ك قد[معامل الاختلاف (CV) < 20%]، بينما تسمح القياسات على نطاق واسع نسبيا. ويمكن إجراء الأسلوب الآلي يدوياً أو بالكامل باستخدام نظام روبوتية، أسفر عن السير الذاتية حتى أقل (الشكل 4، اللوحة العلوية). الانفصال من الثوابت يتم قياسها بدقة عالية وصولاً إلى 0.5 نانومتر. للانتماءات مرتفعة للغاية (كد < 500 م)، يمكننا استخدام معايرة تنافسية معيار (الشكل 5) بسبب عدم الدقة في قياس تركيزات الحمض النووي المنافس عند مستويات منخفضة (< 100 nM).
يمكن أن تكون نفذت على ما يقرب من أي معيار الورك فا، مقلوب، مجهر فلوري ابيفلوريسسينسي، قدمت توافر مرحلة XY الآلي ومرحلة محور ع بيزو. المكونات البصرية بنيت حولها إعداد ويديفيلد الآلي مجهزة من الأهداف البعيدة المدى. في الممارسة العملية، يمكن تكييفها للأهداف مع الخصائص الأخرى (في عمل معين، والمسافة والفتحة العددية) المقايسة. ومع ذلك، يتطلب هذا تحسين المعلمات (المسافات بين z-شرائح، المسامية والارتفاع [اغروس] هلام، إلخ.). من الممكن أيضا استخدام أنواع أخرى من الليزر أو الكاميرا. ويرد أدناه وصف مفصل للإجراءات التجريبية بأكملها وتحليل البيانات في المقطع بروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:915px;" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:183px;">Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nile Blue A</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">N5632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">655891</td>
			<td>175 &#181;m thick glass bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">384 Well Sensoplate, black</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">788896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">A9414-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tween-20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:341px;">Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Q-POD Element</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZMQSP0DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Millipak 40 Gamma Gold Filter</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>MPGL04GK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Milli-Q Integral 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Quantum TIX</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>QTUMOTIX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mastercycler gradient</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:245px;">Z316083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.706.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tube 15 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MICROSCOPY SETUP:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Automated widefield microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long distance objective</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">638 nm line continuous diode laser</td>
			<td>Omicron</td>
			<td>PHOxX 638-40, 40mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back-illuminated EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon DV897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichroic mirror</td>
			<td>AHF</td>
			<td>640nm cut-off</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bandpass filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td>ET bandpass 700/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linear polarizer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">LPVISC050-MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">BS010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Achromatic lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>200 mm focal length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multimode optical fiber</td>
			<td>Optronis</td>
			<td>FVP600660710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ROBOTIC SYSTEM:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:341px;">Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek NXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SOFTWARE:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programming language</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Labview 9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Script for the HiP-FA software available at</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy

القياس الكمي الدقيق لعامل النسخ (TF)-التفاعلات الحمض النووي ضروري لفهم تنظيم التعبير الجيني. نظراً للنهج القائمة تعاني من قيود كبيرة، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتحديد الحمض النووي TF ملزم الانتماءات مع حساسية عالية على نطاق واسع. يعتمد على مبدأ تباين (اتحاد كرة القدم) الأسفار المنشأة المقايسة لكن يدخل تحسينات فنية هامة. أولاً، نحن قياس منحنى معايرة تنافسية كاملة اتحاد كرة القدم في بئر واحدة بإدراج TF ومرجع مسمى فلوريسسينتلي الحمض النووي في مصفوفة مسامية [اغروس] هلام. غير مسمى الحمض النووي أوليجومير يتم تحميلها على أعلى كمنافس، ومن خلال نشرها، يشكل تدرج الزمانية. التدرج فا الناتج هو ثم تلا استخدام إعداد مجهر ابيفلوريسسينسي مخصصة. هذا الإعداد محسنة يزيد كثيرا من حساسية الكشف عن إشارة اتحاد كرة القدم، السماح بربط الضعفاء والأقوياء على حد سواء كمياً موثوق بها، حتى بالنسبة لجزيئات أوزان الجزيئية مماثلة. بهذه الطريقة، يمكننا قياس واحد منحنى معايرة كل من لوحة متعددة جيدا جيدا، ومن خلال إجراءات مناسبة، يمكن استخراج تفارق المطلق ثابت (كد) وتركيز البروتين النشط. عن طريق اختبار كافة المتغيرات طفرة نقطة واحدة من توافق معين ملزم التسلسل، يمكننا استطلاع في المشهد خصوصية أسرة ملزم TF، عادة على لوحة واحدة. مصفوفات الوزن الموقف الناجم عن ذلك (PWMs) تتفوق تلك المستمدة من الأساليب الأخرى في التنبؤ في فيفو شغل TF. نقدم هنا، دليلاً تفصيليا لتنفيذ الورك فا في مجهر فلوري إليه تقليدية وخط أنابيب تحليل البيانات.

ونحن تطبيق HiP فا TFs تجزئة الجينات شبكة25،26، الذي يولد نمط الجسم الأمامي الخلفي للأجنة المورفولوجية، إلى حد كبير من خلال تنظيم النسخي. من هذه الشبكة، اخترنا "bzip" المجال TF العملاقة (Gt) لتحليل مفصل (الشكل 4). نظراً لعوامل النسخ كاملة الطول من الصعب التعبير عن وتسفر عن معظمها نفس التفضيلات ملزمة كتلك المجالات (DBD) ملزمة الحمض النووي13، استخدمنا دبد تنصهر فيها ضريبة السلع والخدمات وأعربت في القولونية GST الانصهار البروتينات لبناء تحقيق النتائج نفسها ك وحدة دبدس20.
التسلسل توافق Gt (تاكجتاج) يمثل تسلسل الملزمة الأقوى التي عقدنا العزم كما هو موضح أعلاه. ثم أننا التحقيق في تأثير على الطاقة ملزمة لجميع الطفرات نقطة واحدة ممكنة ضمن تسلسل توافق Gt 10-مير (ما مجموعة 30)، الذي كان واقفاً إلى جانب قواعد إضافية في نهايات 5 'و 3'. قمنا بقياس replicates اثنين عينات هلام التي أنتجت باستخدام التنفيذ التلقائي، ونسخ إضافية واحدة تنتج يدوياً للمقارنة. ك قدتراوحت بين 0.6 إلى > 2000 نانومتر لمتواليات تحور منفردة، وأكدنا أيضا انعدام تام للربط إلى تسلسل "غير ملزمة" (البيانات لا تظهر).
عادة على غرار TF-الحمض النووي ملزم خصوصيات هي استخدام مصفوفة وزن موقف (بوم)، التي يتم تعيين نقاط لكل النوكليوتيدات الممكنة في كل موضع في عزر ملزمة. بوم يفترض أن كل موقف يسهم في ربط القوة بشكل مستقل، وفي معظم الحالات تشكل نموذجا كافياً ل TF ملزمة تفضيلات27. نحن ولدت PWMs المنقحة على أساس القياسات لدينا تقارب عقب إنشاء إجراءات28،29 ومقارنة لهم PWMs اثنين سبق الإبلاغ عنها في الأدب. الأول هو استناداً إلى التهم التردد النوكليوتيدات من مواقع حددتها الحمض النووي footprinting4،5الربط، وتم الحصول على بوم الثاني بالتحديد (B1H) واحد-الهجين البكتيرية. 15
عالية تشابه PWMs ل replicates الثلاثة (الشكل 4، اللوحة العلوية)، بما في ذلك للحصول على نموذج أعد يدوياً (تكرار 3)، ويدل إمكانية تكرار نتائج عالية لأسلوب الهيب فا. حين PWMs التي حصل عليها الورك فا عموما مماثلة إلى PWMs التي تم الحصول عليها بالأساليب الأخرى (الشكل 4، الفريق أقل)، هناك انحرافات: في الموضع 2 (السهم الأسود)، بداية فكرة "bzip" الأساسية، الطفرات T > (ز, C, A) يؤدي إلى إكمال فقدان الربط في عزر التي حصل عليها الورك-اتحاد كرة القدم، وما يتسق مع فكرة B1H ولكن ليس مع الذي حصل مع footprinting الدناز، الذي ما زال الربط القوى نسبيا للقواعد (G، A). على العكس من ذلك، في وضع 7 (السهم الرمادي)، أن الطفرة T > ج يؤدي إلى ربط أقوى كثيرا عما هو متوقع استناداً إلى PWMs المقاسة سابقا.
انحرافات أخرى أكثر دهاء ولكن ليس أقل أهمية. إجمالاً، "بوم" الورك فا أقل تحديداً من الأخريين، مما يعكس حقيقة أن العديد من الطفرات من توافق الآراء لا يزال ينتج معتدل القوة الملزمة. وهذا يمكن قياسها كمياً باستخدام محتوى المعلومات (IC). جيم بت 11.5 الورك فا المصفوفة (متوسط replicates الثلاثة)، بالمقارنة مع IC = بتات 13.4 وبتات 16.8 الدناز footprinting ومصفوفات B1H، على التوالي. عموما (ولكن ليس عالمياً)، فإن PWMs التي حصلت عليها الورك فا أقل تحديداً من تلك التي تم الحصول عليها بطرق أخرى، استناداً إلى 26 TFs التحقيق20.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> الشكل 1:تصوير التخطيطي الورك فا المقايسة والإعداد التجريبية. (أ) جل نظام التسليم للمعايرة منافس الحمض النووي في بئر واحدة. (ب) إعداد الفحص المجهري فا الورك. تخصيص مجهر ويديفيلد الآلي مع الكشف عن الضوء الفلورية الاستقطاب على كاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر. (ج) الخام fluorescence الصورة مع هاتين المنطقتين من الفائدة المستخدمة لتحديد خط (أحمر) وعمودياً (الأخضر) استقطاب مكونات. (د) نموذجي تخطيط لوحة 96-جيدا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> الشكل 2 : البيانات "الخام اتحاد كرة القدم" ومنحنيات المعايرة أعيد بناؤها. (أ) مسار FA(z,t) نموذجي لمعايرة التي تحتوي على NB. (ب، ج) FA(z,t) الوقت مسارات لبئرين معايرة قياس ملزمة قوية (ب) والمنافس ربط الحمض النووي (ج) أكثر اعتدالا. (د، ه) المقابلة أعيد بناء اتحاد كرة القدم قياسات المعايرة وتركيبها منحنيات قوية (د) ومتوسطة (ه) ملزمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> الشكل 3 : تحديد تركيز ج الحمض النووي المنافس (z, t) استخدام "النيل الأزرق" (NB). (أ) اتحاد كرة القدم-التركيز منحنى المعايرة ل 16 أزواج قاعدة الحمض النووي ليغومرات. ملحوظة: في سلسلة معايرة تقليدية، مضمن في [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع تركيزات مختلفة من منافس الحمض النووي. تقارب ملاحظة أن الحمض النووي هو20من تسلسل مستقل؛ ولذلك، يمكن استخدام منحنيات المعايرة ذاتها لتحديد ج (z، t) لتسلسل الحمض النووي مختلفة من نفس الطول. (ب) منافس الحمض النووي وقت نشر الشخصية في ارتفاع تعسفي z تحديد استخدام خمسة آبار المعايرة. لكل دورة من دورات القياس، يتم عرض فاس متوسط أربعة آبار المحتوية على ملاحظة كنقط بيضاء. المنحنيات مزودة باستخدام المعادلة 3 (خط أبيض، والآبار الفردية في اللون) وجيم (z، t) بتركيزات منخفضة (ج < ~ 100 nM) يتحدد المنحنى المناسب المستنتجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> الشكل 4 : ملزمة خصوصيات الأسرة المجال "bzip" العملاقة TF (Gt). PWMs الورك فا من replicates ثلاثة: اثنان المعدة باستخدام التنفيذ التلقائي، وواحد أعد يدوياً (اللوحة العلوية) يتم مقارنة مع PWMs الناتجة عن الدناز footprinting وعن أسلوب الاختيار (B1H) واحد-الهجين البكتيرية (أسفل اللوحة). إجمالاً، زخارف ملزمة الورك فا تتفق مع البيانات السابقة، لكن كما تظهر اختلافات كبيرة، كما أبرز مع الأسهم السوداء والرمادية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> الشكل 5 : المعايرة التنافسية التقليدية مع الورك فا. (أ) ويظهر تصميم لوحة 8 منافس مختلفة الحمض المخفف متسلسل في المخزن المؤقت ملزم في صف واحد من لوحة 96-جيدا. يظهر مخطط حرارة فا للقوة الملزمة التعسفي مختلفة. (ب) التنافسية معايرة المنافسين الثلاثة المعينة ملزمة ل TF Bcd مع مختلف الانتماءات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

هنا نقدم طريقة جديدة لتحديد الانتماءات الملزمة في التوازن وفي الحل مع حساسية عالية على نطاق واسع. وهذا يحسن التحليل الكمي لربط الحمض النووي عامل النسخ. الأسلوب الذي يستند إلى الأسفار الآلي تباين القياسات في نظام التسليم المراقب.

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

لتحسين فهم ربط عامل النسخ- الحمض النووي، طورنا طريقة لقياس ثوابت الانفصام على نطاق واسع باستخدام قياسات النظائر على سبيل المثال. هذه التقنية تسمح بالحصول على منحنيات المعايرة الكاملة تلقائياً لتحديد ثابت الانفصام مع حساسية عالية. وهو يعمل في حل في التوازن، لديها متوسطة الإنتاجية ومجموعة ديناميكية كبيرة.قمنا بتطبيق HiP-FA لصقل المشهد تقارب الربط من عوامل النسخ. ومع ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على أنواع أخرى من الأحداث الملزمة مثل البروتين البروتيني أو التفاعلات بين البروتين والمخدرات، على سبيل المثال. أنصح أولا لأداء المعايرات متعددة مع نفس الشركاء ملزمة للحصول على تقدير حول استنساخ القياسات.إذا كان متوفراً، استخدم نظامًا تلقائيًا لتحسين إمكانية إعادة الاستخدام. إلى مائل oligomers الحمض النووي من الحمض النووي المرجعي، مزيج سبعة ميكرولترات من كل عشرة ملليمترات دي المسمى إلى الأمام وslalabeled حبلا عكسي في أنبوب واحد. بالنسبة للحمض النووي المنافس، اخلط 20 ميكرولترات من كل حبلا غير مُسمّي من 100 ملليلتر إلى بئرين من 96 لوحة PCR جيدة.ثم، استخدم جهاز PCR قياسي لتسخين حلول الحمض النووي إلى 70 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم، خفض إلى درجة حرارة الغرفة بمعدل 0.1 درجة مئوية في الثانية الواحدة. استخدام فرن الميكروويف لإذابة 0.5 غرام agarose في 100 ملليلتر ربط العازلة.إضافة الماء المقطر مزدوجة لضبط حجم النهائي للتعويض عن التبخر ممكن. إعداد 10 ملليلتر الأسهم aliquots. لإعداد آبار المعايرة والمعايرة لطبقة 96 بئرًا ، قم بنقل اثنين من الأسهم الهلامية إلى شاكر حاضنة درجة مئوية 75.لكل المعايرة جيدا، إضافة 1.4 نانوموليات من الحمض النووي المرجعي، بروتين عامل النسخ، في تركيز نهائي من 20-60 نانومول، 0.2 ملليمولار DTT، ومخزن ملزم ل240 ميكرولترات من هلام ذاب. تخلط جيدا عن طريق عكس وتهز الأنبوب. ثم، ببطء ماصة 200 ميكرولترات لكل بئر من هلام الحمض النووي المحتوية على في آبار المعايرة المعينة من لوحة 96 بئر.لكل معايرة جيدا، إضافة 5 نانوموليس صبغة النيل الأزرق إلى 240 ميكرولترات من هلام الذائب. تجنب فقاعات الهواء، ماص ببطء 200 ميكرولترات من محلول هلام صبغية تحتوي على خمسة إلى ستة آبار من لوحة 96 جيدا. ضع الجل على سطح أفقي تمامًا وحضن لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة ، و10 دقائق أخرى عند 4 درجات مئوية.استخدام قارئ لوحة متعددة جيدا للتحقق من تجانس مستويات ارتفاع هلام في آبار مختلفة من لوحة. لإعداد حل الحمض النووي المنافس ، والجمع أولا بين الحمض النووي المرجعي المسمى ، والبروتين ، وثلاثة أضعاف مركزة العازلة ملزمة. ثم، مزيج 20 ميكرولترات من الحل مع 40 ميكرولترات من كل من حلول الحمض النووي المنافس.لكل معايرة جيدا، والجمع بين الكميات المناسبة من واحد من حلول الحمض النووي منافس محن ومخزن الربط المركز ثلاثية أضعاف التي تحتوي على 15 ميل 15 ميل النيل حل صبغة زرقاء. وأخيرا، إضافة 50 ميكرولترات من حلول المنافس مختلطة على رأس المواد الهلامية في وقت واحد ممكن. لبدء الحصول على صورة، ضع لوحة 96 جيدا على مرحلة المجهر.ثم، تأخذ من الوقت سلسلة من الصور Z-المكدس من الآبار حتى غير ملزمة كاملة من البروتين من الحمض النووي المرجعي. إجراء المعايرة وفقا للمخطوطة. ثم استخدم برنامج HiP-FA لإنشاء منحنيات المعايرة لتسلسلات المنافس الفردية.ثم، انقر فوق زر التصدير للحصول على ثابت الانفصام وتركيز البروتين النشط في كل عملية تحليل جيدة. اتخاذ عناية خاصة عند الأنابيب حلول هلام التي هي لزجة. يمكن أن يقلل القذف غير الدقيق من دقة تحديد ثوابت الانفصام.في هذه الدراسة، يتم تطبيق طريقة HiP-FA لتحديد تفضيلات ربط الحمض النووي لعامل نسخ B-zipped. عملاق، من شبكة جينات تجزئة الذبابة. التشابه العالي لـ PWM للـ replicates التي تم إعدادها إما يدوياً أو باستخدام تقنيات التشغيل الآلي أظهرت قابلية تكرار عالية لأسلوب HiP-FA.PWM's التي تم الحصول عليها بواسطة هذا الأسلوب وطرق أخرى متشابهة بشكل عام. ومع ذلك، يمكن رؤية انحرافات كبيرة في المواقف اثنين وسبعة من عزر الأساسية حيث الطفرات يمكن أن يؤدي إما إلى فقدان كامل للربط، أو ربط أقوى بكثير من القياسات السابقة. نحن نستخدم HiP-FA لتوليد تحسينات لربط عشرات من عامل النسخ ويظهر أن يحصل في النهاية على تنبؤ أفضل من البيانات.ونحن نعتقد أن قياسها من دقة عالية يمكن أن تكون مفيدة جدا لفهم أفضل TF-DNA ملزمة لجميع النظام أو لجميع أنواع التفاعلات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

عاليه الانتاجيه الكلي الداخلية انعكاس الفلورية والتوجيه العشوائي البصرية أعاده البناء المجهري باستخدام رقاقه فوتوسونيك

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...