Name: high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00
Duration: 6 min 38 s
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我们感谢 j. müller 的 cdna 克隆和高卢实验室成员, 特别是 s. bergelt, 提供了宝贵的建议和热烈的讨论。这项工作得到了 sfb646、基因组表达和维持监管网络 (c. j., p. b.)、蛋白质综合科学中心 (u. g.) 和慕尼黑定量生物科学研究生院 (m. s.) 的支持。u. g. 感谢德国法兰克福公司 (sfb 646, sfb 1064, cipsm, qbm), bundesministerium für bildung und forschung (bmbf:ebio:envice-vinationswetbewerb systemoilgie) 和 humboldt 基金会 (亚历山大·冯·洪堡,教授职位)。

1. 偏振显微镜
<ol><li>对于宽场激光照明, 将连续二极管激光器 (40 mw) 的 638 nm 线聚焦在多模光纤的孔径上, 以便进行光束清理。在光纤输出处安装线性偏振器, 以设置激光的偏振。</li>
	<li>用双色反射镜 (640 nm 截止) 和带通滤波器 (带通 700/75) 阻止发射光的激发分量。</li>
	<li>让荧光信号通过偏振分束器, 该分离器将发射的光拆分为垂直和平行的偏振分量。然后, 将非反射光束 (平行组件) 和反射光束 (垂直组件) 聚焦在背光 em-ccd 摄像机的芯片上, 并带有 200 mm 焦距的无色透镜 (图 1b 和 1c)。使用镜子调整垂直光束朝向镜头的方向。</li>
</ol>2. 荧光标记参考 dna 低聚物的设计与测试
<ol><li>确定参考 dna 的核心序列: 该方法基于一种竞争分析, 该方法测量转录因子与未标记的竞争对手 dna 低聚物之间的离解常数 (kd2), 这些 fna 低聚体与荧光标记的 dna, 其与 tf 的亲和力起到参考 (kd1) 的作用。从 dnase 足印或细菌 1 - 等其他来源获得的共识序列可以作为起点5,15。 注: 根据经验法则, 与共识序列相比, 合适的参考 dna 与 tf 的结合亲和力降低了3至7倍。</li>
	<li>由 hp-fa 测量在上一步中得出的共识序列的2-3 个试探性单突变的 kd1。尝试在协商一致的顺序中改变不太具体的立场, 以避免完全丧失绑定。 注: 重要的是, 参考序列是由感兴趣的转录因子 (我们在本协议中使用), 但不要太强烈, 以便较弱的竞争对手可以超过它在高浓度。</li>
	<li>通过在两侧添加对称侧翼序列 (添加侧链以进行适当的绑定), 将核心母题 (通常为8-12 基对) 的长度延长到16个基对或更多基对。如有必要 (例如, 对于较长的投标域), 请使用较长的序列 (使用 hip-fa 分析测试了长度达约50个碱基对)。 注意: 请注意不要添加预期会创建异位绑定站点的基础。使用从可用 pwm 预测绑定站点的计算工具来促进这一过程 (例如, pysite22)。</li>
	<li>作为标记的参考 dna, 在 3 ' 或 5 ' 端荧光标记的低聚物。例如, 在水中使用 cy5、bodipy-650 或浓度为 10μm (100μm 10倍库存) 的任何其他合适的染料, 并按照步骤3.1 中的说明逐步稀释。</li>
	<li>在蒸馏水中加入 33 mm 磷酸钾缓冲液 (ph = 7.0)、90 mm 氯化钠和0.01% 的非离子洗涤剂, 制备500毫升的1x 结合缓冲液。还准备3x 结合缓冲液, 其中包含相同的成分, 但浓度为三倍。如果使用3x 绑定缓冲区作为1x 绑定缓冲区的库存解决方案, 请准备卷 > 500 ml;否则, 准备250毫升。 注: 该组合物经过优化, 可确保转录因子稳定性和谷胱甘肽 s-转移酶 (gst) 二聚化。</li>
	<li>在玻璃底部显微镜96井板 (不同 tf 浓度的5-6 井) 中存在不同数量的 tf 的情况下, 用步骤1中描述的显微镜设置测量含有 0.8 nm 标记参考 dna 的200μl 结合液的 fa确定要使用的 tf 浓度。进行滴定系列, 增加 tf 量, 并选择曲线到达高原的浓度进行测定, 表明 dna 参考低聚物的完全结合。 注: 最佳 tf 浓度取决于 tf-dna 离解常数的值。一般来说, 较低的 kd 需要较低的浓度。</li>
</ol>3. 低聚物退火
<ol><li>要退火标记参考 dna 的 dna 低聚物 (在上一步确定的序列), 请在186μl 水中混合10mm 染料标记的正向单链 dna 溶液和10mm 浓度的7μl 及其未标记的反向补体。</li>
	<li>对于竞争对手的 dna 序列, 将正向单链 dna 的 20μl (在制造商提供的水中) 与20μl 的 100 mm 对应的反向单链 dna 混合在一起, 以应对每个要测量的竞争对手序列。</li>
	<li>在标准 pcr 循环中分别进行退火, 方法是将溶液加热到 70°c 3分钟, 并以 0.1 k/的速度将温度降低到 rt。如果使用的 pcr 机器不支持该速率的温度梯度, 只需在温度降低的情况下进行逐步孵育 (测试的周期为99个周期, 每个周期为-0.4 k)。</li>
</ol>4. 凝胶制备
注: 以下部分解释了两种不同凝胶的制备方法: 1) 滴定井含有蛋白质凝胶, 用于确定各自竞争对手 dna 序列的 kd s,2) 校准井利用 nb确定每个给定时间点和采集高度的 dna 浓度。重点是在96孔板的实验准备上, 但也指出了384孔板格式的相应体积。
<ol><li>在实验室微波炉中煮沸, 将 0.5% w/v 低熔点琼脂糖溶解在结合缓冲液中。完全溶解后, 用 ddh2o 再次调整体积, 以补偿可能的蒸发。 注: 为方便起见, 请准备一份10-20 毫升10毫升凝胶的库存, 并在需要时在75°C 将其熔化。凝胶库存可以存放在 rt。 注意: 请注意避免在微波炉中对凝胶溶液进行过热加热。加热时间间隔短, 中间晃动是可取的。</li>
	<li>在振动条件下, 首先在75°c 下熔融两种 10 ml 凝胶库。<ol>
<li>对每个竞争对手使用 240μl (包括20% 的开销) (n = 竞争对手序列的数量)。</li>
		<li>使用相同体积的凝胶进行 nb 校准, 以确保两个凝胶的温度和粘度相等。</li>
		<li>然后将温度设置为 35°c, 并等待温度平衡。</li>
	</ol>
</li>
	<li>对于滴定井, 在96中加入 1.4 nm (最终浓度) 杂交参考 dna (在步骤3中获得)、tf 蛋白 (最终浓度 c tf = 20-60 nm, 在步骤2.6 中确定)、dtt (0.2 mm) 和结合缓冲液, 总体积为 n x 200μl 或 n x 13 微米-或384孔板格式, 分别 (加上开销)。通过反转 (不旋涡) 彻底混合。</li>
	<li>在上一步中制备的凝胶溶液在96孔板格式 (386 井采用 13μl·well) 中缓慢加入每口 200μl, 加入滴定井。</li>
	<li>对于校准井, 首先在井外的融化凝胶中添加 5 nm nM (总量取决于所使用的井板格式和校准井的数量; 通常每个井板5-6 个就足够了)。</li>
	<li>将含有凝胶的 nb 在井板滴定井内缓慢地进行 200μl (13μl 为384井板格式), 并确保避免气泡。 注: 使用电子插座或机器人可显著提高重现性。</li>
	<li>让凝胶在 rt 固化 10分钟, 在4°c 时再固化 10分钟 (如有必要, 请在之后从玻璃中去除冷凝物)。请确保在完全水平的表面上执行所有这些步骤, 以避免凝胶表面不均匀。 注: 含有凝胶的蛋白质在4°c 下通常至少稳定几个小时。</li>
</ol>5. 添加竞争对手 dna 解决方案
注: 在开始滴定之前, 应准备好以下溶液, 并同时添加到校准和滴定井的顶部。
<ol><li>在3倍的结合缓冲液中加入经过退火标记的参考 dna 和蛋白质, 浓度比凝胶用量高3倍。<ol>
<li>将所获得的溶液的20μl 与步骤3中获得的每个退火竞争对手 dna 溶液的40μl 混合。</li>
		<li>对于每个校准井, 将含有 15 mm nb 溶液的3μl 结合在一起, 再加上40μl 的退火竞争对手 dna (任何相同长度的序列都适用)。 注: 对于384孔板, 请使用 21μl, 而不是总共60μl。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(可选) 通过测量 380 nm 的吸收率, 使用多井板读取器 (吸收率与凝胶高度成正比), 从光谱的角度检查不同油井凝胶高度水平的均匀性。</li>
	<li>在凝胶上加入 50μl (384 孔板格式为 7μl) 混合竞争对手 dna 溶液 (在步骤3中退火)。尝试使用电子多通道移液管或96通道移液头 (如果可用) 尽可能同时添加所有竞争对手的解决方案。添加竞争对手解决方案后, 将板材放置在显微镜舞台上, 并立即开始测量 (步骤 7)。</li>
</ol>6. 图像采集
<ol><li>按顺序获取时间序列的z堆栈 (例如,使用12个平面和10-300 毫秒的照明时间)。避免拍摄离井面太近的图像 (< 与本文使用的板的角度为1.4 微米), 以排除任何偏振偏置。</li>
	<li>执行10-25 个周期的测量, 直到 tf 中标记的参考 dna 完全取消结合。端点通常在1-2小时后到达, 具体取决于竞争对手 dna 的结合动力学和扩散性。</li>
</ol>7. 从原始数据中提取fa (z, t)
<ol><li>一旦对井板进行了成像, 就从原始荧光图像中计算出平行 (i=) 和垂直 (i+) 偏振强度分量感兴趣区域的平均像素值 (图 1c)。这可以使用 hp-fa 软件23自动完成。 注: 可下载 hp-fa 软件、说明书和测试数据集 23.或者, 使用任何其他自定义编写的软件提取 i=和 i+ , 并执行滴定曲线的下游分析, 如下文详细介绍。</li>
	<li>计算每口井的 fa。对于每个井, 脚本根据以下情况计算每个 z 位置和时间点t 的 fa (z, t) : 等式 1:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq1.jpg"> 其中 g 是仪器 g 因子, 纠正任何偏置到垂直通道。</li>
	<li>通过测量含有已知各向异性荧光染料的任何溶液的 fa 来确定显微镜设置的 g 因子。提取信号的两个偏振分量, 然后使用公式1获取g , 知道解的 fa (在此设置中g = 1.15)。</li>
</ol>8. 测定ffanb 中竞争对手 dna 浓度的校准曲线
<ol><li>退火每个正向和反向参考低聚物 (100 mm 库存浓度; 可使用与竞争对手序列长度相同的任意随机序列), 并与含有 nM (15 nm) 的3x 结合缓冲液120μl 混合。</li>
	<li>在1x 结合缓冲液中制备 1: 2 稀释系列, 共6个稀释。将这些稀释剂的50μl 与0.5%--低熔点琼脂糖 (t > 35°c) 的200μl 混合在含有 5 nm nM 的1x 结合缓冲液中, 在三联中含有 5 nm。</li>
	<li>在96孔板中添加上一步制备的6个溶液中的每一种, 并将板在4°c 下存储 1小时, 以确保完全凝胶化, 然后在 rt 中1小时使用 hap-fa 设置测量溶液的 fanb.</li>
	<li>根据上一步提取fanb (z, t) , 并使用 hill 方程拟合数据: 等式 2:<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq2.jpg"> 其中 cdna 是 dna 低聚物的浓度;k 一半结合位点被占领的 dna 低聚物的浓度;fa最大值是一个归一化常数;n是希尔系数。在装配过程中, k 、fa 最大值和n被设置为自由参数。</li>
	<li>输入从 hap-fa 软件中的拟合过程中获得的三个参数 (在左侧的下面板中)。</li>
	<li>每隔几个月或在显微镜设置中进行更改后, 重复确定校准曲线。</li>
</ol>9. 竞争对手 dna 浓度的测定
<ol><li>使用 hp-fa 软件从fanb(z, t)测量中提取 c (z, t) (图 3)。首先获取上一节中所述的校准曲线, 并输入软件的拟合参数 (有关详细信息, 请参阅手册)。</li>
	<li>使用该程序自动外推 c (z, t)为 c < 100 nm (请参阅手册的详细信息) 使用公式 3 (图 3b), 它描述了竞争对手 dna 在琼脂糖凝胶基质内的一维扩散, 假设自由扩散。 等式 3:<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq3.jpg"> 其中 c0是竞争对手 dna 的初始浓度;erf是错误函数;z是位置;d是竞争对手 dna 的扩散系数;并且 t0是测量的开始时间。使用的自由参数为 c0和z<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq4.jpg">/.
</li>
</ol>10. hip-fa 常规竞争滴定对非常强的 dna 结合
<ol><li>在96孔板 (或384孔板) 的行中, 以以下浓度对不同的竞争对手 dna 低聚物进行串行稀释: 0、1.25、3.5、9、19、45、90、190、425、900、1900和 4000 nm。在一个恒定浓度下加入 cy5 标记的参考 dna (1 nm) 和 tf (20-50 nm), 在结合缓冲液中, 每口井的总体积为 200μl (图 5a)。等待 40分钟, 直到达到热力学平衡, 并获得 (与 hp-fa 设置) z 堆栈的每口井 (获取几个图像每口井减少变异性通过平均计算的 fa 值)。</li>
	<li>构造平衡结合滴定曲线, 并将其与公式 4 (图 5b) 相匹配。传统竞争滴定法测定的kd 与hip-fa 用琼脂糖凝胶基质20 测定的 k d 相同。</li>
</ol>11. fa 滴定曲线的拟合程序
<ol><li>在 hap-fa 软件中显示单个竞争对手序列 fa (z, t) = f [c (z, t)] 的重建滴定曲线, 并直观地检查数据质量 (详见手册)。如果需要, 在步骤10中细化用于测定竞争对手 dna 浓度的参数。</li>
	<li>使用公式4自动拟合每个单独的滴定曲线, 该公式为竞争性滴定检测24 提供了一个分析解决方案。 等式 4:<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq5.jpg"> 使用:<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq6.jpg"> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq8.jpg"> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq9.jpg"> 其中rt 是蛋白质浓度;lt 为未标记, lst 为标记 dna 浓度;kd2 是待定的离解常数;rt是活性蛋白的浓度;a和b是规范化参数。 首先确定kd1, 它可作为确定不同kd2 值的参考。通过 选择染料参考 dna 序列作为未标记竞争对手 dna 的序列, 可以很容易地通过检测来确定 k d1 (参见手册)。</li>
	<li>在软件中输入获得的 kd1 值, 并计算板上所有竞争对手 dna 的 kd2值。 注: 拟合过程的自由参数为kd2、 r t、 a和b.
</li>
	<li>通过单击软件中的 "导出" 按钮, 为板材的所有 个别滴定液导出离解常数kd2 和活性蛋白 r t 浓度。</li>
</ol>12. pwm 构造、蛋白质-dna 相互作用的特异性和伪计数
如前面所述, 使用在线工具 weblogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) 为不同的 pwm 创建序列徽标。

<ol>
	<li>Berg, O. G., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+DNA+binding+sites+by+regulatory+proteins.+Statistical-mechanical+theory+and+application+to+operators+and+promoters.">Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters.</a> Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).</li><li>Hammar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+transcription+factor+dissociation+excludes+a+simple+operator+occupancy+model+for+gene+regulation.">Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation.</a> Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells.">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li><li>Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+expression+patterns+from+regulatory+sequence+in+Drosophila+segmentation.">Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation.</a> Nature. 451, 535-540 (2008).</li><li>Schroeder, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+in+the+segmentation+gene+network+of+Drosophila.">Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila.</a> PLoS Biology. 2, 271 (2004).</li><li>He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+models+of+transcriptional+regulation+by+enhancers:+the+roles+of+synergistic+activation,+cooperative+binding+and+short-range+repression.">Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression.</a> PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).</li><li>Wilson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Transcription+in+Mice+Carrying+Human+Chromosome+21.">Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21.</a> Science. 322, 434-438 (2008).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnaase+footprinting+-+simple+method+for+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-plasmon+resonance+for+gas-detection+and+biosensing.">Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing.</a> Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, (2010).</li><li>Berger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+universal+DNA+microarrays+to+comprehensively+determine+transcription-factor+binding+site+specificities.">Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities.</a> Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).</li><li>Nitta, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+transcription+factor+binding+specificities+across+600+million+years+of+bilateria+evolution.">Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Binding+Specificities+of+Human+Transcription+Factors.">DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Noyes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+characterization+of+factors+that+regulate+Drosophila+segmentation+via+a+bacterial+one-hybrid+system.">A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system.</a> Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).</li><li>Nutiu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+DNA+affinity+landscapes+on+a+high-throughput+sequencing+instrument.">Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument.</a> Nature Biotechnology. 29, (2011).</li><li>Riley, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX.-seq:+a+method+for+characterizing+the+complete+repertoire+of+binding+site+preferences+for+transcription+factor+complexes.">SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes.</a> Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).</li><li>Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+approach+to+measuring+the+binding+energy+landscapes+of+transcription+factors.">A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors.</a> Science. 315, 233-237 (2007).</li><li>Isakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMiLE-seq+identifies+binding+motifs+of+single+and+dimeric+transcription+factors.">SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors.</a> Nature Methods. 14, 316-322 (2017).</li><li>Jung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=True+equilibrium+measurement+of+transcription+factor-DNA+binding+affinities+using+automated+polarization+microscopy.">True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy.</a> Nature Communications. 9, 1605 (2018).</li><li>Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+the+fluorescence+of+macromolecules:+Fluorescent+conjugates+of+ovalbumin+and+bovine+serum+albumin.">Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin.</a> Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Reutern/PySite">https://github.com/Reutern/PySite</a> (2018)</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA">https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</a> (2018)</li><li>Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).</li><li>St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo.">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-220 (1992).</li><li>Pankratz, M., J&#228;ckle, H., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. , 467-516 (1993).</li><li>Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+for+Transcription+Factor+Binding+Site+Identification+Using+Nonindependent+Interactions.">Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions.</a> Genetics. 191, (2012).</li><li>Noureddine, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+functional+impact+of+sequence+variation+on+p53-DNA+interactions+using+a+novel+microsphere+assay+for+protein-DNA+binding+with+human+cell+extracts.">Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts.</a> PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).</li><li>Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithm+for+prediction+of+tumour+suppressor+p53+affinity+for+binding+sites+in+DNA.">Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).</li><li>Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+measurements+of+molecular+interaction+kinetics+on+a+microfluidic+platform.">Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).</li></ol>

提交人声明没有利益冲突。

hp-fa 是确定 tf-dna 相互作用的结合偏好景观的一种综合性新方法。它直接测量突变 dna 母题变体的结合亲和力, 避免任何基本假设, 即结合偏好反映在一组以上阈值粘合剂中核苷酸发生的频率中。测量在溶液中进行, 没有固定化和机械或化学干扰的结合反应, 接近平衡条件尽可能近。控制下输送系统允许在一口井内测量完整的滴定曲线, 并在节省蛋白质的同时提高吞吐量和可靠性。使用具有高数值孔径的目标和具有高光收集效率的 em-ccd 摄像机, 可进行高灵敏度的荧光灯检测。因此, 通过这种设置, 可以准确地检测到低至 10-15 mp 的小 fa 变化;实际上, 这意味着任何结合后质量增加最小 (低至质量比为 2) 的结合反应都很容易被检测到。像微板阅读器这样的商业系统通常不是这种情况。由于其高灵敏度, hp-fa 将可可靠测量的离解常数范围扩展到皮摩尔范围。结合能在多个数量级上精确地确定。
为了评估修订后的 pwm 的质量, 我们进行了两种类型的分析20。我们测试了五个因素的分割基因网络, 不同的 pwm 如何能够预测实验 chip-seq 的分布在21个分割基因的基因组区域。作为第二次测试, 我们使用了序列到表达模型 4, 该模型根据参与的 tf 的结合偏好和蛋白质浓度预测分割增强剂的表达模式。在这两个练习中, 我们发现较不具体的 hip-fa pwm 的性能明显好于更具体的足迹和 b1h pwm 20.
与新方法不同, hp-fa 需要对给定 tf 的绑定首选项有一定的先验了解。然而, 共识序列对于许多 tf 来说是众所周知的, 许多现有的方法可以为它们提供 13、14、15.如果需要, 可以迭代地找到真正的最佳绑定序列。
我们使用 dna 参考低聚物荧光标记的 cy5 和 bodipy-650。这些染料已被证明在 fa 测量中表现良好, 因为在不同的测试染料中, 结合和未结合的标签参考 dna 的各向异性是最大的。这可确保 fa 值的最大动态范围。一般情况下, 任何荧光染料的荧光寿命≥1 ns 可能是合适的, 但需要首先进行测试。如果可能, 建议使用染料荧光在近红外范围内, 以尽量减少蛋白质自体荧光。
实验过程中最关键的一步是将凝胶移入井板。良好的重现性要求凝胶体积尽可能均匀。凝胶高度的变化转化为竞争 dna 低聚物的扩散系数的变化, 从而转化为评估数据时亲和力的明显变化。这是技术复制中差异的主要来源。使用电子移液器或自动化技术可提高重现性。凝胶内的气泡可以通过缓慢而仔细的移液来避免。在滴定井的顶部添加所有竞争对手的解决方案也很重要, 应尽可能不延迟。为了获得最佳的重现性, 整个过程可以使用带有热孵化器的移液机器人实现自动化。将协议转化为自动化的关键部分是孵化器温度和孵化时间的必要优化。确保在凝胶的粘度 (即不要太冷) 和蛋白质的稳定性 (即不要太热) 之间找到最佳的平衡。这既取决于凝胶放入油井的分配速度, 也取决于所使用的蛋白质的稳定性。
hp-fa 对竞争对手的 dna 低聚物使用控制下的输送系统。为了构造滴定曲线, 有必要确定每个给定 z 位置在凝胶矩阵和时间点t中的竞争对手 dna 浓度c (z, t) 。这是另一个关键的步骤, 因为k d的确定直接取决于c (z, t)。为此目的使用了含有 nb 染料作为 dna 浓度传感器的校准井 (图 1d,图 2a)。通常情况下, 3-5 个校准井包含 nb 每个板是足够的。在评估任何 hap-fa 实验之前, 应通过执行传统的滴定系列的 nb 溶解在琼脂糖凝胶中, 在不同浓度下的任何序列的竞争对手 dna, 为该设置构建一个 nb 校准曲线 (图 3) a), 如步骤8中详细说明的那样。在非常强的结合 (kd < 500 pm) 的情况下, 用于测定竞争对手 dna 低浓度的外推法变得有限, 因为它的准确性不如直接测量。但是, 对于 kd s 如此低的 tf, hp-fa 设置可用于在结合缓冲液中执行传统的竞争性滴定, 而无需使用琼脂糖凝胶矩阵 (图 5)。例如, 一个完整的滴定法与12不同浓度的竞争对手 dna 可以在每一排96孔板进行。
控制的输送系统还需要快速的 tf-dna 结合动力学和稳定的蛋白质, 因为通过琼脂糖凝胶的扩散是动态的 (虽然缓慢)。随着时间的推移, 当它们被绑定到各自的荧光标记的参考 dna 时, 可以通过 hp-fa 设置直接测试这两个属性。我们测量了所调查因素的 kon和 koff速率, 并发现它们的速度为毫秒到秒 20, 符合其他研究30。这足够快, 以确保测量在平衡状态下进行。在其他结合反应与较慢的动力学的情况下, 竞争对手的扩散系数可以通过降低其浓度或减少凝胶孔径来调整。在测试的 tf 的情况下, 所有的 toff 都有快速的 toff (~ 秒), 总测量时间约1-2小时就足以确保每次测量的热力学平衡。
与蛋白质相关的另一个潜在问题是可能改变 fa 测量的蛋白质集合体的形成。如有必要, 使用含有不同添加剂的其他缓冲条件 (如肌腱) 可以防止骨料的形成。
我们是在 pwm 的线性假设下工作的;然而, hip-fa 可以缩放, 以包括所有可能的二核苷酸突变的共识序列。最后, hap-fa 可以用来测量其他类型的绑定相互作用。前提是要有一个合适的参考分子绑定的蛋白质, 可以荧光标记。在控制下输送系统中, 可以为任何类型的配体产生浓度梯度;因此, 蛋白质-蛋白质和药物蛋白相互作用可以用类似的高保真和吞吐量来测量。

鉴于转录因子 (tf) 在基因调控中的核心作用, 以定量的方式确定其结合偏好至关重要。冯·希佩尔的种子研究引入了一个概念, 即调节 tf 可以迅速识别 dna, 因此它们的结合被热力学平衡很好地描述, 而招募 rna 聚合酶到启动子的下游事件则由较慢的动力学1。最近在体内结合研究表明, 这张图片可能是更复杂的2,3;然而, 这些一般假设作为一个很好的近似值, 并支持许多计算方法来查找顺式调节元素和预测序列4,5,6的表达式。虽然平衡结合因此已被成功地用作一个概念, 但目前确定 tf-dna 相互作用的方法侧重于结合特异性, 通常不直接测量平衡时的结合亲和力。tf-dna 结合的系统测量是一个相当大的技术挑战, 现有的方法有几个不同的局限性。
染色质免疫沉淀, 然后进行深度测序 (chip-seq)7, 这是体内最普遍的技术, 不允许测量结合亲和力或准确定位基因组片段中的结合位点。几种体外方法, 包括 dnase 足印8、电泳移动移位 (emsa)9、表面等离子体共振 (spr)10和微尺度热像 11, 都能测量结合亲和力,但它们的吞吐量相对较低。相反, 高通量技术, 包括蛋白质结合微阵列 12、ht-selex 13、14和细菌单杂交 (b1h)15 , 无法测量结合亲和力, 通常会产生过度的结果特定的结合序列, 这主要是由于严格的选择或洗涤步骤所必需的。最近的事态发展包括基于深度测序的 hits-fip16、selex-seq17和基于微流体的 mitomi18或 smile-seq19, 这使得能够提取绝对结合亲和力;然而, 他们依靠测量标记 tf 和 dna 的荧光强度。因此, 荧光信号在低蛋白质浓度和确定低 kd 值(< ~ 10nm) 时变得有限。此外, 这些方法中的 tf-dna 结合发生在薄表面上, 引起了非特异性结合和/或自动荧光背景的问题, 使其难以准确量化弱结合。
为了解决这些限制, 我们开发了一种新的方法来确定 tf-dna 亲和性景观在平衡和溶液中, 我们称之为高性能荧光各向异性 (hip-fa)20。该技术是基于已建立的荧光各向异性 (fa) 检测21 , 但修改, 以测量具有高灵敏度和大规模的结合常数使用定制的自动化显微镜和分析设置。
fa 分析通过测量标记分子的分子旋转来监测荧光标记的物种 (如 dna 低聚物) 与结合伙伴 (在本例中为 tf) 之间的相互作用。当与 tf 结合时, 由于结合复合物的流体动力半径和分子量较高, 其转速降低, 从而提高 fa。准确测量非常强的结合 (kd< ~ 1 nm) 需要使用低浓度的标记、参考 dna (c < ~ 1 nm)。这是很难实现与商业仪器, 如标准的微板读取器。此外, 约束复合物和未结合复合物之间通常需要有很大的大小差异 (10-100 倍), 因此可以测量 tf 结合域和短 dna 低聚物之间的相互作用, 而这些位基因通常具有大致相似的分子量.最后, 完整的滴定曲线通常需要制备和测量含有滴定剂系列浓度序列的多口井。
为了解决这些问题, 我们使用了宽场显微镜设置, 经过修改以实现高检测灵敏度, 并允许在单个油井的不同 z 位置进行 fa 测量。这使我们能够监测具有相似分子量和高亲和力的物种之间的结合相互作用。通过以多井板格式测量 fa 并使用控制式输送系统在单个井中执行整个滴定系列, 可以实现更高的吞吐量 (图 1a)。此外, 通过采用竞争性结合法, 我们不仅提取结合常数, 而且提取活性蛋白的浓度。这是分析的一个重要特征, 因为只有一部分表示的 tf 分子是活跃的, 由于蛋白质错误折叠或降解。实验装置是基于一个商业荧光显微镜配备了 xy-和 z-压电阶段。我们用外部激光激励对系统进行了升级, 然后检测到 emccd 摄像机芯片上发射的两个线性偏振元件, 具有较高的量子效率, 用于光检测 (图 1b 和 1c)。该系统使用高数值孔径 (na) 目标耦合到超敏感传感器, 从而提供高灵敏度的 fa 测量。通过记录荧光 z 堆栈, 在使用反应物的非均质矩阵时, 可以沿光学 z 轴测量结合相互作用。所有这些修改都可以在现有系统上轻松实施, 并且具有成本效益。
我们采用了一种有竞争力的结合法, 在这种方法中, 未标记的 dna 低聚物的结合亲和力与荧光标记的 dna 进行了比较, 作为参考。tf 和参考 dna 以固定浓度纳入多孔琼脂糖凝胶基质 (孔径 ~ 1μm), 构成了结合的非相互作用环境。参考 dna 标记为 cy5。这种染料被证明是非常适合 fa 测量, 因为它相对较长的荧光寿命 (~ 1ns) 和荧光发射在可见光光谱的远红色 (低自动荧光背景)。tf 浓度在摩尔过量超过 cy5 参考 dna, 确保所有参考 dna 都与蛋白质结合。然后, 未标记竞争对手 dna 的溶液沉积在凝胶表面, 并在多孔基体内扩散, 建立在焦平面和时间t的 z 位置上变化的浓度梯度 c (z, t) (图1a, 图 2a-2c)。因此, 与 cy5 参考 dna 结合的 tf 在当地暴露在竞争对手 dna 的不同浓度下, 这些 dna 竞争结合, 从而导致 cy5 参考 dna fa ref(z, t)的动态变化 fa (图 2b b和2c)。
为了确定竞争对手的浓度 c (z, t), 我们在不同的井 (校准井) 测量尼罗河蓝 (nb) fa nb (z, t) 的动态变化 fa 信号 (图 2a 和 3)。这种染料插入 dna, 从而作为竞争对手 dna 的 dna 传感器。有了这个控制下的输送系统, 可以在一个多井板 (96-或384孔板格式) 内测量几十到数百种不同的 dna 蛋白结合亲和力。然后按顺序进行测量, 直到标记的参考 dna 从 tf 中完全位移。我们通过测量长度n的一致序列的所有3n 单基突变的亲和力来确定给定因子的结合特异性。hp-fa 需要少量的蛋白质 (每个滴定曲线 ~ pmols), 并且在确定 kd 的[变异系数 (cv) < 20%] 时显示出较低的变异性, 同时允许在相对较大的尺度上进行测量。该方法可以使用机器人系统手动或完全自动化地进行, 从而产生更低的 cv (图 4, 上层板)。分离常数的测量精度高达 0.5 nm。对于极高的亲和力 (kd < 500pm), 我们使用标准的竞争性滴定法 (图 5), 因为在测量竞争对手 dna 浓度时不准确, 在较低的水平 (< 100 nm)。
hp-fa 几乎可以在任何标准的倒置荧光荧光显微镜上实现, 提供自动 xy 级和压电 z 级的可用性。光学组件是围绕配备了远程目标的自动宽场设置而构建的。在实践中, 该分析可适应具有其他特性 (特别是工作、距离和数字孔径) 的目标。但是, 这需要优化参数 ( z片之间的距离、琼脂糖凝胶的孔隙度和高度等). 使用其他类型的激光或相机也是可能的。下面的协议部分详细介绍了整个实验过程和数据分析。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:915px;" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:183px;">Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nile Blue A</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">N5632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">655891</td>
			<td>175 &#181;m thick glass bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">384 Well Sensoplate, black</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">788896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">A9414-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tween-20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:341px;">Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Q-POD Element</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZMQSP0DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Millipak 40 Gamma Gold Filter</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>MPGL04GK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Milli-Q Integral 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Quantum TIX</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>QTUMOTIX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mastercycler gradient</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:245px;">Z316083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.706.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tube 15 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MICROSCOPY SETUP:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Automated widefield microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long distance objective</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">638 nm line continuous diode laser</td>
			<td>Omicron</td>
			<td>PHOxX 638-40, 40mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back-illuminated EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon DV897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichroic mirror</td>
			<td>AHF</td>
			<td>640nm cut-off</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bandpass filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td>ET bandpass 700/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linear polarizer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">LPVISC050-MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">BS010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Achromatic lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>200 mm focal length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multimode optical fiber</td>
			<td>Optronis</td>
			<td>FVP600660710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ROBOTIC SYSTEM:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:341px;">Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek NXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SOFTWARE:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programming language</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Labview 9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Script for the HiP-FA software available at</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy

转录因子 (tf)-dna 相互作用的准确定量对于理解基因表达的调控至关重要。由于现有的方法存在严重的局限性, 我们开发了一种新的方法来大规模地测定具有高灵敏度的 tf-dna 结合亲和力。该分析依赖于已建立的荧光各向异性 (fa) 原理, 但引入了重要的技术改进。首先, 我们测量一个完整的 fa 竞争滴定曲线在一个单一的井结合 tf 和荧光标记参考 dna 在一个多孔琼脂糖凝胶基质。未标记的 dna 低聚物作为竞争对手加载到顶部, 并通过扩散形成时空梯度。然后使用定制的荧光显微镜设置读出所产生的 fa 梯度。这种改进的设置大大提高了 fa 信号检测的灵敏度, 即使是类似分子量的分子, 也能可靠地量化弱结合和强结合。通过这种方法, 我们可以测量多井板每井的一个滴定曲线, 通过一个拟合过程, 我们可以提取绝对离解常数 (kd) 和活性蛋白质浓度。通过测试给定共识约束序列的所有单点突变变体, 我们可以测量 tf 的整个绑定特异性景观, 通常在单个板块上。所得到的位置重量矩阵 (pwm) 在预测体内tf 占用率方面优于其他方法得出的位置权重矩阵。在这里, 我们提供了一个详细的指南, 以实现 hip-fa 在传统的自动化荧光显微镜和数据分析管道。

我们将 hp-fa 应用于25,26的分割基因网络的 tf, 它产生了嗜酸性粒细胞胚胎的前后体模式, 主要是通过转录调控。从这个网络中, 我们选择了 bzip 域 tf 巨人 (gt) 进行详细分析 (图 4)。由于全长转录因子难以表达, 产生的结合偏好与 dna 结合域 (dbd)13基本相同, 我们使用了 dbd 与 gst 的融合, 并表达了大肠杆菌 gst 融合蛋白的结构. 仅 dbd 20 就能提供相同的结果。
gt 共识序列 (a ttactaac) 代表了我们如上所述确定的最强的绑定序列。然后, 我们调查了 10-mer gt 共识序列 (共 30) 中所有可能的单点突变对结合能量的影响, 在 5 ' 和 3 ' 端的其他基接。我们测量了两个复制, 其凝胶样品是使用自动化生产的, 另一个复制是手动生产的, 以便进行比较。对于单独突变的序列, kds 的范围从0.6 到 > 2000 nm 不等, 我们还确认完全没有绑定到 "不具约束力" 序列 (未显示数据)。
tf-dna 结合特性通常是使用位置权重矩阵 (pwm) 进行建模的, 在该矩阵中, 在结合母题中的每个可能的核苷酸上都有一个分数。pwm 假定每个位置都有助于独立的结合强度, 并且在大多数情况下构成 tf 绑定偏好27的足够模型.我们根据既定程序28、29 的亲和力测量生成了修订后的 pwm, 并将其与文献中之前报告的两个 pwm 进行了比较。第一种是基于 dna 足迹4、5鉴定的结合位点的核苷酸频率计数, 通过细菌单杂交 (b1h) 选择获得了第二个 pwm。15
三个复制件 (图 4, 上层板) 的 pwm 具有很高的相似性, 包括手动制备的样品 (复制 3), 这表明 hap-fa 方法具有较高的重现性。虽然 hip-fa 获得的 pwm 总体上与使用其他方法获得的 pwm 相似 (图 4, 下面板), 但存在重大偏差: 在位置 2 (黑色箭头)、核心 bzip 母题的开始、突变 t > (g、c、a) 导致hap-fa 获得的主题完全失去了装订, 这与 b1h 母题一致, 但与 dnase 足迹的主题不一致, 在 dnase 脚印中, 结合在基座上仍然相对较强 (g, a)。相反, 在位置 7 (灰色箭头), 突变 t > c 导致比预期的绑定更强, 基于以前测量的 pwm。
其他偏差比较微妙, 但同样重要。总体而言, hap-fa pwm 的具体程度不如其他两个, 这反映出共识中的许多突变仍然会导致适度强的结合。这可以使用信息内容 (ic) 进行量化。hip-fa 矩阵的 ic 为 11.5 (三个副本的平均值), 而 dnase 页脚打印和 b1h 矩阵的 ic 分别为13.4位和16.8位。一般来说 (虽然不是普遍的), hap-fa 获得的 pwm 比其他方法获得的 pwm 不那么具体, 基于 26个 tf 调查了20个。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> 图 1:hip-fa 分析和实验设置的示意图。(a) 凝胶输送系统, 用于在单口井中滴定竞争对手的 dna。(b) hip-fa 显微镜装置。在 em-ccd 摄像机上进行自定义的自动宽场显微镜, 并带有偏振光检测功能。(c) 具有两个感兴趣区域的原始荧光图像, 用于确定平行 (红色) 和垂直 (绿色) 极化成分。(d) 96 孔板的典型布局。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> 图 2: 原始 fa 数据和重建滴定曲线.(a) 含有 nb 的校准井的典型fa (z, t)轨迹。(b, c)两个滴定井的 fa (z, t)时间轨迹, 测量与强 (b) 和更温和 (c) dna 结合竞争对手的结合。(d, e)相应重建的 fa 滴定测量和拟合曲线的强 (d) 和中 (e) 结合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> 图 3: 使用尼罗河蓝 (nb) 确定竞争对手 dna c (z, t)的浓度.(a) 16个碱基对 dna 低聚物的 fa-ci-cute 浓度校准曲线。在传统的滴定系列中, nb 与不同浓度的竞争对手 dna 一起嵌入琼脂糖凝胶中。nb 与 dna 的亲和力是序列无关的 20;因此, 相同的校准曲线可用于确定相同长度的不同 dna 序列的 c (z, t) 。(b) 使用五口校准井确定任意z高度的竞争对手 dna 时间扩散剖面。对于每个测量周期, 四个包含 nb 的井的平均 fa 显示为白点。曲线采用公式 3 (白线, 单个井的颜色) 进行拟合, c (z, t)在低浓度 (c < ~ 100 nm) 下, 由外推拟合曲线确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> 图 4: 具有约束力的具体特点的 bzip 域家庭 tf 巨人 (gt).hip-fa 三个重复的 pwm: 两个使用自动化制备的, 一个手动准备的 (上面板) 与 dnase 脚印和细菌单杂交 (b1h) 选择方法 (下面板) 产生的 pwm 进行了比较。总体而言, hip-fa 绑定图案与以前的数据一致, 但也显示出显著的差异, 如黑色和灰色箭头突出显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> 图 5: 传统的竞争滴定法与 hip-fa.(a) 板材设计显示, 在96孔板的一行中, 8个不同的竞争对手 dna 在结合缓冲液中连续稀释。显示不同任意结合强度的 fa 热图。(b) 对具有不同亲和力的 bcd tf 具有约束力的三个竞争对手 dna 进行竞争性滴定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

在这里, 我们提出了一种新的方法来确定结合亲和力的平衡和解决具有高灵敏度的大尺度。这改进了转录因子-dna 结合的定量分析。该方法基于控制下的输送系统中的自动荧光各向异性测量。

荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

为了增进对转录因子-DNA结合的理解，我们开发了一种使用各向异性测量大规模测量分离常数的方法。此技术允许自动获取全滴定曲线，以确定具有高灵敏度的分离常数。它在平衡下工作，具有适量的吞吐量和较大的动态范围。我们应用HIP-FA来优化转录因子的结合亲和力。然而，该协议可以应用于其他类型的结合事件，如蛋白质-蛋白质或蛋白质-药物相互作用，例如。我建议首先与同一绑定伙伴执行多个滴定，以了解测量的可重复性。如果可用，请使用自动化系统实现更好的可还原性。为了将参考DNA的DNA寡聚物退火，将每十毫摩尔二标记的七微升在一个管中，用无标签的反向链混合。对于竞争对手的 DNA，将每 100 毫摩尔未标记链中的 20 微升混合到 96 打井 PCR 板的两个孔中。然后，使用标准 PCR 机器将 DNA 溶液加热到 70 摄氏度，为期三分钟。然后，以0.1摄氏度/秒的速度降至室温。使用微波炉在100毫升结合缓冲液中熔化0.5克阿加罗斯。加入双蒸馏水以调节最终体积，以补偿可能的蒸发。准备十毫升股票等分。要准备 96 孔板的滴定和校准孔，请将两个凝胶库存等分转移到 75 摄氏度的培养箱摇床。对于每滴定井，加入1.4纳米摩尔的参考DNA，转录因子蛋白，最终浓度为20-60纳米摩尔，0.2毫摩尔DTT，并结合缓冲液到240微升融化的凝胶。通过反转和摇动管子彻底混合。然后，在96孔板的指定滴定井中，缓慢移液200微升含DNA凝胶的含DNA凝胶。对于每个校准井，添加5纳米摩尔尼罗蓝色染料到240微升融化的凝胶。避免气泡，缓慢移液器200微升的含有染料的凝胶溶液在5至6孔的96井板。将凝胶放在完全水平的表面上，在室温下孵育10分钟，在4摄氏度下再孵育10分钟。使用多孔板读取器检查板不同孔中凝胶高度水平的均匀性。要准备竞争对手的DNA溶液，首先将标记的参考DNA、蛋白质和三倍浓缩结合缓冲液组合在一起。然后，将解决方案的 20 微升与每个退火竞争对手 DNA 解决方案的 40 微升混合。对于每个校准井，结合适当数量的退火竞争对手DNA溶液和三倍浓缩结合缓冲液包含15毫摩尔尼罗蓝色染料溶液。最后，在凝胶上尽可能同时添加 50 微升的混合竞争对手解决方案。要开始图像采集，请将 96 井板放在显微镜舞台上。然后，采取时间序列的Z堆栈图像的井，直到完全取消绑定的蛋白质从参考DNA。根据手稿进行滴定测定。然后使用 HIP-FA 软件为各个竞争对手序列创建滴定曲线。然后，单击导出按钮，获得每个滴定井中活性蛋白的分离常数和浓度。在移液粘性凝胶溶液时，请特别小心。不准确的移液会降低确定分离常数的精度。本研究采用HIP-FA方法确定B-压缩转录因子的DNA结合偏好。巨人，来自苍蝇分段基因网络。PWM 对于手动或使用自动化技术准备的复制具有高度相似性，这证明了 HiP-FA 方法的高可重复性。通过这种方法获得的PWM和其他方法总体上是相似的。然而，在核心图案的第二位置和位置七可以看到显著偏差，其中突变可能导致完全失去结合，或者比之前的测量更牢固结合。我们使用HiP-FA对数十个转录因子的绑定进行优化，它表明最终获得了更好的数据预测。我们相信，它的高精度测量可以非常有用，以更好地了解TF-DNA结合的所有系统或各种相互作用。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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