Name: high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Wij danken J. Müller voor cDNA klonen en leden van de lab van Gallië, in het bijzonder S. Bergelt, waardevolle adviezen en pittige discussie. Dit werk werd gesteund door SFB 646, regulerende netwerken in het genoom expressie en onderhoud (C.J., P.B.), het centrum voor geïntegreerde eiwit wetenschap (U.G.) en de Graduate School voor kwantitatieve Biosciences München (M.S.). U.G. erkent ondersteunen door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646 SFB 1064, CIPSM, QBM), het Bundesministerium für Bildung und Forschung (goedgekeurd: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie), en de Humboldt-stichting (Alexander von Humboldt, Leerstoel).

1. Polarisatie microscopie
<ol><li>Voor widefield laser verlichting, richten een 638 nm lijn van een continu diodelaser (40 mW) op de opening van multimode glasvezel voor lichtbundel cleanup. Monteer een lineaire polarisator aan de uitgang van de vezel als u wilt instellen van de polarisatie van laserlicht.</li>
	<li>Blokkeren de excitatie-component van het uitgestraalde licht met een dichroïde spiegel (640 nm cut-off) en een bandfilter filter (bandpass 700/75).</li>
	<li>Laat het signaal van de fluorescentie een polariserende balk splitter, die de uitgestraalde licht in de loodrechte en parallelle gepolariseerde componenten splitst passeren. Dan, de niet-weerspiegeld lichtbundel (parallelle component) en de teruggekaatste lichtbundel (loodrecht component) met een achromatische lens van 200 mm brandpuntsafstand moet richten op de chip van een rug-verlicht EM-CCD-camera (Figuur 1b en 1 c). Gebruik van een spiegel om de richting van de loodrecht lichtbundel richting de lens.</li>
</ol>2. ontwerpen en testen van TL-gelabelde referentie DNA Oligomeer
<ol><li>Bepalen van de volgorde van de kern van de verwijzing DNA: de methode is gebaseerd op een concurrerende assay dat maatregelen van de dissociatieconstante (KD2) tussen een transcriptiefactor en labelloze concurrent DNA oligomeren, die voor binding met concurreert een fluorescently geëtiketteerde DNA waarvan affiniteit met de TF als een verwijzingen (KD1 fungeert). De volgorde van de consensus verkregen uit andere bronnen zoals DNase footprinting of bacteriële 1-hybrid kan dienen als een begin punt5,15. Opmerking: als een vuistregel, een geschikte referentiemiddelen DNA een 3 tot afname van de 7-fold in bindende affiniteit met de TF in vergelijking met de volgorde van de consensus heeft.</li>
	<li>Maat door heup-FA de KD1s van 2-3 voorlopig enkel mutaties van de reeks van de consensus die in de vorige stap zijn afgeleid. Probeer te muteren posities in volgorde van de consensus die niet te specifiek om te voorkomen dat volledig verlies van binding. Opmerking: Het is belangrijk dat de volgorde van de verwijzing is gebonden door de transcriptiefactor van belang (wij gebruikten in dit protocol Giant Gt), maar niet te sterk, zodat de zwakkere concurrenten kunnen het outcompete bij hoge concentraties.</li>
	<li>Het motief van de kern (8-12 paren in het algemeen baseren) uit te breiden tot een lengte van 16 basenparen of meer door de toevoeging van symmetrisch flankerende volgorde aan beide zijden (toevoegen zijketens voor de juiste binding). Indien nodig (voor meer afwachtte domeinen, bijvoorbeeld), langere reeksen (tot ~ 50 base paren in lengte zijn getest met de HiP-FA-assay) gebruiken. Let op: Wees voorzichtig niet om toe te voegen van basen die verwachting ectopische bandplaatsen maken. Gebruik computerhulpmiddelen die bandplaatsen van beschikbaar PWMs voorspellen ter vergemakkelijking van dit proces (b.v., PySite22).</li>
	<li>Als gelabelde referentie DNA, volgorde oligomeren die fluorescently op zijn gemarkeerd toekomen of reverse-strand aan de 3'- of 5'. Gebruik, bijvoorbeeld Cy5, Bodipy-650 of een andere geschikte kleurstof bij een concentratie van 10 µM (100 µM 10 x stock) in water, en verdunde stapsgewijze als beschreven in stap 3.1.</li>
	<li>Bereiden van 500 mL 1 x bindende buffer door toevoeging van 33 mM kalium fosfaatbuffer (pH = 7.0), 90 mM NaCl, en de niet-ionogene afwasmiddel 0,01% in gedestilleerd water. Ook bereiden 3 x bindende buffer, waarin dezelfde componenten, behalve bij drievoudig concentraties. Als 3 x bindende buffer gebruikt als voorraadoplossing voor de 1 x bindende buffer, bereiden volumes > 500 mL; anders, het bereiden van 250 mL. Opmerking: Deze samenstelling is geoptimaliseerd voor transcriptie factor stabiliteit en ter voorkoming van glutathione S-transferase (GST) dimerisatie.</li>
	<li>Maatregel met de microscopie setup beschreven in stap 1 de FA van 200 µL van bindende buffer met 0.8 nM label referentie DNA in aanwezigheid van verschillende hoeveelheid TF in een glas microscopie 96-Wells bodemplaat (5-6 putjes met verschillende concentraties van de TF) te Bepaal de concentratie van de TF te gebruiken. Uitvoeren van een reeks van de titratie met steeds grotere hoeveelheden TF en kiezen voor de bepaling van de concentratie waarvan de curve een plateau, met vermelding van de volledige afhankelijkheid van de DNA referentie oligomeren bereikt. Opmerking: De optimale TF-concentratie afhankelijk van de waarden van de dissociatieconstanten TF-DNA. Lagere KDs vereisen in het algemeen lagere concentraties.</li>
</ol>3. oligomeren gloeien
<ol><li>Meng 7 µL van een 10 mM kleurstof-geëtiketteerden uit single-stranded DNA oplossing en 7 µL van een 10 mM concentratie van haar labelloze omgekeerde aanvulling in 186 ÂµL van water te ontharden de DNA oligomeren van de gelabelde verwijzing DNA (volgorde bepaald in de vorige stap).</li>
	<li>Voor de concurrent DNA-sequenties, meng 20 µL van 100 mM oplossingen (in water, geleverd door de fabrikant) van voorwaartse single-stranded DNA met 20 µL van 100 mM van de bijbehorende omgekeerde single-stranded DNA voor elke individuele concurrent sequentie te meten.</li>
	<li>Voer het gloeien afzonderlijk in een standaard PCR-cycler door de oplossingen tot 70 ° C gedurende 3 minuten opwarmen en daalt de temperatuur aan RT met een snelheid van 0.1 K/s. Als de machine van de PCR gebruikt biedt geen ondersteuning voor temperatuurgradiënten tegen die koers, gewoon doen stapsgewijze incubations met dalende temperaturen (99 cycli van 3 getest werden s met-0.4 K per cyclus).</li>
</ol>4. voorbereiding van het gel
Opmerking: Het volgende gedeelte wordt uitgelegd op de voorbereiding van twee verschillende soort gels: 1) de titratie putten gels met eiwit bevatten en worden gebruikt om te bepalen van de KDs voor de respectieve concurrent DNA-sequenties, en 2) de kalibratie putten gebruikmaken van NB aan Bepaal de concentratie van de DNA op elk gegeven moment punt en overname hoogte. De focus ligt op de voorbereiding van het experiment in een 96-wells-plaat, maar de overeenkomstige volumes voor een 384-well plaat-formaat worden ook aangegeven.
<ol><li>Los 0,5% w/v lage smeltpunt agarose in de bindende buffer door het te koken in een magnetron laboratorium. Na volledige ontbinding, het volume opnieuw met ddH2O om mogelijke verdamping te compenseren. Opmerking: Voor het gemak, bereiden een voorraad van 10-20 10 mL aliquots van de gels en hen bij 75° C smelten wanneer ze nodig zijn. Gel voorraden kunnen worden opgeslagen op RT. Let op: Wees voorzichtig om te voorkomen dat kookvertraging van de gel-oplossing in de magnetron. Korte opwarmtijd tussen intervallen met schudden zijn te verkiezen boven.</li>
	<li>Als voorbereiding hierop titratie en kalibratie wells smelten eerst twee 10 mL gel voorraad aliquots bij 75 ° C onder het schudden.<ol>
<li>240 µL (inclusief 20% overhead) voor elke concurrent gebruiken (n = aantal concurrent sequenties).</li>
		<li>Gebruik dezelfde hoeveelheid gel voor de NB kalibratie goed om een gelijke temperatuur en viscositeit van beide gels.</li>
		<li>Vervolgens de temperatuur instellen tot 35 ° C en wacht tot de temperatuur equilibreer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de titratie putten, 1,4 nM (eindconcentratie) gekruist verwijzing DNA (verkregen in stap 3), TF eiwit toevoegen (eindconcentratie CTF = 20-60 nM, zoals bepaald in stap 2.6), DTT (0.2 mM) en bindende buffer in een totaal volume van n x 200 µL of n x 13 µL in een 96 - of 384-well plaat formaat, respectievelijk (plus overhead). Meng grondig door omkeren/schudden (doen niet vortex).</li>
	<li>Voeg langzaam 200 µL per putje in 96-wells-plaat formaat (13 µL per putje voor 386 putten) van de gel-oplossing bereid in de vorige stap in de titratie putten de goed plaat.</li>
	<li>Voor de kalibratie putten, eerst toevoegen 5 nM NB tot de gesmolten gel buiten de putten (totaal volume afhankelijk van de indeling van de plaat goed gebruikt en op het aantal kalibratie wells; meestal 5-6 per plaat goed is genoeg).</li>
	<li>Pipetteer 200 µL (13 µL voor 384-well plaat formaat) voor NB met gel langzaam binnen de titratie putjes van de plaat goed en zorg ervoor om luchtbellen te voorkomen. Opmerking: Het gebruik van elektronische pipets of Robotica verhoogt aanzienlijk de reproduceerbaarheid.</li>
	<li>Laat de gel stollen voor 10 min op RT en een ander 10 min bij 4 ° C (condensatie aan het glas daarna indien nodig verwijderen). Zorg ervoor dat al deze stappen op een perfect horizontaal oppervlak te vermijden inhomogene gel oppervlakken voeren. Let op: De eiwitten met gels zijn meestal stabiel voor ten minste enkele uren bij 4 ° C.</li>
</ol>5. toevoegen de concurrent DNA-oplossing
Opmerking: De volgende oplossingen moeten worden voorbereid voordat de titratie en gelijktijdig worden toegevoegd op de top van de kalibratie en titratie putten.
<ol><li>Voeg dat de ontharde label referentie DNA en eiwit in 3 x bindende buffer bij 3 keer hogere concentraties dan de voorraad aliquots van gel.<ol>
<li>Mix 20 µL van de verkregen oplossing met 40 µL van elk gegloeid concurrent DNA oplossing verkregen in stap 3.</li>
		<li>Voor elk putje kalibratie, meng 20 µL van 3 x bindende buffer met 15 mM NB oplossing met 40 µL van ontharde concurrent DNA (een willekeurige combinatie van dezelfde lengte is geschikt). Opmerking: De 384-Wells-platen, gebruik 21 µL in plaats van 60 µL in totaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optioneel, controleren de homogeniteit van de gel hoogte niveaus in de verschillende putjes van de plaat spectroscopically door het meten van de absorptie bij 380 nm, met behulp van een multi goed-afleesapparaat (de extinctie waarden in verhouding staan tot de hoogten van de gel).</li>
	<li>Voeg 50 µL (7 µL voor 384-well plaat formaat) van de gemengde concurrent DNA oplossingen (gegloeid in stap 3) op de top van de gels. Probeert toe te voegen van alle oplossingen van de concurrent zo gelijktijdig mogelijk met behulp van elektronische via meerdere kanalen pipets of een pipetting hoofd van 96-kanaal, indien beschikbaar. Na toevoeging van de oplossingen van de concurrent, plaats van de plaat in het werkgebied van de Microscoop en start van de metingen onmiddellijk (stap 7).</li>
</ol>6. de Beeldacquisitie
<ol><li>Sequentieel verwerven tijden reeks z-stapels (bijvoorbeeld gebruik 12 vliegtuigen en 100-300 ms verlichting tijd). Vermijden van opnamen te dicht aan de oppervlakte goed (< ~1.4 µm met de platen gebruikt hierin) uit te sluiten van polarisatie vooringenomenheid.</li>
	<li>10-25 cycli van metingen tot volledige loskoppelen van het DNA van de gelabelde verwijzing van de TF uit te voeren. Het eindpunt wordt meestal bereikt na 1-2 uur, afhankelijk van de bindende kinetiek en richtgetal van de concurrent DNA.</li>
</ol>7. extractie van FA(z,t) van onbewerkte gegevens
<ol><li>Zodra een goed plaat heeft zijn beeld, berekenen van de ruwe fluorescentie beelden de gemiddelde pixelwaarden van regio's van belang voor de parallel (I=) en loodrecht (I+) gepolariseerde intensiteit componenten (Figuur 1c). Dit kan gebeuren automatisch met behulp van de heup-FA software23. Opmerking: De HiP-FA-software, een handleiding en een test dataset kunnen gedownloade23. Ook gebruiken een andere aangepaste-geschreven software te halen ik= en ik+ en de stroomafwaartse analyses van de titratie curven, uit te voeren zoals in detail hieronder beschreven.</li>
	<li>FA voor elk putje berekenen. Voor elk putje, het script berekent FA(z,t) op elke z-positie en tijd wijs t volgens: Vergelijking 1:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq1.jpg"> Waar G is het instrument G-factor die corrigeert voor vooringenomenheid richting het loodrecht kanaal.</li>
	<li>De G-factor van de microscopie setup bepalen door het meten van de FA van oplossingen met een fluorescente kleurstof van bekende anisotropie. Uitpakken van de polarisatie van de twee componenten van het signaal en gebruik vervolgens vergelijking 1 G, te weten de FA van de oplossing te verkrijgen (G = 1.15 bij deze instelling).</li>
</ol>8. de kalibratiekromme voor bepaling van concurrent DNA concentratie van FANB
<ol><li>Anneal 120 µL van elke voorwaartse en omgekeerde referentie oligomeren (100 mM voorraad concentratie; elke willekeurige volgorde met dezelfde lengte als de concurrent reeks kan worden gebruikt) en meng met 120 µL van 3 x bindende buffer met NB (15 nM).</li>
	<li>Voorbereiden van een verdunningsreeks met 1:2 verdunnen in 1 x bindende buffer met 6 verdunningen in totaal. Mix-50 µL van deze verdunningen met 200 µL van 0,5% laag smeltpunt agarose (T > 35 ° C) gel in 1 x bindende buffer met 5 nM voor NB in triplicates.</li>
	<li>Toevoegen van 200 µL van elk van de 6 oplossingen bereid in de vorige stap in een 96-wells-plaat en de plaat gedurende 1 uur bij 4 ° C om ervoor te zorgen volledige gelering, vervolgens 1 h op RT. maatregel de FANB van de oplossingen met behulp van de heup-VA-instellingen wilt opslaan.</li>
	<li>Pak FANB (z, t) volgens de vorige stap en passen de gegevens met behulp van een Hill-vergelijking: Vergelijking 2:<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq2.jpg"> Waar CDNA is de concentratie van de DNA-oligomeren; k de concentratie van de DNA-oligomeren op welke helft van de bandplaatsen zijn bezet; VA-max is een constante normalisatie; en n is de Hill coëfficiënt. k, FAmax, en n zijn ingesteld als vrije parameters tijdens de installatie procedure.</li>
	<li>Voer de drie parameters die verkregen van de procedure van de montage in de software van de heup-FA (in het linker onderste paneel).</li>
	<li>Herhaal de vaststelling van de kalibratiekromme om de paar maanden of na het aanbrengen van wijzigingen in de instellingen van de microscopie.</li>
</ol>9. de bepaling van de concurrent DNA concentratie
<ol><li>De HiP-FA-software gebruiken voor het uitpakken van c (z, t) van de FANB(z, t) -metingen (Figuur 3). Eerst krijgen de kalibratiekromme zoals beschreven in de vorige sectie en voer de montage-parameters op de software (zie handleiding voor details).</li>
	<li>Gebruik het programma automatisch geëxtrapoleerd c(z,t) voor het gebruik van c < 100 nM (zie handleiding voor details) vergelijking 3 (Figuur 3,b), die de eendimensionale verspreiding van de concurrent DNA binnen de agarose gel matrix beschrijft, uitgaande van gratis verspreiding. Vergelijking 3:<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq3.jpg"> Waar C0 is de beginconcentratie van de concurrent DNA; EVF is de error-functie; z is de positie; D is de coëfficiënt van de verspreiding van de concurrent DNA; en t0 is het moment van aanvang van de metingen. De gratis parameters gebruikt zijn C0 en z /<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq4.jpg">.
</li>
</ol>10. conventionele concurrerende titratie met heup-FA voor zeer sterke DNA-bindende
<ol><li>Serieel Verdun de verschillende concurrent DNA oligomeren in de rijen van een 96-wells-plaat (of 384-well plaat) bij de concentraties van: 0, 1.25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900, en 4000 nM. Toevoegen van de verwijzing van Cy5-geëtiketteerden DNA (1 nM) en TF (20-50 nM) met een constante concentratie, met een totaal volume van 200 µL per putje in bindende buffer (Figuur 5een). Thermodynamisch evenwicht wordt bereikt 40 min wachten en verwerven (met de HiP-FA-setup) z-stacks voor elk putje (verschillende afbeeldingen per putje ophalen variabiliteit vermindert door het gemiddelde van de berekende waarden van de FA te).</li>
	<li>Het evenwicht bindend titratie krommen te construeren en ze passen met vergelijking 4 (Figuur 5b). De KDs bepaald door conventionele concurrerende titratie zijn identiek zijn aan die verkregen door heup-FA met behulp van een agarose gel matrix20.</li>
</ol>11. montage van de Procedure van de FA titratie curven
<ol><li>Weergave in de HiP-FA-software de gereconstrueerde titratie curven voor de individuele concurrent sequenties FA(z,t) = f[c(z,t)] en visueel controleren de kwaliteit van de gegevens (zie handleiding voor details). Indien nodig, verfijnen van de parameters die worden gebruikt voor de bepaling van de concentraties van concurrent DNA in stap 10.</li>
	<li>Elke individuele titratiecurve automatisch met behulp van vergelijking 4, waardoor een analytische oplossing voor concurrerende titratie assays24passen. Vergelijking 4:<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq5.jpg"> Met:<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq6.jpg"> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq8.jpg"> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq9.jpg"> Waar RT is de eiwitconcentratie; LT is de labelloze en LST is de gelabelde DNA-concentratie; KD2 is de dissociatieconstante te worden vastgesteld; RT is de concentratie van actieve eiwit; en A en B zijn normalisatie parameters. Eerst bepalen KD1, die als referentie voor de bepaling van de verschillende waarden van KD2 dient . KD1 is kan gemakkelijk worden bepaald met de test door te kiezen voor de volgorde van de kleurstof-reference DNA als de volgorde van de labelloze concurrent DNA (zie handleiding).</li>
	<li>Voer de verkregen waarde van KD1 in de software en de KD2 -waarden berekenen voor alle van de concurrent DNA op de plaat. Opmerking: De gratis parameters van de passende procedure zijn KD2, R,T, A en B.
</li>
	<li>Exporteer de dissociatieconstante KD2 en de concentratie van actieve eiwitten RT voor alle individuele titratie-putjes van de plaat door te klikken op de "Export" knop in de software.</li>
</ol>12. PWM bouw, specificiteit van eiwit-DNA-interactie, en Pseudo graven
Maak de reeks logo's voor de verschillende PWMs met behulp van de online tool WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) zoals eerder beschreven20.

<ol>
	<li>Berg, O. G., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+DNA+binding+sites+by+regulatory+proteins.+Statistical-mechanical+theory+and+application+to+operators+and+promoters.">Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters.</a> Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).</li><li>Hammar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+transcription+factor+dissociation+excludes+a+simple+operator+occupancy+model+for+gene+regulation.">Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation.</a> Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells.">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li><li>Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+expression+patterns+from+regulatory+sequence+in+Drosophila+segmentation.">Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation.</a> Nature. 451, 535-540 (2008).</li><li>Schroeder, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+in+the+segmentation+gene+network+of+Drosophila.">Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila.</a> PLoS Biology. 2, 271 (2004).</li><li>He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+models+of+transcriptional+regulation+by+enhancers:+the+roles+of+synergistic+activation,+cooperative+binding+and+short-range+repression.">Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression.</a> PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).</li><li>Wilson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Transcription+in+Mice+Carrying+Human+Chromosome+21.">Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21.</a> Science. 322, 434-438 (2008).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnaase+footprinting+-+simple+method+for+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-plasmon+resonance+for+gas-detection+and+biosensing.">Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing.</a> Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, (2010).</li><li>Berger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+universal+DNA+microarrays+to+comprehensively+determine+transcription-factor+binding+site+specificities.">Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities.</a> Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).</li><li>Nitta, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+transcription+factor+binding+specificities+across+600+million+years+of+bilateria+evolution.">Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Binding+Specificities+of+Human+Transcription+Factors.">DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Noyes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+characterization+of+factors+that+regulate+Drosophila+segmentation+via+a+bacterial+one-hybrid+system.">A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system.</a> Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).</li><li>Nutiu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+DNA+affinity+landscapes+on+a+high-throughput+sequencing+instrument.">Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument.</a> Nature Biotechnology. 29, (2011).</li><li>Riley, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX.-seq:+a+method+for+characterizing+the+complete+repertoire+of+binding+site+preferences+for+transcription+factor+complexes.">SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes.</a> Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).</li><li>Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+approach+to+measuring+the+binding+energy+landscapes+of+transcription+factors.">A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors.</a> Science. 315, 233-237 (2007).</li><li>Isakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMiLE-seq+identifies+binding+motifs+of+single+and+dimeric+transcription+factors.">SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors.</a> Nature Methods. 14, 316-322 (2017).</li><li>Jung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=True+equilibrium+measurement+of+transcription+factor-DNA+binding+affinities+using+automated+polarization+microscopy.">True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy.</a> Nature Communications. 9, 1605 (2018).</li><li>Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+the+fluorescence+of+macromolecules:+Fluorescent+conjugates+of+ovalbumin+and+bovine+serum+albumin.">Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin.</a> Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Reutern/PySite">https://github.com/Reutern/PySite</a> (2018)</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA">https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</a> (2018)</li><li>Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).</li><li>St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo.">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-220 (1992).</li><li>Pankratz, M., J&#228;ckle, H., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. , 467-516 (1993).</li><li>Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+for+Transcription+Factor+Binding+Site+Identification+Using+Nonindependent+Interactions.">Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions.</a> Genetics. 191, (2012).</li><li>Noureddine, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+functional+impact+of+sequence+variation+on+p53-DNA+interactions+using+a+novel+microsphere+assay+for+protein-DNA+binding+with+human+cell+extracts.">Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts.</a> PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).</li><li>Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithm+for+prediction+of+tumour+suppressor+p53+affinity+for+binding+sites+in+DNA.">Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).</li><li>Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+measurements+of+molecular+interaction+kinetics+on+a+microfluidic+platform.">Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

HiP-FA is een uitgebreide nieuwe methode voor de bepaling van de bindende voorkeur landschappen van TF-DNA interacties. Het meet de bindende verwantschappen van vogelgriepvirus DNA motief varianten direct, het vermijden van eventuele onderliggende veronderstelling dat bindende voorkeuren worden weerspiegeld in de frequentie van voorkomen van de nucleotide in een set van boven-drempel bindmiddelen. Meting plaatsvindt in de oplossing zonder immobilisatie en mechanische of chemische interferentie met de bindende reactie, evenwichtsvoorwaarden zo dicht mogelijk benadert. De gecontroleerde levering systeem toelaat de meting van een volledige titratiecurve binnen één goed en verhoogt de doorvoer én betrouwbaarheid tijdens het opslaan van eiwit. Met behulp van een doelstelling met een hoge numerieke diafragma en EM-CCD-camera met een hoge licht collectie efficiëntie zorgt voor hooggevoelige fluorescerende licht detectie. Vandaar, met deze setup, kleine FA verandert zo laag als 10-15 mP nauwkeurig kan worden opgespoord; in de praktijk betekent dit dat een reactie van de bindende waarvoor de massale verhoging na bindend minimaal is (zo laag als een massaverhouding van 2) gemakkelijk wordt gedetecteerd. Dit is meestal niet het geval met commerciële systemen zoals microplate lezers. Als gevolg van de hoge gevoeligheid vergroot HiP-FA het bereik van dissociatieconstanten dat betrouwbaar kan worden gewaardeerd in de picomolar bereik. Bindende energieën zijn nauwkeurig bepaald over meerdere ordes van grootte.
Om te beoordelen van de kwaliteit van de herziene PWMs, hebben we twee soorten analyse20uitgevoerd. We testten, voor vijf factoren van het gen-netwerk van segmentatie, hoe goed de verschillende PWMs experimentele ChIP-seq-profielen in de genomische regio's van 21 segmentatie genen kunnen voorspellen. Als een tweede test gebruikten we een reeksexpressie-model4 dat expressiepatronen van de versterkers van de segmentatie op basis van de bindende voorkeur en eiwit concentratie van deelnemende TFs voorspelt. In beide oefeningen, vonden we dat de minder specifieke HiP-FA PWMs aanzienlijk presteren beter dan de meer specifieke footprinting en B1H PWMs20.
In tegenstelling tot DOVO methoden vereist HiP-FA enige voorkennis van een bepaalde TF bindende voorkeur. Echter consensus sequenties staan bekend om de vele TFs, en kunnen vele bestaande methoden leveren ze13,14,15. Indien nodig, kan de volgorde waar optimale bindende iteratief worden gevonden.
We gebruikten DNA referentie oligomeren fluorescently gekenmerkt met Cy5 en Bodipy-650. Deze kleurstoffen hebben bewezen goed voor FA metingen uit te voeren, aangezien de anisotropie van afhankelijke en niet-afhankelijke geëtiketteerd-reference DNA waren de grootste onder de verschillende geteste kleurstoffen. Dit zorgt voor een maximale dynamische bereik voor de waarden van de FA. In het algemeen een fluorescente kleurstof met een fluorescentie levensduur ≥ 1 ns dreigt te worden geschikt maar er moet eerst worden getest. Indien mogelijk, is het raadzaam met kleurstoffen oplichtende in het nabij-IR-bereik te minimaliseren eiwit autofluorescence.
De meest kritische stap van de experimentele procedure is de pipetteren van de gel in de goed platen. Goede reproduceerbaarheid vereist de gel volumes worden zo uniform mogelijk. Wijzigingen in de hoogte van de gel worden vertaald naar veranderingen van richtgetal voor de concurrerende DNA oligomeren en dus schijnbare wijzigingen van affiniteit bij de beoordeling van de gegevens. Dit is de belangrijkste bron van variantie in een technische repliceren. Het gebruik van een elektronische Pipetteer of automatisering technieken verbetert reproduceerbaarheid. Luchtbellen binnen de gel kunnen worden voorkomen door langzaam en voorzichtig pipetteren. Het is ook belangrijk als toe te voegen de alle concurrent oplossingen op de top van de titratie putjes met weinig vertraging mogelijk. Voor beste reproduceerbaarheid, kan het hele proces worden geautomatiseerd met behulp van een pipetting robot met warmte starterscentra. Een essentieel onderdeel voor het overbrengen van het protocol aan automatisering is de noodzakelijke optimalisering van incubator temperatuur en de tijden van de incubatie. Zorg ervoor dat het vinden van een optimaal evenwicht tussen de viscositeit van de gel (dwz., niet te koud) en de stabiliteit van eiwitten (dat wil zeggen, niet te warm). Dit is afhankelijk van zowel de verstrekking snelheid van de gels in de putten en de stabiliteit van het eiwit gebruikt.
HiP-FA maakt gebruik van een gecontroleerde expresbezorgingssysteem voor de concurrent DNA oligomeren. Voor de bouw van de titraties bochten, is het noodzakelijk om te bepalen van de concurrent DNA concentratie c(z,t) voor elke gegeven z-positie in de matrix van gel en punt ttijd. Dit is een andere kritische stap, aangezien de bepaling van de K-Ds is rechtstreeks afhankelijk van c(z,t). Kalibratie putten met de kleurstof NB als een sensor voor DNA concentratie worden gebruikt voor dit doel (Figuur 1d, Figuur 2een). 3-5 kalibratie putten met NB per plaat zijn meestal voldoende. Voor de evaluatie van een heup-FA experimenteren, een NB kalibratiekromme moet worden gebouwd voor de set-up door het uitvoeren van een reeks conventionele titratie NB opgelost in de agarose gel met een concurrent DNA van een willekeurige tekenreeks in verschillende concentraties (Figuur 3 een), zoals toegelicht in stap 8. In het geval van zeer sterke bindende (KD < 500 uur), de extrapolatie gebruikt voor bepaling van de lage concentraties van concurrent DNA wordt beperkt, aangezien het is minder nauwkeurig dan een directe meting. Echter voor TFs met dergelijke lage KDs, kan de HiP-VA-instellingen worden gebruikt voor het uitvoeren van een conventionele concurrerende titratie in bindende buffer zonder het gebruik van een agarose gel matrix (Figuur 5). Bijvoorbeeld kan een volledige titratie met 12 verschillende concentraties van concurrent DNA worden uitgevoerd in één rij van een 96-wells-plaat.
De gecontroleerde levering systeem vereist ook snel TF-DNA-bindende kinetiek en stabiele eiwitten, sinds de verspreiding, hoewel de agarose gel is dynamische (hoewel langzaam). Beide eigenschappen kunnen rechtstreeks met de HiP-VA-instellingen worden getest door volgende, na verloop van tijd de FA van de tFSClassificatie van belang wanneer gebonden aan hun respectieve fluorescently label referentie DNA. Wij KON en KOFF tarieven voor de onderzochte factoren gemeten en vond hen over de volgorde van milliseconden seconden20, overeenkomstig andere studies30. Dit is voldoende snel om ervoor te zorgen dat de metingen bij evenwicht plaatsvinden. In het geval van andere bindende reacties met langzamere kinetiek, kan het richtgetal van de concurrent worden afgestemd door verlaging van de concentratie of gel porie verkleinen. In het geval van de geteste TFs, die alle hebben snel TOFF (~ seconden), een meting van de totale tijd van ongeveer 1-2 h volstaat om thermodynamische evenwicht bij elke meting.
Een andere mogelijke kwestie met betrekking tot de proteïne is de vorming van eiwit-aggregaten die FA metingen kan veranderen. Het gebruik van andere voorwaarden van de buffer met verschillende toevoegingen (zoals tensides) kunt voorkomen dat de vorming van het aggregaat, indien nodig.
We hebben gewerkt in de veronderstelling van de lineariteit van de PWM; HIP-FA kan echter worden aangepast om op te nemen van alle mogelijke di-nucleotide mutaties van de reeks van de consensus. Ten slotte, HiP-FA kan worden aangepast aan andere soorten bindende interacties te meten. De voorwaarde is om te hebben beschikbaar een geschikte referentiemiddelen molecuul gebonden door de proteïne die fluorescently kan worden aangeduid. Met de gecontroleerde levering systeem, kunnen een gradiënt van de concentratie worden gegenereerd voor elk soort ligand; Daarom is eiwit-eiwit en drug-eiwit interacties kunnen worden gemeten met ook high fidelity en doorvoer.

Gezien de centrale rol van transcriptiefactoren (TFs) in genregulatie, bepalen hun bindende voorkeuren op een kwantitatieve manier is van het allergrootste belang. Baanbrekende studies door von Hippel introduceerde de notie dat regelgevende TFs snel DNA herkennen, zodanig dat hun bindende goed door het thermodynamische evenwicht, beschreven is terwijl de stroomafwaartse gebeurtenissen van het werven van RNA-polymerase aan de organisator worden gecontroleerd door langzamer kinetiek1. Recente in vivo bindende studies suggereren dat deze foto waarschijnlijk meer complexe2,3 is; echter deze algemene uitgangspunten dienen als goede benaderingen en veel computationele benaderingen om te zoeken van cis-regulerende elementen en voorspellen van expressie van reeksen4,5,6hebben gesteund. Hoewel evenwicht bindend heeft dus met succes werkzaam als een concept, huidige methoden voor de bepaling van de TF-DNA interacties richten op bindende specificiteit en meestal niet direct maatregel bindend affiniteiten bij evenwicht. Het systematisch meten van TF-DNA-bindende vertegenwoordigt een grote technische uitdaging, en de bestaande methoden hebben meerdere verschillende beperkingen.
Chromatine immunoprecipitation gevolgd door diepe sequencing (ChIP-seq)7, de meest voorkomende in vivo techniek, niet toe dat de meting van bindende affiniteiten of de precieze lokalisatie van bindende sites binnen genomic fragmenten. Verscheidene in vitro methoden, waaronder DNase footprinting8, elektroforetische mobiliteit shift (EMSA)9oppervlakte plasmon resonantie (SPR)10en11 thermophoresis microscale zijn kunnen bindende affiniteiten, meten maar ze zijn relatief lage doorvoersnelheid. High throughput technieken waaronder eiwit bindende microarrays12, HT-SELEX13,14en bacteriële één-hybride (B1H)15 zijn daarentegen niet in staat voor het meten van bindende affiniteiten en meestal opbrengst overdreven specifieke bindend sequenties, die voornamelijk te wijten aan de strenge selectie of wassen stappen nodig. Recentere ontwikkelingen omvatten de diepe rangschikken gebaseerd HiTS-FLIP16, SELEX-seq17, en de microfluidics gebaseerde MITOMI18 of GLIMLACH-Seq19, waarmee voor extractie van absolute bindende affiniteiten; echter, ze rekenen op het meten van de intensiteit van de fluorescentie van gelabelde TF en DNA. Fluorescentie signalen, daarom geworden bij laag eiwitgehalte concentraties en bij het bepalen van de lage KD waarden beperken (< ~ 10 nM). Bovendien, de binding van de TF-DNA in deze methoden plaatsvindt op dunne oppervlakken, verhogen van problemen met aspecifieke bindende en/of auto-fluorescentie achtergrond, waardoor het moeilijk is te zwak bindend nauwkeurig te kwantificeren.
Om aan deze beperkingen, hebben we een nieuwe methode om te bepalen van TF-DNA affiniteit landschappen bij evenwicht en in oplossing, die we genoemd hoge prestaties fluorescentie anisotropie (heup-FA)20. De techniek is op basis van de gevestigde fluorescentie anisotropie (FA) assay21 maar gewijzigd om bindende constanten met hoge gevoeligheid en op grote schaal met behulp van een aangepaste geautomatiseerde Microscoop en analyse setup.
De FA-assay bewaakt de interactie van fluorescently geëtiketteerde soorten (zoals een DNA-oligomeren) aan een bindende partner, in dit geval een TF, door het meten van de moleculaire rotatie van het gelabelde molecuul. Bij binding met de TF verminderingen de rotatiesnelheid als gevolg van de hogere hydrodynamische straal en molecuulgewicht van het afhankelijke complex, wat in verhoogde FA resulteert. De nauwkeurige meting van zeer sterke binding (KD < ~ 1 nM) vereist het gebruik van lage concentraties van gelabelde, referentie DNA (c < ~ 1 nM). Dit is moeilijk te bereiken met een commerciële instrument zoals een standaard microplate-lezer. Daarnaast is een groot verschil (10-100 vouwen) tussen de afhankelijke en niet-afhankelijke complexen meestal nodig, verbod op meting van interacties tussen TF bindende domeinen en korte DNA oligomeren, die doorgaans ongeveer gelijkaardige molecuulgewichten . Tot slot, een volledige titratiecurve normaal vereist de voorbereiding en de meting van meerdere putten met een concentratie-reeksen voor de titrating soorten.
Om deze kwesties te behandelen, gebruiken we een widefield microscopie setup, gewijzigd om te bereiken weetje speurder gevoeligheid en FA metingen op verschillende z-posities van een enkele goed. Hierdoor kunnen we controleren bindende interacties tussen soorten van soortgelijke moleculair gewicht en met hoge affiniteit. Hogere doorvoer wordt bereikt door het meten van FA in multi goed plaat formaten en uitvoeren van een volledige titratie-serie in één goed met behulp van een gecontroleerde levering systeem (Figuur 1een). Door gebruik te maken van een concurrerende bindende bepaling, halen we bovendien niet alleen de bindende-constanten zijn, maar ook de concentratie van actieve eiwitten. Dit is een belangrijk kenmerk van de bepaling, omdat slechts een gedeelte van de geuite TF-moleculen zijn actief als gevolg van eiwit misfolding of degradatie. De experimentele opzet is gebaseerd op een commerciële epifluorescence Microscoop voorzien van XY - en Z-piezo stadia. We upgrade van het systeem met externe laser excitatie, dan ontdekt dat de twee uitgestoten lineaire polarisatie onderdelen op de chip van een EM-CCD-camera met hoge quantum efficiency voor lichte detectie (Figuur 1b en 1 c). Het systeem maakt gebruik van de doelstelling van een hoge numerieke diafragma (nvt) gekoppeld aan een uiterst gevoelige sensor en dus biedt zeer gevoelige FA metingen. Door het opnemen van fluorescentie z-stacks, kan interacties bindend worden gemeten langs de optische z-as bij het gebruik van een heterogene matrix voor de reactanten. Alle deze wijzigingen gemakkelijk op een bestaand systeem kunnen worden uitgevoerd en kosteneffectiever zijn.
Hanteren wij een concurrerend bindende bepaling waarin de bindende affiniteit van een labelloze oligomeren van DNA is gemeten in vergelijking met de fluorescently geëtiketteerde DNA, die als een referentie dient. TF en verwijzing DNA zijn opgenomen bij vaste concentraties in een poreuze agarose gel matrix (porie maat ~ 1 µm) waaruit een niet-interactie klimaat voor de binding. De verwijzing DNA wordt gelabeld met Cy5. Deze kleurstof bleek te zijn geschikt voor FA metingen te wijten aan de relatief lange fluorescentie levensduur (~ 1ns) en fluorescentie emissie in de far-red van het zichtbare spectrum (lage auto-fluorescentie achtergrond). De TF-concentratie is in molaire overschrijding Cy5-reference DNA, ervoor te zorgen dat alle referentie DNA is gebonden aan eiwitten. Een oplossing van labelloze concurrent DNA wordt vervolgens gestort op het oppervlak van de gel en diffundeert binnen de poreuze matrix, tot oprichting van een gradiënt van de concentratie c (z, t) die over de z verandert-positie van het scherptevlak en de tijd t (figuur 1a, Figuur 2a-2 c). De TF gebonden aan het DNA Cy5-reference is dus lokaal blootgesteld aan verschillende concentraties van de concurrent DNA die concurreert voor bindende, wat leidt tot een dynamisch veranderende FA voor de Cy5-reference DNA FAREF(z, t) (Figuur 2b en 2 c).
Om te bepalen van de concurrent concentratie c(z,t), we meten in aparte wells (kalibratie wells) het dynamisch veranderende FA signaal van Nijl blauw (NB) FANB(z, t) (Figuur 2een en 3). Deze kleurstof intercalates in DNA en daardoor fungeert als een DNA-sensor voor de concurrent DNA. Met dit systeem voor gecontroleerde levering, kunnen tientallen tot honderden verschillende DNA-proteïne bindende verwantschappen binnen één Multi goed plaat (96 - of 384-well plaat formaat) worden gemeten. Meting gebeurt dan sequentieel tot volledige verplaatsing van de gelabelde referentie DNA uit de TF. We bepaald de bindende specificiteit voor een bepaalde factor door het meten van de verwantschappen van alle 3 N single-base mutaties van de opeenvolging van de consensus van lengte N. HiP-FA vereist lage hoeveelheden eiwit (~ pmols per titratiecurve) en toont laag variabiliteit in de bepaling van KDs [coëfficiënt van de variatie (CV) < 20%], terwijl het toestaan van metingen op relatief grote schaal. De methode kan handmatig of volledig geautomatiseerd met behulp van een robot-systeem, wat resulteert in nog lagere CVs (Figuur 4, bovenste deelvenster) worden uitgevoerd. Dissociatieconstanten worden gemeten met een hoge nauwkeurigheid tot 0,5 nM. Voor extreem hoge affiniteit (KD < 500 uur), gebruiken we een standaard concurrerende titratie (Figuur 5) als gevolg van de onnauwkeurigheden bij de waardering van concurrent DNA concentraties op een laag niveau (< 100 nM).
HiP-FA kan worden uitgevoerd op bijna elke standaard, omgekeerd, epifluorescence fluorescente microscoop, die de beschikbaarheid van een geautomatiseerde XY-fase en een piezo z-as. Optische componenten werden gebouwd rond een geautomatiseerde widefield installatie voorzien van een lange afstand doelstelling. In de praktijk, kan de bepaling worden aangepast aan de doelstellingen met andere kenmerken (in bepaalde werken, afstand en numerieke diafragma). Dit vereist echter een optimalisering van de parameters (afstanden tussen de z-segmenten, porositeit en hoogte van het agarose gel, enz.). Het gebruik van andere soorten lasers of camera is ook mogelijk. Een gedetailleerde beschrijving van de hele experimentele procedure en data-analyse is hieronder gegeven in de sectie protocol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:915px;" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:183px;">Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nile Blue A</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">N5632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">655891</td>
			<td>175 &#181;m thick glass bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">384 Well Sensoplate, black</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">788896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">A9414-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tween-20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:341px;">Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Q-POD Element</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZMQSP0DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Millipak 40 Gamma Gold Filter</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>MPGL04GK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Milli-Q Integral 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Quantum TIX</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>QTUMOTIX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mastercycler gradient</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:245px;">Z316083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.706.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tube 15 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MICROSCOPY SETUP:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Automated widefield microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long distance objective</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">638 nm line continuous diode laser</td>
			<td>Omicron</td>
			<td>PHOxX 638-40, 40mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back-illuminated EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon DV897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichroic mirror</td>
			<td>AHF</td>
			<td>640nm cut-off</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bandpass filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td>ET bandpass 700/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linear polarizer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">LPVISC050-MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">BS010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Achromatic lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>200 mm focal length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multimode optical fiber</td>
			<td>Optronis</td>
			<td>FVP600660710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ROBOTIC SYSTEM:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:341px;">Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek NXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SOFTWARE:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programming language</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Labview 9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Script for the HiP-FA software available at</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy

Nauwkeurige kwantificering van de transcriptiefactor (TF)-DNA interacties is van essentieel belang voor het begrijpen van de regulering van de genexpressie. Aangezien de bestaande benaderingen lijdt aan significante beperkingen, hebben we een nieuwe methode voor de bepaling van de TF-DNA-bindende affiniteiten met hoge gevoeligheid op grote schaal ontwikkeld. De bepaling is gebaseerd op het beginsel van de anisotropie (FA) gevestigde fluorescentie maar introduceert belangrijke technische verbeteringen. Eerst meten we een volledige FA concurrerende titratiecurve in een enkele goed door TF en een fluorescently geëtiketteerde DNA in een poreuze agarose gel matrix-verwijzing op te nemen. Labelloze DNA oligomeren wordt geladen op de top als een concurrent en, door middel van diffusie, vormt een spatio-temporele verloop. De resulterende VA-verloop wordt er vervolgens op voorgelezen met behulp van een aangepaste epifluorescence Microscoop setup. Deze verbeterde setup verhoogt de gevoeligheid van FA signaal detectie, waardoor zowel de sterke als de zwakke binding aan op betrouwbare wijze worden gekwantificeerd, zelfs voor moleculen gelijkaardige molecuulgewichten. Op deze wijze, kunnen we één titratiecurve per putje van de plaat in een multi goed meten en via een passende procedure, we zowel de absolute dissociatieconstante (KD) en de actieve eiwitconcentratie kunt uitpakken. Door het testen van alle single-point mutatie varianten van een bepaalde consensus reeks bindende, kunnen we de enquête van de gehele bindende specificiteit landschap voor een TF, meestal op een enkele plaat. De resulterende positie gewicht matrices (PWMs) beter te presteren dan die afgeleid van andere methoden in het voorspellen van in vivo TF bezetting. Hier presenteren we een gedetailleerde gids voor de uitvoering van heup-FA op een conventionele geautomatiseerde fluorescente microscoop en de data-analyse-pijpleiding.

We HiP-FA toegepast op TFs van de segmentatie gene netwerk25,26, die het anterior-posterior lichaam patroon van Drosophila embryo's, grotendeels door middel van transcriptionele verordening genereert. Vanuit dit netwerk, kozen we de bZIP domein TF Giant (Gt) voor een gedetailleerde analyse (Figuur 4). Aangezien full-length transcriptiefactoren moeilijk uit te drukken en de opbrengst van meestal de dezelfde bindende voorkeuren als hun DNA-bindende domeinen (DBD)13 zijn, wij gebruikt van de DBD gesmolten aan GST en uitgedrukt de constructie in E.coli GST fusion eiwitten aan leveren dezelfde resultaten op als DBDs alleen20.
De Gt consensus volgorde (eenTTACGTAAC) vertegenwoordigt de sterkste bindende volgorde dat wij vastbesloten zoals hierboven beschreven. We daarna onderzocht de invloed op de bindingsenergie van alle mogelijke single-punt mutaties binnen de 10-mer Gt consensus volgorde (een totaal van 30), geflankeerd door extra basen op de 5' en 3' einden. We gemeten twee replicatieonderzoeken waarvan gel monsters werden geproduceerd met behulp van automatisering, en één extra repliceren handmatig geproduceerd voor vergelijking. De KDs varieerden van 0,6 tot > 2000 nM voor afzonderlijk gemuteerde sequenties, en wij ook bevestigd volledig gebrek aan binding aan een reeks van "niet-bindende" (gegevens niet worden weergegeven).
TF-DNA-bindende specifieke kenmerken worden meestal gemodelleerd met behulp van een positie gewicht matrix (PWM), waarin een score aan elk mogelijk nucleotide op elke positie in het bindende motief is toegewezen. De PWM wordt ervan uitgegaan dat elke positie bijdraagt tot bindende kracht onafhankelijk en in de meeste gevallen vormt een voldoende model voor TF voorkeuren27bindend. We genereerden herziene PWMs op basis van onze metingen affiniteit volgende procedures28,29 vastgesteld en vergeleken ze aan twee PWMs die eerder zijn gemeld in de literatuur. De eerste is gebaseerd op de graven van de frequentie van de nucleotide van bindende sites geïdentificeerd door DNA footprinting4,5, en de tweede PWM werd verkregen door bacteriële één-hybride (B1H) selectie. 15
De grote gelijkenis van de PWMs voor de drie replicatieonderzoeken (Figuur 4, bovenste deelvenster), met inbegrip van voor de steekproef bereid handmatig (repliceren 3), toont de hoge reproduceerbaarheid van de methode van de heup-FA. Hoewel de PWMs verkregen door heup-FA algemene vergelijkbaar met de PWMs verkregen met de andere methoden (Figuur 4, lagere paneel), zijn er aanzienlijke afwijkingen: op positie 2 (zwarte pijl), het begin van het core bZIP motief, mutaties T > (G, C, A) tot volledig verlies van bindende in het motief verkregen door heup-FA, die in overeenstemming is met het motief van de B1H maar niet met die verkregen met DNase footprinting, waarin de bindende relatief sterk voor bases (G, A blijft). Omgekeerd, op plaats 7 (grijze pijl), de mutatie T > C leidt tot veel sterker bindend dan wat werd verwacht op basis van de eerder gemeten PWMs.
Andere afwijkingen zijn subtieler maar daarom niet minder belangrijk. De HiP-FA PWM is over het algemeen minder specifiek zijn dan de andere twee, als gevolg van het feit dat vele mutaties van de consensus nog steeds leiden matig sterke bindende tot. Dit kan worden gekwantificeerd aan de hand van de informatie-inhoud (IC). De IC is 11,5 bits voor de HiP-FA-matrix (gemiddelde van de drie replicaat-organismen), ten opzichte van IC = 13,4 en 16,8 bits voor de DNase footprinting en B1H matrices, respectievelijk. In het algemeen (hoewel niet universeel), de PWMs verkregen door heup-FA zijn minder specifiek zijn dan die welke zijn verkregen door andere methoden, die gebaseerd zijn op 26 TFs20onderzocht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> Figuur 1:schematische voorstellingen van de heup-FA assay en experimentele opzet. (a) gel expresbezorgingssysteem voor titrating concurrent DNA in één wells. (b) HIP-FA microscopie setup. Aangepaste geautomatiseerde widefield Microscoop met gepolariseerde fluorescentie lichte detectie op een EM-CCD-camera. (c) Raw fluorescentie afbeelding met de twee regio's van belang gebruikt om te bepalen van de parallel (rood) en de loodrecht (groen) gepolariseerde onderdelen. (d) de typische lay-out van een 96-wells-plaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> Figuur 2 : Raw FA gegevens en gereconstrueerde titratie curven. (a) typisch FA(z,t) traject voor een kalibratie putje met NB. (b, c) FA(z,t) tijd trajecten voor twee titratie putten meten van binding aan een sterke (b) en de meer gematigde DNA (c) bindende concurrent. (d, e) Overeenkomstige gereconstrueerd FA titratie metingen en voorzien van curven voor de sterke (d) en matig (e) bindend. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> Figuur 3 : Bepaling van de concentratie van de concurrent DNA c (z, t) met behulp van de Nijl blauw (NB). (a) FA-concentratie kalibratiekromme voor 16 basenparen DNA oligomeren. In een reeks conventionele titratie, is NB ingebed in de agarose gel samen met verschillende concentraties van concurrent DNA. De affiniteit van NB aan DNA is sequentie-onafhankelijke20; daarom de dezelfde kalibratiekrommen kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de c (z, t) voor verschillende DNA-sequenties van dezelfde lengte. (b) concurrent DNA-tijd verspreiding profiel op een willekeurige z -hoogte bepaald aan de hand van vijf kalibratie wells. Voor elke meting-cyclus, worden de gemiddelde FAs van vier NB-bevattende putten weergegeven als witte stippen. De curven zijn uitgerust met behulp van vergelijking 3 (witte lijn, individuele putten in kleur) en de c (z, t) bij lage concentraties (C < ~ 100 nM) wordt bepaald door de montage van de geëxtrapoleerde kromme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> Figuur 4 : Specifieke kenmerken van de bZIP domein familie TF Giant (Gt) bindend. HIP-FA PWMs van drie replicaties: twee bereid met behulp van automatisering en een handmatig bereid (bovenste deelvenster) worden vergeleken met PWMs gegenereerd door DNase footprinting en door de bacteriële één-hybride (B1H) selectiemethode (lagere paneel). Over het geheel genomen de HIP-FA bindende motieven eens met eerdere gegevens maar ook tonen aanzienlijke verschillen, zoals benadrukt met zwarte en grijze pijlen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> Figuur 5 : Conventionele concurrerende titratie met heup-FA. (a) plaat ontwerp toont 8 verschillende concurrent DNA serieel verdund in bindende buffer in één rij van een 96-wells-plaat. Een FA warmte kaart weergegeven voor verschillende willekeurige bindende kracht. (b) concurrerende titratie van drie concurrent Ani binden aan de Bcd TF met verschillende affiniteiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hier presenteren we een nieuwe methode voor de vaststelling van bindende affiniteiten bij evenwicht en in oplossing met hoge gevoeligheid op grote schaal. Dit verbetert de kwantitatieve analyse van transcriptie factor-DNA-bindende. De methode is gebaseerd op geautomatiseerde fluorescentie anisotropie metingen in een gecontroleerde levering systeem.

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Om het begrip van transcriptiefactor-DNA binding te verbeteren, ontwikkelden we een methode om dissociatieconstanten op grote schaal te meten met behulp van bijvoorbeeld anisotropiemetingen. Deze techniek maakt het verkrijgen van automatisch volledige titratie curven om de dissociatieconstante met hoge gevoeligheid te bepalen. Het werkt in oplossing op evenwicht, heeft een matige doorvoer en een groot dynamisch bereik.We hebben HiP-FA toegepast om het bindende affiniteitslandschap van transcriptiefactoren te verfijnen. Het protocol kan echter worden toegepast op andere soorten bindende gebeurtenissen, zoals eiwit-eiwit of eiwit-drug interacties, bijvoorbeeld. Ik adviseer om eerst meerdere titraties uit te voeren met dezelfde bindingspartners om een schatting te krijgen van de reproduceerbaarheid van de metingen.Gebruik indien beschikbaar een geautomatiseerd systeem voor een nog betere reducibility. Om de DNA-oligomers van het referentie-DNA te annealen, meng dan zeven microliters van elke tien millimolar di-label naar voren en niet-gelabelde omgekeerde streng in één buis. Voor de concurrent DNA, meng 20 microliter van elke 100 millimolar unlabeled streng in twee putten van een 96 welled PCR plaat.Gebruik vervolgens een standaard PCR-machine om de DNA-oplossingen gedurende de drie minuten op te warmen tot 70 graden Celsius. Verlaag vervolgens tot kamertemperatuur met een snelheid van 0,1 graden Celsius per seconde. Gebruik een magnetron om 0,5 gram agarose smelten in 100 milliliter bindende buffer.Voeg dubbel gedestilleerd water toe om het uiteindelijke volume aan te passen om mogelijke verdamping te compenseren. Bereid tien milliliter voorraad aliquots. Om de titratie- en kalibratieputten van een 96-putplaat voor te bereiden, breng je twee gelvoorraad aliquots over naar een 75 graden Celsius incubator shaker.Voeg voor elke titratie goed 1,4 nanomol aan referentie-DNA, transcriptiefactoreiwit, toe bij een uiteindelijke concentratie van 20-60 nanomol, 0,2 millimolar DTT en de bindende buffer tot 240 microliter van de gesmolten gel. Meng grondig door het omkeren en schudden van de buis. Dan, langzaam pipette 200 microliters per put van de DNA-bevattende gel in de aangewezen titratie putten van een 96 put plaat.Voeg voor elke kalibratie goed 5 nanomolnijlsblauwe kleurstof toe aan 240 microliter van de gesmolten gel. Het vermijden van luchtbellen, langzaam pipette 200 microliters van de kleurstof-bevattende gel oplossing in vijf tot zes putten van de 96 put plaat. Plaats de gel op een perfect horizontaal oppervlak en broed gedurende tien minuten op kamertemperatuur, en nog eens 10 minuten op 4 graden Celsius.Gebruik een multi-well plaatlezer om de homogeniteit van de gelhoogteniveaus in verschillende putten van de plaat te controleren. Om de DNA-oplossing van de concurrent voor te bereiden, combineert u eerst het gelabelde referentie-DNA, het eiwit en de drievoudig geconcentreerde bindingsbuffer. Meng vervolgens 20 microliter van de oplossing met 40 microliter van elk van de geannealed concurrent DNA-oplossingen.Combineer voor elke kalibratie goed de juiste hoeveelheden van een van de geannealed concurrent DNA-oplossingen en de drievoudige geconcentreerde binding buffer met 15 millimolar nijl blauwe kleurstof oplossing. Voeg ten slotte 50 microliter van de gemengde concurrentoplossingen zo gelijktijdig mogelijk toe aan de gels. Om te beginnen beeld verwerving, plaats de 96 goed plaat op de microscoop stadium.Neem vervolgens de tijdreeks van Z-stack beelden van putten tot het volledig ontbinden van het eiwit uit het referentie-DNA. Voer de titratietest uit volgens het manuscript. Gebruik vervolgens HiP-FA-software om titratiecurven te maken voor individuele concurrentsequenties.Klik vervolgens op de exportknop om de dissociatieconstante en concentratie van het actieve eiwit in elke titratie goed te verkrijgen. Let er vooral op bij het pipetteren van de geloplossingen die stroperig zijn. Onnauwkeurige pipetting kan de nauwkeurigheid voor de bepaling van de dissociatieconstanten verminderen.In deze studie wordt de HiP-FA-methode toegepast om de DNA-bindende voorkeuren van een B-zipped transcriptiefactor te bepalen. Reus, van het fly segmentatie gennetwerk. De hoge gelijkenis van de PWM's voor replica's die handmatig of met behulp van automatiseringstechnieken werden bereid, toonde de hoge reproduceerbaarheid van de HiP-FA-methode aan.PWM's verkregen door deze methode en andere methoden zijn over het algemeen vergelijkbaar. Er zijn echter significante afwijkingen te zien op posities twee en zeven van het kernmotief waar mutaties kunnen leiden tot volledig verlies van binding of veel sterkere binding dan eerdere metingen. We gebruiken HiP-FA om verfijningen te genereren voor de bindingen van tientallen transcriptiefactor en het laat zien dat uiteindelijk een betere voorspelling van gegevens wordt verkrijgt.Wij zijn van mening dat de meting van hoge nauwkeurigheid zeer nuttig kan zijn om de TF-DNA-binding voor het hele systeem of voor allerlei interacties beter te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...