Name: high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00
Duration: 6 min 38 s
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Wir bedanken uns bei J. Müller für cDNA Klonen und Mitglieder von Gallien Lab, insbesondere S. Bergelt, wertvolle Ratschläge und lebhafte Diskussion. Diese Arbeit wurde von SFB 646, regulatorische Netzwerke im Genom Ausdruck und Wartung (C.J., P.B), das Zentrum für integrierte Protein Science (UG) und die Graduiertenschule für Quantitative Biowissenschaften München (M.S.) unterstützt. UG nimmt zur Kenntnis, unterstützt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), die Bundesministeriums Für Bildung Und Forschung (BMBF: Ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie), und der Humboldt-Stiftung (Alexander von Humboldt Professur).

(1) Polarisation Mikroskopie
<ol><li>Für Weitfeld Laser Beleuchtung konzentrieren eine 638 nm-Linie von einem kontinuierlichen Diodenlaser (40 mW) auf die Öffnung des multimode Glasfaser für Strahl Bereinigung. Montieren Sie einen linearen Polarisator am Ausgang der Faser um die Polarisation des Laserlichts festzulegen.</li>
	<li>Blockieren Sie die Erregung Komponente des emittierten Lichts mit einem dichroitischen Spiegel (640 nm Cut-off) und ein Bandpassfilter (Bandpass 700/75).</li>
	<li>Lassen Sie das Fluoreszenzsignal einen polarisierenden Strahlteiler, durchlaufen die abgestrahlten Lichts in seine senkrechten und parallelen polarisierten Komponenten aufteilt. Dann konzentrieren Sie nicht reflektierte Strahl (parallele Komponente) und der reflektierte Strahl (senkrechte Komponente) mit einem achromatische Objektiv der Brennweite von 200 mm auf dem Chip einer Rückseite beleuchtet EM-CCD-Kamera (Abbildung 1b und 1 c). Verwenden Sie einen Spiegel, um die Richtung des Lotstrahl in Richtung das Objektiv anzupassen.</li>
</ol>2. design und Testen von Leuchtstoff-gekennzeichnete Referenz DNA-Oligomere
<ol><li>Die Kern-Sequenz des Verweises DNA zu bestimmen: die Methode basiert auf einem konkurrenzfähigen Assay, die Dissoziationskonstante (KD2) misst zwischen einem Transkriptionsfaktor und unbeschriftete Konkurrent DNA-Oligomere, die für die Bindung mit konkurriert eine Eindringmittel beschrifteten DNA deren Affinität zu den TF als eine Referenz (KD1 fungiert). Die Konsensussequenz stammen aus anderen Quellen wie DNase Footprinting oder bakterielle 1-Hybrid kann als ein ab Punkt5,15dienen. Hinweis: als Faustregel, eine geeignete Referenz DNA eine 3 bis 7-Fold Rückgang der Bindungsaffinität, die verglichen mit der Konsensussequenz TF hat.</li>
	<li>Messen von HiP-FA KD1s 2-3 vorläufige einzelne Mutationen der Konsensussequenz abgeleitet im vorherigen Schritt. Versuchen Sie, Positionen in Konsensussequenz mutieren, die nicht zu spezifisch zum vollständigen Verlust der Bindung zu vermeiden sind. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Referenzsequenz gebunden ist, durch den Transkriptionsfaktor von Interesse (wir haben in diesem Protokoll Riesen Gt), aber nicht zu stark, so dass schwächere Konkurrenten kann es bei hohen Konzentrationen verdrängen.</li>
	<li>Erweitern das Kern-Motiv (8-12 Paare im Allgemeinen stützen) auf eine Länge von 16 Basenpaaren oder mehr durch Hinzufügen von symmetrisch flankierende Sequenz auf beiden Seiten (Seitenketten für richtige Bindung hinzufügen). Bei Bedarf (für mehr wartete auf Domänen, z. B.), längere Sequenzen (bis ~ 50 base-Paare in der Länge mit dem HiP-FA-Assay getestet wurden) zu verwenden. Achtung: Achten Sie darauf, Unterseiten hinzufügen, die voraussichtlich ektopische Bindungsstellen zu schaffen. Verwenden Sie Berechnungswerkzeuge, die Bindungsstellen von verfügbaren PWMs zur Förderung dieses Prozesses (z. B. PySite22) vorhersagen.</li>
	<li>Als beschriftete Referenz DNA Reihenfolge Oligomere Eindringmittel mit der Bezeichnung auf entweder vorwärts oder rückwärts Strang 3' und 5' Ende. Verwenden Sie, z. B. Cy5, Bodipy-650 oder jede andere geeignete Farbstoff in einer Konzentration von 10 µM (100 µM 10 X bestand) in Wasser und verdünnten schrittweise als im Schritt 3.1 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL 1 x Bindung Puffer durch Zugabe von 33 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH = 7,0), 90 mM NaCl, und 0,01 % nichtionische Reinigungsmittel in destilliertem Wasser. Bereiten Sie auch 3 x Bindung Puffer, der die gleichen Komponenten, außer bei dreifacher Konzentrationen enthält. Wenn 3 x Bindung Puffer als Stammlösung für 1 x Bindung Puffer verwenden, bereiten Sie Bände > 500 mL; Ansonsten bereiten Sie 250 mL. Hinweis: Diese Komposition wurde optimiert für die Transkription Faktor Stabilität und Glutathion S-Transferase (GST) Dimerisierung zu verhindern.</li>
	<li>Maßnahme mit der Mikroskopie-Setup in Schritt 1 beschrieben die FA von 200 µL der Bindung Puffer mit 0,8 nM mit der Bezeichnung Referenz DNA in Gegenwart von anderen Betrag von TF in ein Glas Mikroskopie 96-Well Bodenplatte (ca. 5-6 Brunnen mit verschiedenen TF-Konzentrationen) bestimmen Sie die TF-Konzentration zu verwenden. Führen Sie eine Titration-Reihe mit steigenden Mengen von TF aus und wählen Sie für den Test die Konzentration für die Kurve ein Plateau, vollständige Bindung des Oligomers DNA Referenz angibt erreicht. Hinweis: Die optimale TF-Konzentration hängt von den Werten der TF-DNA Dissoziation Konstanten. In der Regel erfordern niedriger KDs niedrigere Konzentrationen.</li>
</ol>(3) Oligomer Glühen
<ol><li>Um die DNA-Oligomere des Verweises beschrifteten DNA (Sequenz bestimmt im vorherigen Schritt) Tempern, mischen Sie 7 µL einer 10 mm Farbstoff-markierten vorwärts einzelsträngige DNA-Lösung und 7 µL einer 10 mM-Konzentration von seiner unbeschrifteten umgekehrte Ergänzung in 186 µL Wasser.</li>
	<li>Mix für den Wettbewerber DNA-Sequenzen, 20 µL 100 mM Lösungen (im Wasser, vom Hersteller bereitgestellt) vorwärts einzelsträngiger DNA mit 20 µL von 100 mM von den entsprechenden reverse-einzelsträngige DNA für jede einzelne Wettbewerber Sequenz gemessen werden.</li>
	<li>Führen Sie das Glühen separat in einem standard PCR Cycler durch Aufheizen der Lösungen auf 70 ° C für 3 min und verringern die Temperatur auf RT mit einer Rate von 0,1 K/s. Wenn die PCR-Maschine verwendet Temperaturgradienten zu diesem Satz nicht unterstützt, tun einfach schrittweise Inkubationen mit sinkenden Temperaturen (getestet wurden 99 Zyklen von 3 s mit-0,40 K pro Zyklus).</li>
</ol>(4) Gel-Vorbereitung
Hinweis: Der folgende Abschnitt erläutert die Vorbereitung von zwei verschiedenen Arten von Gele: (1) die Titration Brunnen Gele mit Eiweiß enthalten und werden verwendet, um die KDs für den jeweiligen Wettbewerber DNA-Sequenzen zu bestimmen, und (2) die Kalibrierung Brunnen NB zu nutzen die DNA-Konzentration in jeder gegebenen Zeit Punkt und Erwerb Höhe zu bestimmen. Der Schwerpunkt liegt auf der Vorbereitung des Experiments in einer 96-Well-Platte, aber die entsprechenden Mengen für ein 384-Well-Platte-Format werden ebenfalls angegeben.
<ol><li>Lösen Sie 0,5 % w/V niedrigen Schmelzpunktes Agarose im Puffer Bindung durch Kochen in einem Labor Mikrowelle auf. Nach vollständiger Auflösung die Lautstärke wieder mit DdH2O, um mögliche Verdunstung auszugleichen. Hinweis: der Einfachheit halber bereiten Sie einen Bestand von 10-20 10 mL Aliquots der Gele vor und schmelzen sie bei 75° C zu, wenn sie benötigt werden. Gel-Bestände bei RT speicherbar Achtung: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, die Überhitzung der Gel-Lösung in der Mikrowelle. Kurze Aufheizzeit, die Intervalle mit zitternden dazwischen vorzuziehen sind.</li>
	<li>Zur Vorbereitung der Titration und Kalibrierung Brunnen zuerst schmelzen Sie zwei 10 mL Gel Lager Aliquote bei 75 ° C unter schütteln.<ol>
<li>Verwenden Sie 240 µL (inkl. 20 % Overhead) für jeden Teilnehmer (n = Anzahl der Wettbewerber Sequenzen).</li>
		<li>Verwenden Sie die gleiche Menge an Gel für die NB Kalibrierung gut, um eine gleiche Temperatur und Viskosität der beiden Gele sicherzustellen.</li>
		<li>Dann stellen Sie die Temperatur auf 35 ° C und die Temperatur auf equilibrate warten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die Titration Brunnen, fügen 1,4 nM (Endkonzentration) hybridisiert Verweis DNA (erhaltene in Schritt 3), TF-Protein (Endkonzentration CTF = 20-60 nM, wie im Schritt 2,6 ermittelt), DVB-t (0,2 mM) und verbindliche Puffer in einem Gesamtvolumen von µL n X 200 oder n X 13 µL in einem 96 - oder 384-Well-Platte Format, bzw. (plus overhead). Die Mischung gründlich durch invertieren/schütteln (nicht Wirbel zu tun).</li>
	<li>Fügen Sie langsam 200 µL pro Bohrloch in 96-Well-Plattenformat (13 µL/Well für 386 Brunnen) der Gel-Lösung im vorherigen Schritt in die Vertiefungen der Titration der well-Platte vorbereitet.</li>
	<li>Für die Kalibrierung Brunnen zuerst hinzufügen 5 nM NB auf das geschmolzene Gel außerhalb der Brunnen (Gesamt Volumen abhängig von der well-Plattenformat verwendet und die Anzahl der Kalibrierung Brunnen; in der Regel 5-6 pro well-Platte reicht).</li>
	<li>200 µL (13 µL für 384-Well-Plattenformat) NB Gel langsam innerhalb der Titration Vertiefungen der well-Platte mit Pipette und vergewissern Sie sich, um Luftblasen zu vermeiden. Hinweis: Die Nutzung von elektronischen Mehrkanalpipette oder Robotik steigt deutlich an Reproduzierbarkeit.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel für 10 min bei RT und weitere 10 min bei 4 ° C zu festigen (Kondenswasser aus dem Glas anschließend entfernen wenn nötig). Stellen Sie sicher, führen diese Schritte auf einer perfekt horizontale Oberfläche, inhomogene Gel Oberflächen zu vermeiden. Hinweis: Die Protein enthaltenden Gele sind in der Regel stabil für mindestens mehrere Stunden bei 4 ° C.</li>
</ol>5. Hinzufügen von Konkurrent DNA-Lösung
Hinweis: Die folgenden Lösungen sollten bereit sein, vor Beginn der Titration und sind gleichzeitig auf die Kalibrierung und Titration Brunnen hinzugefügt.
<ol><li>Fügen Sie die geglühten Referenz-DNA und Protein 3 x Bindung Puffer auf 3-mal höhere Konzentrationen als die Lager Aliquote Gel beschriftet.<ol>
<li>Mix-20 µL der erhaltenen Lösung mit 40 µL der einzelnen geglüht Konkurrent DNA-Lösung in Schritt 3 erhalten.</li>
		<li>Mischen Sie für jede Kalibrierung gut 20 µL 3 x Bindung Puffer mit 15 mM NB Lösung mit 40 µL geglühten Wettbewerbers DNA (beliebiger Reihenfolge gleicher Länge ist geeignet). Hinweis: Für die 384-Well-Platten verwenden Sie 21 µL anstelle von 60 µL insgesamt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie gegebenenfalls die Homogenität des Gel-Höhenniveaus in den verschiedenen Vertiefungen der Platte spektroskopisch durch Messung der Extinktion bei 380 nm, mit einem Multi-well-Platte-Reader (die Extinktion Werte sind proportional zu den Gel-Höhen).</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL (7 µL für 384-Well-Plattenformat) der gemischten Konkurrent DNA-Lösungen (geglüht in Schritt 3) auf die Gele. Versuchen Sie, alle Wettbewerber-Lösungen so gleichzeitig hinzufügen mithilfe elektronischer Multichannel-Mehrkanalpipette oder einen 96-Kanal Pipettieren Kopf, falls vorhanden. Nach Zugabe der Wettbewerber-Lösungen die Platte auf den Mikroskoptisch und starten Sie die Messungen sofort (Schritt 7).</li>
</ol>6. die Bildaufnahme
<ol><li>Sequenziell erwerben Zeiten Reihe von Z-Stapel (z. B. Nutzung 12 Flugzeuge und 100-300 ms der Leuchtdauer). Vermeiden Sie Aufnahmen zu nah an die gut Oberfläche (< ~1.4 µm mit den hierin verwendeten Platten), jede Polarisierung Bias auszuschließen.</li>
	<li>Durchführen Sie 10-25 Zyklen der Messungen bis zu kompletten loslösen der beschrifteten Referenz-DNA aus der TF. Der Endpunkt ist in der Regel nach 1-2 h, je nach Bindung Kinetik und Diffusionsvermögen des Mitbewerbers DNA erreicht.</li>
</ol>(7) Extraktion von FA(z,t) aus Raw-Daten
<ol><li>Sobald eine well-Platte abgebildet wurden, berechnen Sie aus den rohen Fluoreszenzbilder der durchschnittlichen Pixelwerten der Regionen von Interesse für die parallele (I=) und senkrecht (I+) polarisiert Intensität Komponenten (Abbildung 1c). Dies erfolgt automatisch mit der Hüfte-FA-Software-23. Hinweis: Die HiP-FA-Software, eine Bedienungsanleitung und ein Testdataset können heruntergeladene23sein. Alternativ können Sie jede andere individuell geschriebenen Software extrahieren, I= und I+ und führen Sie die nachgelagerte Analyse der Titrierung Kurven, wie im Detail unten beschrieben.</li>
	<li>Berechnen Sie FA für jedes gut. Für jedes gut das Skript berechnet FA(z,t) an jedem Z-Position und Zeitpunkt t nach: Gleichung 1:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq1.jpg"> Wo G ist das Instrument G-Faktor, das behebt Voreingenommenheit gegenüber der senkrechten Kanal.</li>
	<li>Bestimmen des G-Faktors der Mikroskopie-Einrichtung durch die Messung der FA von Lösungen mit einem Fluoreszenzfarbstoff bekannten Anisotropie. Extrahieren Sie die beiden Polarisation Komponenten des Signals und verwenden Sie dann Gleichung 1 G, wissen die FA der Lösung zu erhalten (G = 1,15 in diesem Setup).</li>
</ol>8. die Kalibrierkurve zur Bestimmung der Konkurrent DNA-Konzentration von FA-NB
<ol><li>Tempern 120 µL jeder vorwärts-und rückwärts-Oligomer (100 mM Lager Konzentration, zufällige Reihenfolge mit der gleichen Länge wie die Wettbewerber Sequenz verwendet werden) und mischen Sie mit 120 µL 3 x Bindung Puffer mit NB (15 nM).</li>
	<li>Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe mit Verdünnungen von 1:2 in 1 x Bindung Puffer mit 6 Verdünnungen insgesamt. Mix 50 µL dieser Verdünnung mit 200 µL 0,5 % niedriger Schmelzpunkt (T > 35 ° C) Agarosegel in 1 x Bindung Puffer mit 5 nM NB in Triplicates.</li>
	<li>200 µL der einzelnen 6 Lösungen bereit, die im vorherigen Schritt in eine 96-Well-Platte hinzuzufügen und die Platte für 1 h bei 4 ° C vollständig Gelierung, dann 1 h bei RT. Maßnahme der FANB der Lösungen mithilfe der HiP-FA-Setup darauf zu speichern.</li>
	<li>FANB (Z, t) nach dem vorherigen Schritt extrahiert und passen die Daten mit Hilfe einer Hill-Gleichung: Gleichung 2:<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq2.jpg"> Wo CDNA ist die Konzentration des Oligomers DNA; k die Konzentration der DNA-Oligomere bei denen die Hälfte von den Bindungsstellen besetzt sind; FAmax ist eine Normalisierung konstante; und n ist der Hill-Koeffizient. k, FAmax, und n werden als freie Parameter während des passenden Verfahrens festgelegt.</li>
	<li>Geben Sie die drei Parameter, die das passende Verfahren in der Hüfte-FA-Software (im linken unteren Fensterbereich) entnommen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Ermittlung der Kalibrierkurve alle paar Monate oder nach Änderungen in der Mikroskopie-Setup.</li>
</ol>9. Bestimmung der Konkurrent DNA-Konzentrationen
<ol><li>Die HiP-FA-Software verwenden, um c zu extrahieren (Z, t) aus den FANB(Z, t) Messungen (Abbildung 3). Zunächst erhalten die Eichkurve, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben und geben Sie die passenden Parameter der Software (siehe Bedienungsanleitung).</li>
	<li>Verwenden Sie das Programm, um automatisch zu extrapolieren, c(z,t) für c < 100 nM (siehe Handbuch) mit Gleichung 3 (Abb. 3b), der die eindimensionale Diffusion des Mitbewerbers DNA innerhalb der Agarose-Gel-Matrix beschreibt, unter der Annahme kostenlose Verbreitung. Gleichung 3:<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq3.jpg"> Wo C0 ist die Ausgangskonzentration des Mitbewerbers DNA; EFF ist die Error-Funktion; Z ist die Position; D ist die Diffusionskoeffizienten des Mitbewerbers DNA; und t0 ist die Startzeit der Messungen. Die freien Parameter verwendet werden C0 und Z /<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq4.jpg">.
</li>
</ol>10 konventionelle wettbewerbsfähige Titration mit HIP-FA für sehr starke DNA-Bindung
<ol><li>Verdünnen Sie seriell verschiedene Wettbewerber DNA-Oligomere in den Zeilen einer 96-Well-Platte (oder 384-Well-Platte) in den Konzentrationen von: 0, 1,25, 3,5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900, und 4000 nM. Fügen Sie den Verweis Cy5-markierten DNA (1 nM) und TF (20-50 nM) bei einer konstanten Konzentration mit einem Gesamtvolumen von 200 µL pro Bohrloch in Bindung Puffer (Abbildung 5ein). 40 min warten, bis der thermodynamischen Gleichgewicht erreicht wird und erwerben (mit dem HiP-FA-Setup) Z-Stacks für jedes gut (mehrere Bilder pro Bohrloch reduziert Variabilität durch Mittelung der berechneten FA-Werte).</li>
	<li>Konstruieren Sie die Gleichgewicht Bindung Titrierung Kurven zu, und passen sie mit Gleichung 4 (Abb. 5b). KDs bestimmt durch konventionelle wettbewerbsfähige Titration identisch mit denen von HIP-FA mit einer Agarose-Gel-Matrix-20gewonnen werden.</li>
</ol>11. Montage-Verfahren der FA Titrierung Kurven
<ol><li>Anzeige in der Hüfte-FA-Software die rekonstruierten Titrierung Kurven für die Einzelkämpfer Sequenzen FA(z,t) = f[c(z,t)] und eine Sichtkontrolle der Datenqualität (siehe Bedienungsanleitung). Bei Bedarf, verfeinern Sie die Parameter für die Bestimmung der Konkurrent DNA-Konzentrationen in Schritt 10.</li>
	<li>Passen Sie jede individuelle Titration Kurve automatisch mit Gleichung 4, verleiht eine analytische Lösung für wettbewerbsfähige Titration Assays24. Gleichung 4:<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq5.jpg"> Mit:<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq6.jpg"> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq8.jpg"> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58763/58763eq9.jpg"> Wo RT die Proteinkonzentration ist; LT ist die unbeschriftete und LST ist die beschrifteten DNA-Konzentration; K-D2 ist die Dissoziationskonstante bestimmt werden; RT ist die Konzentration von aktiven Proteins; und A und B sind Parameter der Normalisierung. Ermitteln Sie zunächst KD1, dient als Referenz für die Bestimmung der verschiedenen KD2 -Werte. K-D1 ist durch die Wahl der Farbstoff-Referenz-DNA-Sequenz als unbeschriftete Konkurrent DNA-Sequenz mit dem Assay leicht bestimmbar (siehe Handbuch).</li>
	<li>Geben Sie den erhaltenen Wert von KD1 in der Software und berechnen Sie die KD2 -Werte für alle Wettbewerber DNA auf der Platte zu. Hinweis: Die freien Parameter des passenden Verfahrens sind KD2, RT, A, und B.
</li>
	<li>Die Dissoziationskonstante KD2 und Konzentration der aktiven Proteins RT für die individuelle Titration Brunnen der Platte zu exportieren, indem Sie auf die Schaltfläche "Exportieren" in der Software.</li>
</ol>12. PWM Bau, Spezifität der Protein-DNA-Interaktion und Pseudo-Grafen
Erstellen Sie die Sequenz-Logos für die verschiedenen PWMs mit dem Online-Tool WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), wie zuvor beschrieben20.

<ol>
	<li>Berg, O. G., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+DNA+binding+sites+by+regulatory+proteins.+Statistical-mechanical+theory+and+application+to+operators+and+promoters.">Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. 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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

HiP-FA ist eine umfassende neue Methode für die Bestimmung der Bindung bevorzugt Landschaften von TF-DNA-Wechselwirkungen. Er misst verbindliche Affinitäten mutagenen DNA-Motiv-Varianten direkt, zugrunde liegende Annahme, dass verbindliche Präferenzen in die Häufigkeit des Auftretens von Nukleotid in einer Reihe von oberhalb der Schwelle Bindemittel spiegeln zu vermeiden. Messung erfolgt in der Lösung ohne Immobilisierung und mechanische oder chemische Eingriffe in die verbindliche Reaktion, Gleichgewichtsbedingungen so weit wie möglich annähern. Das kontrollierte Lieferung-System ermöglicht die Messung einer vollen Titration Kurve innerhalb einer einzigen gut und erhöht Durchsatz und die Zuverlässigkeit beim Speichern Protein. Mit ein Ziel mit hoher numerischer Apertur und EM-CCD-Kamera mit einem hohen Licht Abscheideleistung ermöglicht hochsensiblen fluoreszierenden Licht Erkennung. Daher ändert sich mit diesem Setup, kleine FA so niedrig wie 10-15 mP genau erfasst werden kann; in der Praxis bedeutet dies, dass keine verbindliche Reaktion für die Massenzunahme nach Bindung minimal ist (so niedrig wie ein Massenverhältnis von 2) ohne weiteres erkannt wird. Dies ist in der Regel nicht der Fall mit kommerziellen Systemen wie Mikrotestplatte Leser. Aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit erweitert HiP-FA das Spektrum der Dissoziation konstanten, die in den pikolomaren Bereich zuverlässig gemessen werden kann. Bindungsenergien sind genau über mehrere Größenordnungen bestimmt.
Um die Qualität der überarbeiteten PWMs zu bewerten, haben wir zwei Arten der Analyse20durchgeführt. Wir testeten für fünf Faktoren für die Segmentierung Gen-Netzwerk, wie gut verschiedene PWMs experimentellen ChIP-Seq-Profile in der genomischen Regionen 21 Segmentierung Gene vorhersagen können. Als ein zweiter Test haben wir ein Sequenzausdruck-Modell4 , die Expressionsmuster der Segmentierung Enhancer auf der Grundlage der Bindung Präferenz und Protein-Konzentration von teilnehmenden TFs vorhersagt. Beide Übungen wir festgestellt, dass deutlich weniger spezifischen HiP-FA-PWMs durchführen besser als die spezifischere Footprinting und B1H PWMs20.
Im Gegensatz zu de Novo Methoden erfordert HiP-FA einige Vorkenntnisse in einem bestimmten TF Bindung Präferenz. Allerdings Konsensus-Sequenzen sind für viele TFs bekannt, und viele bestehende Methoden liefern ihnen13,14,15. Bei Bedarf kann die wahre optimale Bindung Sequenz iterativ gefunden.
Wir verwendeten DNA-Referenz Oligomere Eindringmittel beschriftet mit Cy5 und Bodipy-650. Diese Farbstoffe erwiesen sich als gut für FA-Messungen durchzuführen, da die Anisotropie der gebundenen und ungebundenen gekennzeichnet-Referenz-DNA wurden die größte unter den verschiedenen getesteten Farbstoffe. Dies gewährleistet eine maximale dynamische Reichweite für die FA-Werte. In der Regel Fluoreszenzfarbstoff mit einem Fluoreszenz-Lebensdauer-≥ 1 ns ist wahrscheinlich geeignet, aber es muss zunächst getestet werden. Wenn möglich, ist es ratsam, im Bereich in der Nähe von IR fluoreszierende Farbstoffe verwenden um Protein Autofluoreszenz zu minimieren.
Der wichtigste Schritt die Versuchsdurchführung ist das Pipettieren des Gels in die well-Platten. Gute Reproduzierbarkeit erfordert die Gel-Volumen möglichst einheitlich sein. Änderungen in der Gel-Höhe sind Änderungen des Diffusionsvermögens für wettbewerbsfähige DNA-Oligomere und damit offensichtliche Veränderungen der Affinität übersetzt, bei der Auswertung der Daten. Dies ist die Hauptquelle der Varianz in einer technischen replizieren. Die Verwendung einer elektronischen Pipettieren oder Automatisierung Techniken verbessert die Reproduzierbarkeit. Luftblasen in das Gel können durch langsam und vorsichtig Pipettieren vermieden werden. Es ist auch wichtig, die alle Wettbewerber-Lösungen auf die Titration Brunnen mit als wenig Verzögerung wie möglich hinzufügen. Für beste Reproduzierbarkeit kann der gesamte Prozess automatisiert werden, mit einem Pipettierroboter mit Hitze Inkubatoren. Die notwendige Optimierung der Brutkasten Temperatur und die Inkubationszeiten ist ein wichtiger Bestandteil für die Übertragung des Protokolls auf Automatisierung. Achten Sie darauf, eine optimale Balance zwischen die Viskosität des Gels zu finden (zB., nicht zu kalt) und der Stabilität der Proteine (d. h. nicht zu heiß). Dies hängt sowohl von der Abgabe Geschwindigkeit der Gele in den Brunnen und die Stabilität des Proteins verwendet.
HiP-FA bedient sich eines kontrollierten Liefersysteme für die Wettbewerber DNA-Oligomere. Um die Titrationen Kurven konstruieren, es ist zu prüfen, die Wettbewerber DNA-Konzentration c(z,t) für jeden gegebenen Z-position innerhalb der Gelmatrix und Zeit Punkt t. Dies ist ein weiterer wichtiger Schritt, da die Bestimmung des KDs direkt von c(z,t)abhängt. Kalibrierung-Brunnen mit der NB Farbstoff als Sensor für DNA-Konzentration sind für diesen Zweck (Abbildung 1d, Abbildung 2eine) verwendet. In der Regel genügen 3-5 Kalibrierung Brunnen mit NB pro Platte. Vor der Auswertung jeder HiP-FA experimentieren, eine Kalibrierungskurve NB sollte für den Aufbau von einer konventionellen Titration Reihe von NB aufgelöst im Agarosegel mit einem Wettbewerber DNA von beliebiger Reihenfolge bei verschiedenen Konzentrationen (Abbildung 3 konstruiert werden ein), wie in Schritt 8 näher erläutert. Bei sehr starken Bindung (KD < 500 pM), die Hochrechnung für die Bestimmung der niedrigen Konzentrationen der Konkurrent DNA verwendet wird begrenzt, da es weniger genau als eine direkte Messung ist. Jedoch für TFs mit solch niedrigen KDs, das HiP-FA-Setup lässt sich eine konventionelle wettbewerbsfähige Titrierung in Bindung Puffer ohne den Einsatz einer Agarose-Gel-Matrix (Abbildung 5) durchzuführen. Beispielsweise kann eine vollständige Titration mit 12 verschiedenen Konzentrationen der Konkurrent DNA in einer einzelnen Zeile einer 96-Well-Platte durchgeführt werden.
Die Regelstrecke Lieferung erfordert auch schnelle TF-DNA verbindliche Kinetik und stabile Proteine, da die Diffusion obwohl das Agarosegel ist dynamisch (wenn auch langsam). Beide Eigenschaften können direkt mit dem HiP-FA-Setup von folgenden, im Laufe der Zeit die FA der TFs von Interesse, wenn Sie zu ihren jeweiligen Eindringmittel beschriftet Referenz DNA gebunden getestet werden. Wir KON und KOFF Preise für die untersuchten Faktoren gemessen und fand sie in der Größenordnung von Millisekunden bis Sekunden20, im Einklang mit anderen Studien30. Dies ist schnell genug, um sicherzustellen, dass die Messungen im Gleichgewicht stattfinden. Bei anderen Bindung Reaktionen mit langsameren Kinetik kann das Diffusionsvermögen des Wettbewerbers durch Verringern der Konzentration oder Gel Porengröße abgestimmt werden. Bei der getesteten TFs, die alle haben schnell TOFF (~ Sekunden), eine totale Messzeit ca. 1-2 h ist ausreichend, um thermodynamische Gleichgewicht bei jeder Messung zu gewährleisten.
Ein weiteres potenzielles Problem im Zusammenhang mit dem Protein ist die Bildung von Protein-Aggregate, die FA Messungen ändern kann. Die Verwendung der anderen Puffer mit verschiedenen Zusätzen (wie Tenside) kann Aggregatbildung, ggf. verhindern.
Wir haben unter Annahme der Linearität der PWM gearbeitet; jedoch kann HIP-FA skaliert werden, um alle möglichen di-Nukleotid Mutationen der Konsensussequenz erweitert. Zu guter Letzt adaptierbar HiP-FA zu anderen Arten von verbindlichen Interaktionen messen. Voraussetzung ist, haben zur Verfügung eine geeignete Referenz-Molekül gebunden durch das Protein das Eindringmittel bezeichnet werden kann. Mit dem kontrollierten Lieferung-System kann ein Konzentrationsgradient für jede Art von Liganden erzeugt werden; Daher können Proteinprotein und Medikament-Protein-Interaktionen mit ähnlich hohe Wiedergabetreue und Durchsatz gemessen werden.

Angesichts der zentralen Rolle der Transkriptionsfaktoren (TFs) in der Genregulation, bestimmen ihre verbindliche Präferenzen in einer quantitativen Weise ist von größter Bedeutung. Bahnbrechende Studien von Hippel führte den Begriff, dass regulatorische TFs DNA, schnell erkennen, dass ihre Bindung durch das thermodynamische Gleichgewicht gut beschrieben wird, während die nachgelagerten Ereignisse der RNA-Polymerase an den Promotor Einstellung gesteuert werden langsamere Kinetik1. Aktuelle in-Vivo Bindung Studien deuten darauf hin, dass dieses Bild wahrscheinlich komplexer2,3; Dennoch, diese allgemeine Annahmen dienen als gute Annäherungen und viele rechnerische Ansätze zur Cis-regulatorische Elemente zu finden und Ausdruck von Sequenzen4,5,6Vorhersagen unterstützt haben. Während Gleichgewicht Bindung als Konzept so erfolgreich eingesetzt worden, aktuelle Methoden zur Bestimmung der TF-DNA-Wechselwirkungen verbindlich Spezifität im Fokus und in der Regel nicht direkt messen verbindliche Affinitäten im Gleichgewicht. Die systematische Messung von TF-DNA-Bindung stellt eine große technische Herausforderung dar, und die vorhandenen Methoden haben mehrere verschiedene Einschränkungen.
Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von tiefen Sequenzierung (ChIP-Seq)7, die am weitesten verbreitete Technik in Vivo erlaubt nicht die Messung der verbindlichen Affinitäten oder die präzise Lokalisierung der Bindungsstellen innerhalb von genomischen Fragmente. Mehrere in-vitro- Methoden, einschließlich DNase Footprinting8, elektrophoretische Mobilität Verschiebung (EMSA)9, Surface Plasmon Resonance (SPR)10und Microscale Thermophorese11 sind in der Lage, verbindliche Affinitäten zu messen, aber sie sind relativ geringen Durchsatz. Umgekehrt sind Hochdurchsatz Techniken einschließlich Protein Bindung Microarrays12, HT-SELEX13,14, und bakterielle One-Hybrid (B1H)15 nicht in der Lage, verbindliche Affinitäten zu messen und in der Regel übermäßig nachgeben spezifische Sequenzen, die vor allem durch die strenge Auswahl ist verbindlich oder Waschschritte erforderlich. Neuere Entwicklungen sind tiefe Sequenzierung basierend HiTS-FLIP16, SELEX-Seq17, und der Mikrofluidik-basierte MITOMI18 oder Lächeln-Seq19, die für die Extraktion von absolut verbindliche Affinitäten zu ermöglichen; aber verlassen sie sich auf die Messung der Fluoreszenz-Intensität von beschrifteten TF und DNA. Fluoreszenz Signale, daher werden bei geringen Proteinkonzentrationen und bei niedrigen K-D -Werte zu begrenzen (< ~ 10 nM). Darüber hinaus erfolgt die TF-DNA-Bindung in diesen Methoden auf dünne Flächen Fragen mit unspezifischen Bindung und/oder Auto-Fluoreszenz-Hintergrund, das macht es schwierig, genau zu quantifizieren, schwache Bindung.
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir eine neue Methode zum Bestimmen der TF-DNA Affinität Landschaften im Gleichgewicht und in Lösung, die wir Hochleistungs Fluoreszenz Anisotropie (HiP-FA)20genannt, entwickelt. Die Technik basiert auf der etablierten Fluoreszenz Anisotropie (FA) Assay21 aber Bindungskonstanten Messung mit hoher Empfindlichkeit und bei groß angelegten mit einem angepassten automatisiertes Mikroskop und Analyse Setup modifiziert.
Die FA-Assay überwacht die Interaktion von Eindringmittel beschrifteten Arten (wie ein DNA-Oligomere) um einen Bindungspartner, in diesem Fall ein TF, durch Messung der molekulare Drehung des beschrifteten Moleküls. Bei der Bindung an die TF sinkt seine Drehzahl aufgrund der höheren hydrodynamischen Radius und Molekulargewicht des gebundenen komplexes, führt zu erhöhten FA. Die genaue Messung von sehr starken Bindung (KD < ~ 1 nM) erfordert die Verwendung von geringen Konzentrationen von beschrifteten, Referenz DNA (c < ~ 1 nM). Dies ist schwierig, mit einem kommerziellen Instrument wie ein standard Mikrotestplatte Leser zu erreichen. Darüber hinaus ist ein großer Größenunterschied (10-100 fach) zwischen der gebundenen und ungebundenen komplexe in der Regel notwendig, Messung von Interaktionen zwischen TF bindenden Domänen und kurze DNA-Oligomere, die in der Regel etwa ähnliche Molekulargewichte sind zu verbieten . Schließlich erfordert eine vollständige Titration Kurve normalerweise die Vorbereitung und die Messung von mehreren Brunnen mit einer Konzentrationsreihe für die Titration Arten.
Um diese Probleme zu beheben, verwenden wir eine Weitfeld-Mikroskopie Setup, modifiziert, um zu erreichen hohe Nachweisempfindlichkeit und FA-Messungen an verschiedenen Z-Positionen von einem einzigen Brunnen zu ermöglichen. Dies ermöglicht uns, bindender Wechselwirkungen zwischen den Arten von ähnlichen Molekulargewicht und mit hoher Affinität zu überwachen. Höherer Durchsatz erreicht man durch Messung der FA im Multi-well-Plattenformate und Durchführung eine gesamte Titration-Reihe in einer einzigen, gut mit einem kontrollierten Lieferung-System (Abbildung 1(ein). Darüber hinaus durch den Einsatz eines wettbewerbsfähigen Bindung-Assays, gewinnen wir nicht nur den Bindungskonstanten, sondern auch die Konzentration der aktiven Proteins. Dies ist ein wichtiges Merkmal des Assays, da nur ein Teil der zum Ausdruck gebrachten TF Moleküle werden durch Protein misfolding oder Abbau aktiv. Der experimentelle Aufbau basiert auf einem kommerziellen Epifluoreszenz Mikroskop mit XY und Z-Piezo-Stufen ausgestattet. Wir das System mit externen Laseranregung aktualisiert, dann erkannt, dass die beiden Komponenten der linearen Polarisation auf dem Chip einer EM-CCD-Kamera mit hoher Quantenausbeute für Lichterkennung (Abbildung 1b und 1 c) emittiert. Das System nutzt ein hoher numerischer Apertur (NA) Ziel gekoppelt an einer extrem empfindlichen Sensor und bietet so hochsensible FA Messungen. Durch Fluoreszenz Z-Stapel aufnehmen, kann bindende Wechselwirkungen der optischen Achse gemessen werden bei der Verwendung einer heterogenen Matrix für die Edukte. Diese Änderungen können ohne weiteres auf ein bestehendes System implementiert werden und sind kostengünstig.
Wir beschäftigen einen wettbewerbsfähigen Bindung-Assay in dem Bindungsaffinität von eine unbeschriftete DNA-Oligomere im Vergleich zu den Eindringmittel beschrifteten DNA gemessen wird, die als Referenz dient. TF und Referenz DNA fließen bei festen Konzentrationen in einer porösen Agarose-Gel-Matrix (Pore Größe ~ 1 µm), die eine nicht-wechselwirkenden Umgebung für die Bindung darstellt. Der Verweis wird DNA mit Cy5 markiert. Dieser Farbstoff erwies sich als gut geeignet für FA Messungen aufgrund seiner relativ langen Fluoreszenz-Lebensdauer (~ 1ns) und Fluoreszenz-Emission in die dunkelrote des sichtbaren Spektrums (niedrige Auto-Fluoreszenz im Hintergrund). Die TF-Konzentration ist im Molaren Überschuss über Cy5-Referenz-DNA, um sicherzustellen, dass alle Referenz-DNA an Protein gebunden ist. Eine Lösung der unbeschrifteten Konkurrent DNA lagert sich dann an der Geloberfläche und diffundiert in die poröse Matrix zur Gründung ein Konzentrationsgradient c (Z, t) , die im Laufe der Zändert-Position der Brennebene und der Zeit t (Abbildung 1a, Abbildung 2a bis 2 c). Der TF gebunden an die Cy5-Referenz-DNA ist somit lokal unterschiedlichen Konzentrationen des Mitbewerbers DNA, die für die Bindung, konkurriert führt zu einem dynamisch verändernden FA Cy5-Referenz-DNA- FAREF(Z, t) ausgesetzt (Abbildung 2b und 2 c).
Um den Konkurrenten Konzentration c(z,t) zu bestimmen, messen wir in separaten Brunnen (Kalibrierung Brunnen) dynamisch verändernden FA signalisieren Nilblau (NB) FANB(Z, t) (Abbildung 2ein und 3). Dieser Farbstoff Plasmamembrane in DNA und dabei tritt als ein DNA-Sensor für den Mitbewerber DNA. Mit dieser Regelstrecke Lieferung können Dutzende bis Hunderte von verschiedenen DNA-Protein-Bindung-Affinitäten innerhalb eines Multi-well-Platte (96 oder 384-Well Plattenformat) gemessen werden. Messung erfolgt dann nacheinander bis vollständige Verdrängung der beschrifteten DNA Referenz aus der TF. Wir entschlossen die Spezifität der Bindung für einen bestimmten Faktor durch die Messung der Affinitäten aller 3 N Einzel-Base Mutationen der Konsensussequenz der Länge N. HiP-FA erfordert geringe Mengen an Protein (~ Pmols pro Titration Kurve) und zeigt geringe Variabilität bei der Ermittlung des KDs [Koeffizient von Variation (CV) < 20 %], wobei Messungen in einem relativ großen Maßstab. Die Methode kann manuell oder voll automatisiert mit einem Robot-System, was zu noch niedrigeren CVs (Abbildung 4, oben) durchgeführt werden. Dissoziation-Konstanten werden gemessen, mit hoher Genauigkeit bis auf 0,5 nM. Für extrem hohe Affinitäten (KD < 500 pM), wir verwenden eine standard wettbewerbsfähige Titrierung (Abbildung 5) durch die Ungenauigkeiten bei der Messung der Konkurrent DNA-Konzentrationen auf einem niedrigen Niveau (< 100 nM).
HiP-FA kann auf fast jedem Standard implementiert, invertiert, Epifluoreszenz fluoreszierende Mikroskop, sofern die Verfügbarkeit einer automatisierten Kreuztisch und ein Piezo-z-Achse-Bühne. Optische Komponenten wurden um ein automatisiertes Weitfeld-Setup ausgestattet mit einem fern-Ziel gebaut. In der Praxis kann der Test zu Zielen mit anderen Merkmalen (in bestimmten arbeiten, Distanz und numerische Apertur) angepasst werden. Dies erfordert jedoch eine Optimierung der Parameter (Abstände zwischen den Z-Scheiben, Porosität und Höhe der Agarosegel, etc..). Die Verwendung anderer Arten von Lasern oder Kamera ist auch möglich. Eine detaillierte Beschreibung des gesamten Versuchsdurchführung und Datenanalyse wird unten im Abschnitt Protokoll angegeben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:915px;" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:183px;">Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nile Blue A</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">N5632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">655891</td>
			<td>175 &#181;m thick glass bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">384 Well Sensoplate, black</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">788896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">A9414-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tween-20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:341px;">Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Q-POD Element</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZMQSP0DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Millipak 40 Gamma Gold Filter</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>MPGL04GK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Milli-Q Integral 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Quantum TIX</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>QTUMOTIX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mastercycler gradient</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:245px;">Z316083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.706.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tube 15 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MICROSCOPY SETUP:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Automated widefield microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long distance objective</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">638 nm line continuous diode laser</td>
			<td>Omicron</td>
			<td>PHOxX 638-40, 40mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back-illuminated EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon DV897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichroic mirror</td>
			<td>AHF</td>
			<td>640nm cut-off</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bandpass filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td>ET bandpass 700/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linear polarizer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">LPVISC050-MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">BS010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Achromatic lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>200 mm focal length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multimode optical fiber</td>
			<td>Optronis</td>
			<td>FVP600660710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ROBOTIC SYSTEM:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:341px;">Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek NXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SOFTWARE:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programming language</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Labview 9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Script for the HiP-FA software available at</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy

Genaue Quantifizierung der Transkriptionsfaktor (TF)-DNA-Wechselwirkungen ist wesentlich für das Verständnis der Regulation der Genexpression. Da bestehende Ansätze unter erheblichen Einschränkungen leiden, haben wir eine neue Methode zur Bestimmung der TF-DNA verbindlichen Affinitäten mit hoher Empfindlichkeit auf einer großen Skala entwickelt. Der Test basiert auf dem etablierten Fluoreszenz Anisotropie (FA) Prinzip aber führt wichtige technische Verbesserungen. Zuerst messen wir eine volle FA wettbewerbsfähige Titration Kurve in einem einzigen gut durch den Einbau von TF und Gewebekulturen beschrifteten Referenz DNA in einer porösen Agarose-Gel-Matrix. Unbeschriftete DNA Oligomer ist auf der Oberseite als Konkurrent geladen und durch Diffusion, bildet einen räumlich-zeitlichen Verlauf. Die daraus resultierende FA Steigung wird dann mit einem angepassten Epifluoreszenz Mikroskop Setup ausgelesen. Dieses verbesserte Setup erhöht die Empfindlichkeit der FA Signalerkennung, so dass schwache und starke Bindung zuverlässig quantifiziert werden, auch für Moleküle von ähnlichen Molekulargewichten. Auf diese Weise messen wir eine Titration Kurve pro Bohrloch von Multi-well-Platte, und durch eine passende Prozedur extrahieren wir die absolute Dissoziationskonstante (K-D) und aktive Proteinkonzentration. Testen Sie alle Einzelpunkt-Mutation Varianten eines bestimmten Konsenses Sequenz binden, können wir die gesamte Bindung Spezifität Landschaft ein TF, in der Regel auf einer einzigen Platte inspizieren. Die resultierende Position Gewicht Matrizen (PWMs) übertreffen die aus anderen Methoden bei der Vorhersage in Vivo TF-Belegung. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Anleitung für die Umsetzung der HiP-FA auf einem konventionellen automatisierten fluoreszierende Mikroskop und die Daten-Analyse-Pipeline.

Wir HiP-FA auf TFs der Segmentierung Gen Netzwerk25,26, erzeugt der anterior-posterioren Körper Muster von Drosophila Embryos, vor allem durch transcriptional Regelung angewendet. Aus diesem Netzwerk, wir entschieden uns für die bZIP Domain TF Giant (Gt) für eine detaillierte Analyse (Abbildung 4). Da in voller Länge Transkriptionsfaktoren schwierig sind zu äußern und liefern meist die gleichen verbindliche Präferenzen als ihre DNA-bindende Domänen (DBD)13, wir verwendet die DBD verschmolzen, GST und das Konstrukt in E.coli GST Fusionsproteine, ausgedrückt liefern Sie die gleichen Ergebnisse wie DBDs allein20.
Die Gt Konsensussequenz (einTTACGTAAC) stellt die stärkste Bindung-Sequenz, die wir wie oben beschrieben ermittelt. Dann untersuchten wir den Einfluss auf die Bindungsenergie von allen möglichen Einzelpunkt-Mutationen innerhalb der 10-Mer Gt Konsensussequenz (insgesamt 30), flankiert von zusätzliche Stützpunkte an den 5' und 3' enden. Wir Maßen zwei Wiederholungen dessen Gel Proben produziert wurden mithilfe der Automatisierung und eine zusätzliche Replikation manuell für Vergleich produziert. KDs reichte von 0,6 bis > 2000 nM für einzeln mutierte Sequenzen, und wir auch völligen Mangel an Bindung an eine "unverbindliche" Sequenz (Daten nicht gezeigt) bestätigt.
TF-DNA-Bindung Besonderheiten sind in der Regel nach dem Vorbild mit einer Position Gewicht Matrix (PWM), in der jede mögliche Nukleotid an jeder Position in der Bindung-Motiv eine Punktzahl zugeordnet ist. Die PWM wird davon ausgegangen, dass jede Position trägt verbindliche Kraft selbstständig und in den meisten Fällen ist eine ausreichende Modell für TF verbindliche Präferenzen27. Wir überarbeiteten PWMs basierend auf unsere Affinität Messungen erzeugt folgende etablierte Verfahren28,29 und verglichen sie mit zwei PWMs, die bisher in der Literatur beschrieben. Die erste basiert auf Nukleotid Frequenz Grafen von Bindungsstellen identifiziert durch DNA Footprinting4,5, und die zweite PWM wurde durch bakterielle One-Hybrid (B1H) Auswahl erhalten. 15
Die große Ähnlichkeit der PWMs für die drei Wiederholungen (Abbildung 4, obere Leiste), einschließlich der für die Stichprobe manuell vorbereitet (replizieren 3), zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der HiP-FA-Methode. Während die PWMs HiP-FA erzielten insgesamt sind ähnlich wie die PWMs erhalten mit den anderen Methoden (Abbildung 4, untere Leiste), gibt es signifikante Abweichungen: an Position 2 (schwarzer Pfeil), Beginn der Kern bZIP Motiv, Mutationen T > (G, C, A) zu führen vollständiger Verlust der Bindung in das Motiv durch die HiP-FA, die im Einklang mit dem B1H Motiv aber nicht mit der DNase Footprinting, in dem die Bindung relativ stark für Basen (G, A bleibt). Umgekehrt, bei position 7 (grauer Pfeil), die Mutation T > C führt zu viel stärkere Bindung als basierend auf den zuvor gemessenen PWMs, was erwartet wurde.
Andere Abweichungen sind subtiler, aber nicht minder wichtig. Insgesamt ist die Hüfte-FA-PWM weniger spezifisch als die beiden anderen, was darauf zurückzuführen ist, dass viele Mutationen aus dem Konsens noch mäßig starke Bindung führen. Dies kann mit Hilfe den Informationsgehalt (IC) quantifiziert werden. Der IC ist 11,5 Bits für die Hüfte-FA-Matrix (Durchschnitt von drei Wiederholungen), im Vergleich zu IC = 13,4 Bits und 16,8 Bits für die DNase Footprinting und B1H Matrizen, beziehungsweise. Im Allgemeinen (zwar nicht allgemeinhin), die durch die HiP-FA PWMs sind weniger spezifisch als denen, die durch andere Methoden, basierend auf 26 TFs20untersucht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> Abbildung 1:schematische Darstellungen der HIP-FA-Assay und Versuchsaufbau. (a) Gel Liefersystem für Säurekonzentration Konkurrent DNA in den einzelnen Brunnen. (b) HIP-FA-Mikroskopie-Setup. Automatisierte Weitfeld-Mikroskop mit Lichterkennung polarisierte Fluoreszenz auf einem EM-CCD-Kamera angepasst. (c) Raw Fluoreszenzbild mit den beiden Regionen von Interesse Schnurschlag die parallele (rot) und die senkrecht (grün) polarisierten Komponenten. (d) typisches Layout einer 96-Well-Platte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> Abbildung 2 : Raw FA Daten und rekonstruierten Titrierung Kurven. (a) typische FA(z,t) Flugbahn für eine Kalibrierung auch mit NB (b, C) FA(z,t) Zeit Trajektorien für zwei Titration Brunnen Bindung an eine starke (b) und moderater (c) DNA-Bindung Konkurrenten messen. (d, e) Entsprechenden FA Titration Messungen umgebaut und ausgestattet-Kurven für die starken (d) und Moderate (e) verbindlich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> Abbildung 3 : Bestimmung der Konzentration der Konkurrent DNA c (Z, t) mit Nilblau (NB). (a) FA-Kalibrierung Konzentrationskurve für 16 Basenpaare DNA-Oligomere. In einer Reihe von herkömmlichen Titration ist NB eingebettet in Agarosegel mit unterschiedlichen Konzentrationen des Wettbewerbers DNA. Die Affinität der NB an DNA ist Sequenz-unabhängige20; Daher können die gleichen Kalibrierkurven verwendet werden, zur Bestimmung von c (Z, t) für verschiedene DNA-Sequenzen von gleicher Länge. (b) Wettbewerber DNA Verbreitung Zeitprofil in einer willkürlichen Z -Höhe anhand fünf Kalibrierung Brunnen. Für jede Messzyklus werden die durchschnittlichen FAs von vier NB-haltigen Brunnen als weiße Punkte angezeigt. Die Kurven sind ausgestattet mit Gleichung 3 (weiße Linie, individuelle Vertiefungen in Farbe) und c (Z, t) bei niedrigen Konzentrationen (C < ~ 100 nM) wird bestimmt durch die hochgerechneten passende Kurve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> Abbildung 4 : Verbindliche Besonderheiten der bZIP-Domäne Familie riesigen TF (Gt). HIP-FA PWMs von drei Wiederholungen: zwei vorbereitet, mithilfe der Automatisierung und eine manuell vorbereitet (obere Abdeckung) sind im Vergleich zu PWMs erzeugt durch DNase Footprinting und bakterielle One-Hybrid (B1H) Auswahlmethode (untere Leiste). Insgesamt, die HIP-FA bindende Motive Stimme mit den vorherigen Daten zeigen aber auch erhebliche Unterschiede, wie mit schwarzen und grauen Pfeilen hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> Abbildung 5 : Konventionelle wettbewerbsfähige Titration mit HIP-FA. (a) Plattendesign zeigt 8 verschiedene Wettbewerber DNA seriell verdünnt in Bindung Puffer in einer einzelnen Zeile einer 96-Well-Platte. Eine FA-Heatmap zeigt für andere beliebige Bindung stärken. (b) Competitive Titration der drei Konkurrenten DNAs binden an die Bcd-TF mit unterschiedlichen Affinitäten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hier präsentieren wir eine neuartige Methode zur Bestimmung der verbindlichen Affinitäten im Gleichgewicht und in Lösung mit hoher Empfindlichkeit auf einer großen Skala. Dies verbessert die Quantitative Analyse der Transkription Faktor-DNA-Bindung. Die Methode basiert auf automatisierten Fluoreszenz Anisotropie Messungen in ein kontrolliertes Abgabesystem.

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Um das Verständnis der Transkriptionsfaktor-DNA-Bindung zu verbessern, haben wir eine Methode entwickelt, um Dissoziationskonstanten in großem Maßstab mit z.B. Anisotropiemessungen zu messen. Diese Technik ermöglicht die automatische Erlangung von vollständigen Titrationskurven, um die Dissoziationskonstante mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen. Es arbeitet in Lösung im Gleichgewicht, hat moderaten Durchsatz und großen Dynamikbereich.Wir haben HiP-FA angewendet, um die Bindungsaffinitätslandschaft von Transkriptionsfaktoren zu verfeinern. Das Protokoll könnte jedoch auf andere Arten von Bindungsereignissen wie Protein-Protein- oder Protein-Arzneimittel-Wechselwirkungen angewendet werden, zum Beispiel. Ich rate, zunächst mehrere Titrationen mit den gleichen Bindungspartnern durchzuführen, um eine Schätzung über die Reproduzierbarkeit der Messungen zu erhalten.Wenn verfügbar, verwenden Sie ein automatisiertes System für eine noch bessere Reduzibilität. Um die DNA-Oligomere der Referenz-DNA zu annealieren, mischen Sie sieben Mikroliter von je zehn Millimolar-Di-Labeled vorwärts und unbeschrifteten Reverse-Strang in einem Rohr. Für die Konkurrenz-DNA mischen Sie 20 Mikroliter von jedem 100 Millimolar unbeschrifteten Strang in zwei Bohrungen einer 96 gewellten PCR-Platte.Dann verwenden Sie eine Standard-PCR-Maschine, um die DNA-Lösungen für die drei Minuten auf 70 Grad Celsius zu erwärmen. Dann reduzieren Sie auf Raumtemperatur mit einer Rate von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde. Verwenden Sie einen Mikrowellenherd, um 0,5 Gramm Agarose in 100 Milliliter Bindungspuffer zu schmelzen.Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das Endvolumen anzupassen, um eine mögliche Verdunstung auszugleichen. Bereiten Sie zehn Milliliter-Lager-Aliquots vor. Um die Titrations- und Kalibrierbrunnen einer 96-Well-Platte vorzubereiten, übertragen Sie zwei Gel-Lager-Aliquots auf einen 75-Grad-Celsius-Inkubator-Shaker.Für jeden Titrationsbrunnen 1,4 Nanomol Referenz-DNA, Transkriptionsfaktorprotein, in einer Endkonzentration von 20-60 Nanomolen, 0,2 Millimolar DTT und den Bindungspuffer zu 240 Mikrolitern des geschmolzenen Gels hinzufügen. Mischen Sie gründlich, indem Sie das Rohr umkehren und schütteln. Dann, langsam Pipette 200 Mikroliter pro Brunnen des DNA-haltigen Gels in den dafür vorgesehenen Titrationsbrunnen einer 96-Well-Platte.Für jede Kalibrierung gut, fügen Sie 5 Nanomole nile blauen Farbstoff zu 240 Mikroliter des geschmolzenen Gels. Vermeiden Sie Luftblasen, führen sie langsam 200 Mikroliter der farbstoffhaltigen Gellösung in fünf bis sechs Brunnen der 96-Well-Platte. Legen Sie das Gel auf eine perfekt horizontale Oberfläche und inkubieren für zehn Minuten bei Raumtemperatur, und weitere 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.Verwenden Sie einen Multi-Well-Plattenleser, um die Homogenität der Gelhöhen in verschiedenen Brunnen der Platte zu überprüfen. Um die Konkurrenz-DNA-Lösung vorzubereiten, kombinieren Sie zunächst die beschriftete Referenz-DNA, das Protein und den dreifach konzentrierten Bindungspuffer. Mischen Sie dann 20 Mikroliter der Lösung mit 40 Mikrolitern jeder der geglühten Wettbewerber-DNA-Lösungen.Kombinieren Sie für jede Kalibrierung gut die entsprechenden Mengen einer der geglühten Wettbewerber-DNA-Lösungen und den dreifach konzentrierten Bindungspuffer mit 15 Millimolaren-Nile-Blau-Farbstoff-Lösung. Zum Schluss 50 Mikroliter der gemischten Konkurrenzlösungen so gleichzeitig wie möglich auf die Gele geben. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, stellen Sie die 96-Well-Platte auf die Mikroskopstufe.Nehmen Sie dann Zeitreihen von Z-Stack-Bildern von Brunnen, bis das Protein vollständig aus der Referenz-DNA gebunden ist. Führen Sie den Titrationstest gemäß dem Manuskript durch. Verwenden Sie dann die HiP-FA-Software, um Titrationskurven für einzelne Konkurrenzsequenzen zu erstellen.Klicken Sie dann auf die Export-Schaltfläche, um die Dissoziationskonstante und die Konzentration des aktiven Proteins in jedem Titrationsbrunnen zu erhalten. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie die viskosen Gellösungen pipetieren. Ungenaue Pipettierungen können die Genauigkeit für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten senken.In dieser Studie wird die HiP-FA-Methode angewendet, um die DNA-bindenden Präferenzen eines B-Reißverschluss-Transkriptionsfaktors zu bestimmen. Giant, aus dem Fly-Segmentierungs-Gen-Netzwerk. Die hohe Ähnlichkeit der PWM für Replikationen, die entweder manuell oder mit Automatisierungstechniken vorbereitet wurden, zeigte die hohe Reproduzierbarkeit der HiP-FA-Methode.PWM s bei dieser Methode und anderen Methoden sind insgesamt ähnlich. An den Positionen zwei und sieben des Kernmotivs sind jedoch signifikante Abweichungen zu beobachten, bei denen Mutationen entweder zu einem vollständigen Bindungsverlust oder zu einer viel stärkeren Bindung als frühere Messungen führen können. Wir verwenden HiP-FA, um Verfeinerungen für die Bindungen von Dutzenden von Transkriptionsfaktor zu generieren und es zeigt, dass am Ende eine bessere Vorhersage der Daten zu erhalten.Wir glauben, dass sein Maß an hoher Genauigkeit sehr nützlich sein kann, um die TF-DNA-Bindung für das gesamte System oder für alle Arten von Interaktionen besser zu verstehen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Forschung

Biochemie

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

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Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

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Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

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Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

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