Name: high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

אנו מודים מולר ג'יי cDNA שיבוטים וחברי המעבדה גאליה, בפרט Bergelt ס, עצה יקר ודיון נמרצת. עבודה זו נתמכה על ידי SFB 646, רשתות בקרה רגולטריות הגנום ביטוי ותחזוקה (סי ת), המרכז עבור המדע חלבון משולב (U.G.), המדרשה עבור כמותיים החיים מינכן (טרשת נפוצה). U.G. מודה תמיכה על ידי פתוח (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), את Bundesministerium לדנציג Bildung und Forschung (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie), ושל קרן הומבולדט (אלכסנדר פון הומבולדט, פרופסורה).

<ol>
	<li>Berg, O. G., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+DNA+binding+sites+by+regulatory+proteins.+Statistical-mechanical+theory+and+application+to+operators+and+promoters.">Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters.</a> Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).</li><li>Hammar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+transcription+factor+dissociation+excludes+a+simple+operator+occupancy+model+for+gene+regulation.">Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation.</a> Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells.">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li><li>Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+expression+patterns+from+regulatory+sequence+in+Drosophila+segmentation.">Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation.</a> Nature. 451, 535-540 (2008).</li><li>Schroeder, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+in+the+segmentation+gene+network+of+Drosophila.">Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila.</a> PLoS Biology. 2, 271 (2004).</li><li>He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+models+of+transcriptional+regulation+by+enhancers:+the+roles+of+synergistic+activation,+cooperative+binding+and+short-range+repression.">Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression.</a> PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).</li><li>Wilson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Transcription+in+Mice+Carrying+Human+Chromosome+21.">Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21.</a> Science. 322, 434-438 (2008).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnaase+footprinting+-+simple+method+for+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-plasmon+resonance+for+gas-detection+and+biosensing.">Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing.</a> Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, (2010).</li><li>Berger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+universal+DNA+microarrays+to+comprehensively+determine+transcription-factor+binding+site+specificities.">Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities.</a> Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).</li><li>Nitta, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+transcription+factor+binding+specificities+across+600+million+years+of+bilateria+evolution.">Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Binding+Specificities+of+Human+Transcription+Factors.">DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Noyes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+characterization+of+factors+that+regulate+Drosophila+segmentation+via+a+bacterial+one-hybrid+system.">A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system.</a> Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).</li><li>Nutiu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+DNA+affinity+landscapes+on+a+high-throughput+sequencing+instrument.">Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument.</a> Nature Biotechnology. 29, (2011).</li><li>Riley, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX.-seq:+a+method+for+characterizing+the+complete+repertoire+of+binding+site+preferences+for+transcription+factor+complexes.">SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes.</a> Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).</li><li>Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+approach+to+measuring+the+binding+energy+landscapes+of+transcription+factors.">A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors.</a> Science. 315, 233-237 (2007).</li><li>Isakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMiLE-seq+identifies+binding+motifs+of+single+and+dimeric+transcription+factors.">SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors.</a> Nature Methods. 14, 316-322 (2017).</li><li>Jung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=True+equilibrium+measurement+of+transcription+factor-DNA+binding+affinities+using+automated+polarization+microscopy.">True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy.</a> Nature Communications. 9, 1605 (2018).</li><li>Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+the+fluorescence+of+macromolecules:+Fluorescent+conjugates+of+ovalbumin+and+bovine+serum+albumin.">Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin.</a> Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Reutern/PySite">https://github.com/Reutern/PySite</a> (2018)</li><li>. Github Available from: <a target="_blank" href="https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA">https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</a> (2018)</li><li>Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).</li><li>St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo.">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-220 (1992).</li><li>Pankratz, M., J&#228;ckle, H., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. , 467-516 (1993).</li><li>Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+for+Transcription+Factor+Binding+Site+Identification+Using+Nonindependent+Interactions.">Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions.</a> Genetics. 191, (2012).</li><li>Noureddine, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+functional+impact+of+sequence+variation+on+p53-DNA+interactions+using+a+novel+microsphere+assay+for+protein-DNA+binding+with+human+cell+extracts.">Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts.</a> PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).</li><li>Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithm+for+prediction+of+tumour+suppressor+p53+affinity+for+binding+sites+in+DNA.">Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).</li><li>Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+measurements+of+molecular+interaction+kinetics+on+a+microfluidic+platform.">Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

היפ-פא הוא שיטה חדשה מקיפה לקביעת הנופים העדפה איגוד של אינטראקציות TF-DNA. זה מודד את הזיקות איגוד של mutational ה-DNA מוטיב משתנים ישירות, הימנעות כל הנחת היסוד כי איגוד העדפות משתקפים מתדירות המופעים נוקלאוטיד בקבוצת מעל הסף קלסרים. המדידה מתבצעת בפתרון ללא הנייח, הפרעה מכנית או כימית עם התגובה מחייב, קירוב שיווי משקל התנאים ככל האפשר. מערכת משלוח מבוקרת מאפשר מדידת עקומת טיטור מלא בתוך אחד טוב ומגדילה תפוקה ואמינות תוך חיסכון חלבון. באמצעות אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה, EM-CCD מצלמה עם יעילות אוסף אור גבוהה מאפשרת לגילוי אור פלורסנט רגישה מאוד. לפיכך, עם תוכנית התקנה זו, הפא קטן משתנה נמוך ככל 10-15 mP ניתן להבחין במדויק; בפועל, פירוש כל תגובה איגוד אשר העלייה ההמונית לאחר איגוד הוא מינימלי (יהיה נמוך ככל יחס מסה של 2) מזוהה בקלות. . זה בדרך כלל לא המקרה עם מערכות מסחריות כמו הקוראים microplate בשל רגישות גבוהה שלה, היפ-פא מרחיבה את טווח קבועי דיסוציאציה שניתן למדידה באופן מהימן לתוך הטווח picomolar. איגוד אנרגיות נקבעים במדויק על מספר סדרי גודל.
כדי להעריך את איכות PWMs המתוקן, ביצענו שני סוגים של ניתוח20. בדקנו, עבור חמישה גורמים של הרשת ג'ין פילוח, כמה טוב PWMs שונים יכולים לחזות פרופילים שבב-seq נסיוני באזורים גנומית של 21 גנים פילוח. כמו בדיקה נוספת, השתמשנו דגם כדי-ביטוי רצף4 אשר מנבאת דפוסי ביטוי של פילוח משפרי על בסיס מחייב העדפה וחלבון הריכוז של TFs המשתתפים. הן התרגילים, מצאנו PWMs היפ-פא ספציפית פחות לבצע באופן משמעותי יותר footprinting יותר ספציפי של B1H PWMs20.
שלא כמו שיטות דה נובו , היפ-פא דורש קצת ידיעה מוקדמת איגוד העדפה של TF נתון. עם זאת, רצפי הקונצנזוס ידועים TFs רבים, קיימות שיטות רבות יכולים לספק להם13,14,15. במידת הצורך, ניתן למצוא iteratively רצף נכון מחייב אופטימלית.
השתמשנו DNA הפניה oligomers בלוחיות fluorescently Cy5 ו Bodipy-650. צבעים אלה הוכיחו לבצע גם עבור הפא מדידות מאז. בנוגע למקורו של DNA הפניה מתויג המאוגדים והלא מאוגדים היו הגדולים ביותר בין צבעים שונים שנבדקו. פעולה זו מבטיחה טווח דינמית מרבי עבור ערכי ה-FA. באופן כללי, כל הפלורסנט עם ≥ שלמים קרינה פלואורסצנטית 1 ns צפוי להיות מתאים אבל צריך לבדוק קודם. במידת האפשר, מומלץ להשתמש צבעי ואזוריט בטווח קרוב-IR כדי למזער את החלבון autofluorescence.
השלב הקריטי ביותר של התהליך ניסיוני הוא pipetting של הג'ל לתוך הצלחות היטב. הפארמצבטית טובה דורשת אמצעי האחסון ג'ל כדי להיות כמו אחיד ככל האפשר. שינויי הגובה ג'ל מתורגם שינויים של diffusivity עבור אוליגומר תחרותי של ה-DNA, וכך משתנה לכאורה של אהדה בעת הערכת הנתונים. זה המקור העיקרי של שונות שכפול טכני. השימוש בטכניקות אלקטרונית pipet או אוטומציה משפר הפארמצבטית. בועות אוויר בתוך הג'ל יכול להימנע על ידי איטי וזהיר pipetting. זה חשוב גם להוסיף את כל הפתרונות המתחרה על הבארות טיטור עם עיכוב קטן ככל האפשר. עבור הפארמצבטית הטוב ביותר, כל התהליך יכול להיות אוטומטי באמצעות רובוט pipetting עם חום חממות. חלק קריטי להעברת הפרוטוקול אוטומציה הוא הכרחי אופטימיזציה של החממה הטמפרטורה והשעות הדגירה. הקפד למצוא איזון מיטבי בין צמיגות של הג'ל (כלומר. קר מדי) ואת יציבותו של חלבונים (קרי, לא חם מדי). זה תלוי גם על מהירות שחולק היחסי של ג'ל לתוך בארות ואת היציבות של החלבון בשימוש.
היפ-פא עושה שימוש מערכת מבוקרת עבור oligomers הדנ א המתחרה. כדי לבנות את עקומות titrations, יש צורך לקבוע את מתחרה DNA ריכוז c(z,t) עבור כל נתון z-מקמו בתוך המטריצה ג'ל והזמן נקודת t. זהו צעד קריטי נוסף, שכן הקביעה של KDs תלויה ישירות c(z,t). כיול בארות המכיל את צבען NB כמו חיישן ה-DNA ריכוז משמשים למטרה זו (איור 1d, איור 2). בדרך כלל, 3-5 כיול בארות המכיל NB לכל צלחת מספיקים. לפני הערכת כל הירך-פא ניסוי, עקומת כיול NB יש אפשרות לבנות עבור הסידור על-ידי ביצוע סדרת טיטור קונבנציונאלי NB מומס הג'ל agarose עם מתחרה DNA של כל רצף בריכוזים שונים (איור 3 ), כפי שהוסבר בהרחבה בשלב 8. במקרה של איגוד חזק מאוד (KD < 500 pM), אקסטרפולציה המשמש לקביעת ריכוזים נמוכים של מתחרה DNA הופך לגרוע, שכן הוא פחות מדויקות מדידה ישירה. עם זאת, עבור שר עם כזה נמוך KDs, ההגדרה של הירך-פא יכול לשמש לביצוע טיטור תחרותי קונבנציונאלי במאגר איגוד ללא שימוש מטריקס ג'ל agarose (איור 5). לדוגמה, ניתן לבצע אחת טיטור מלא עם 12 ריכוזים שונים של מתחרה DNA בשורה בודדת של צלחת 96-ובכן.
מערכת משלוח מבוקרת דורש גם קינטיקה מהיר של איגוד TF-DNA, חלבונים יציבים, מאז פעפוע למרות הג'ל agarose היא דינמית (אם כי איטי). שני המאפיינים יכול להיבדק ישירות עם ההגדרה של הירך-פא ידי הבאים, לאורך זמן, הפא של שר עניין כאשר הוא מאוגד כדי שלהם בהתאמה fluorescently שכותרתו הפניה הדנ א. אנו נמדדים המחירים KON ו- KOFF עבור הגורמים ובדוקים ומצא אותם להיות הסדר אלפיות השניה שניות20, על פי מחקרים אחרים30. . זה מספיק מהר כדי להבטיח כי מדידות יתקיים ב שיווי משקל. במקרה של תגובות אחרות מחייב עם קינטיקה איטי יותר, ניתן לכוונן את diffusivity של המתחרה על-ידי הורדת הריכוז שלו או הפחתת גודל הנקבוביות ג'ל. במקרה TFs שנבדקו, אשר כולם יש מהיר T. (~ שניות), זמן סך מדידה של 1-2 h מספיקה להבטיח שיווי משקל תרמודינמי-כל אחת מהמידות.
עוד נושא פוטנציאליים הקשורים החלבון הוא היווצרות של אגרגטים חלבון זה עשוי לשנות מידות הפא. השימוש של תנאים אחרים מאגר המכיל תוספים שונים (כמו tensides) יכול למנוע היווצרות צבירה, במידת הצורך.
עבדנו תחת ההנחה ליניאריות של PWM; עם זאת, היפ-פא וניתן לשנותם כדי לכלול כל המוטציות di אפשרי-נוקלאוטיד של רצף קונצנזוס. לבסוף, היפ-פא ניתן להתאים כדי למדוד סוגים אחרים של איגוד אינטראקציות. תנאי מוקדם הוא שתהיה מולקולה התייחסות מתאימה זמין מחויב על ידי החלבון אשר יכול להיקרא fluorescently. עם מערכת משלוח מבוקרת, הדרגתי הריכוז יכול להיווצר עבור כל סוג של ליגנד; לכן, ניתן למדוד אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון סמים עם דיוק גבוה באופן דומה והתפוקה.

נתון התפקיד המרכזי של גורמי שעתוק (TFs) הכונה, קביעת ההעדפות שלהם מחייב בצורה כמותית היא בעלת חשיבות עליונה. מחקרים הזרע על ידי פון היפל הציג את הרעיון שלא שר רגולטוריות לזהות במהירות ה-DNA, כך שלהם מחייב ובכן מתואר על ידי שיווי משקל תרמודינמי, בזמן האירועים במורד הזרם של גיוס RNA פולימראז כדי האמרגן נשלטות על-ידי קינטיקה איטי1. מחקרים שנעשו לאחרונה ויוו איגוד מציע כי התמונה הזאת הוא סביר יותר מורכב2,3; יחד עם זאת, הנחות כלליות אלה לשמש הערכות טוב, תומך גישות חישובית רבות כדי למצוא אלמנטים cis-רגולציה ולחזות ביטוי מ רצפי-4,-5,-6. בזמן שיווי משקל מחייב ולכן ננקטה בהצלחה כמושג, שיטות לקביעת TF-DNA אינטראקציות להתמקד מחייב ירידה לפרטים ואינם בדרך כלל ישירות מידה מחייב הזיקות על שיווי משקל. המדידה השיטתית של TF-DNA איגוד מייצג אתגר טכני משמעותי, ויש שיטות קיימות מספר מגבלות שונות.
Immunoprecipitation כרומטין ואחריו עמוק רצף (צ'יפ-seq)7, הנפוצות ביותר ויוו הטכניקה, אינו מתיר את המדידה של איגוד הזיקות או לוקליזציה מדויק של איגוד אתרי בתוך שברי גנומית. במספר במבחנה שיטות כולל DNase footprinting8, electrophoretic ניידות shift (EMSA)9, משטח פלזמון תהודה (SPR)10ו- microscale thermophoresis11 מסוגלים למדוד את הזיקות האיגוד, אבל הם תפוקה נמוכה יחסית. לעומת זאת, טכניקות תפוקה גבוהה כולל מיקרו-מערכים של איגוד חלבון12,13,HT-SELEX14אחד-היברידית חיידקי (B1H)15 אינם מסוגלים למדוד את הזיקות מחייב, בדרך כלל תשואות יתר על המידה ספציפית האיגוד רצפים, וזה בעיקר בזכות הבחירה מחמירים או לשטוף את הצעדים הדרושים. פיתוחים מאוחרים יותר כוללים רצף עמוק מבוסס ה-להיטים-FLIP16, SELEX-seq17, לבין MITOMI מבוססי מיקרופלואידיקה18 או חיוך-Seq19, אשר מאפשרים לחילוץ של הזיקות איגוד מוחלט; עם זאת, הם מסתמכים על מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית שכותרתו TF ודנ א. קרינה פלואורסצנטית אותות, לכן, להיות הגבלת בריכוזים נמוכים חלבון, בקביעת ערכי KD נמוכה (< ~ 10 ננומטר). יתר על כן, האיגוד TF-DNA בשיטות האלה מתקיים על משטחים דקים, העלאת בעיות עם איגוד לא ספציפי ו/או רקע אוטומטי-זריחה, מה שהופך את זה קשה לכמת במדויק את איגוד חלש.
כדי לטפל מגבלות אלה, פיתחנו שיטה חדשה כדי לקבוע נופים זיקה TF-DNA שיווי משקל ועל בפתרון, שאנו קוראים להם ביצועים גבוהים פלורסצנטיות חיזקו (היפ-פא)20. הטכניקה היא מבוססת על assay חיזקו (FA)21 קרינה פלואורסצנטית הוקמה אך שונה כדי למדוד איגוד קבועים עם רגישות גבוהה, בקנה מידה גדול באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מותאם אישית ניתוח ההתקנה.
וזמינותו פא מנטרת את האינטראקציה של מינים fluorescently שכותרתו (כמו אוליגומר דנ א) שותף מחייב, במקרה זה TF, על ידי מדידת הרוטציה מולקולרית של המולקולה שכותרתו. על קשירה TF, מהירות הסיבוב שלה יורדת עקב רדיוס hydrodynamic גבוה יותר משקל מולקולרי של המתחם מאוגד, דבר המתבטא פא מוגברת. המדידה מדויק של איגוד חזק מאוד (KD < ~ 1 ננומטר) מחייב שימוש ריכוזים נמוכים של הפניה שכותרתו, ה-DNA (c < ~ 1 ננומטר). זה קשה להשיג עם מכשיר מסחרי כגון קורא microplate רגיל. בנוסף, שינוי גודל גדול (10-100 קיפול) בין מתחמי המאוגדים והלא מאוגדים הוא בדרך כלל הכרחי, האוסר על מדידה של אינטראקציות בין TF מחייב תחומים קצר oligomers הדנ א, אשר בדרך כלל של משקולות מולקולרית בערך דומה . לבסוף, עיקול טיטור מלא בדרך כלל דורש הכנה של מדידה של מספר בארות המכיל סידרה ריכוז עבור המין titrating.
כדי לטפל בבעיות אלה, אנו משתמשים מלכודת מיקרוסקופ widefield, שונה כדי להשיג איתור רגישות ולאפשר מדידות ה-FA ב- z-עמדות שונות של באר בודדת. זה מאפשר לנו לעקוב אחר מחייב אינטראקציות בין מינים של משקל מולקולרי דומה ועם הזיקות גבוהה. תפוקה גבוהה יותר מושגת על ידי מדידת פא בתוך צלחת טוב מרובה תבניות, בביצוע סדרות טיטור כל יחיד טוב תוך שימוש מבוקר משלוח במערכת (איור 1). יתר על כן, על ידי שימוש assay איגוד תחרותיים, אנחנו לחלץ לא רק הקבועים מחייב, אלא גם את הריכוז של חלבון פעיל. זוהי תכונה חשובה של וזמינותו, שכן רק חלק ביטוי TF מולקולות פעילים חלבון misfolding או השפלה. הגדרת הניסוי מבוסס על מיקרוסקופ epifluorescence מסחריים המצוידים XY - ו Z-piezo בשלבים. אנחנו לשדרג את המערכת עם לייזר חיצוני עירור, ואז זיהה שהשני הנפלטים קיטוב לינארי רכיבים על השבב של מצלמת EM-CCD עם נצילות קוונטית גבוהה לגילוי אור (איור 1b ו- 1 c). המערכת משתמשת יעד מפתח נומרי גבוהה (NA) מצמידים חיישן רגיש במיוחד, ובכך ונותנת לו מדידות פא רגישה מאוד. על ידי רישום פלורסצנטיות z-במחסן, איגוד אינטראקציות ניתן למדוד לאורך ציר z אופטי בעת שימוש במטריצה הטרוגנית עבור שני המגיבים. כל השינויים הללו ניתן ליישם בקלות על מערכת קיימת, חסכונית.
אנו מעסיקים וזמינותו של איגוד תחרותיים שבו נמדד בזיקה איגוד של אוליגומר ללא תווית ה-DNA לעומת ה-DNA fluorescently שכותרתו, אשר משמש כהפניה. TF והפניה DNA משולבים בריכוזים קבוע במטריצה ג'ל agarose נקבובי (נקבובית גודל ~ 1 מיקרומטר) המהווה סביבה ללא אינטראקציה עבור האיגוד. ההפניה DNA מסומן עם Cy5. צבע זה התבררה מתאים היטב פא מדידות בשל תקופת חייו פלורסצנטיות ארוכות יחסית (~ 1ns) ואת פליטת קרינה פלואורסצנטית ב מרחיקת אדום של הספקטרום הנראה (auto נמוך-ידי קרינה פלואורסצנטית רקע). ריכוז TF היא טוחנת עודף מעל DNA Cy5-הפניה, ולהבטיח כי כל התייחסות DNA מאוגד חלבון. פתרון של תווית מתחרה DNA ואז נצבר על פני ג'ל ו מפזרת בתוך המטריקס נקבובי, הקמת הדרגתי ריכוז c (z, t) ומשתנה במשך את z-העמדה של מטוס מוקד, בזמן t (איור 1, איור 2-2 c). TF מאוגד ל- DNA Cy5-התייחסות ולכן חשוף באופן מקומי ריכוזים שונים של המתחרה DNA מתחרה עבור איגוד, המוביל אל פא בשומר דנ א Cy5-הפניה פאREF(z, t) (איור 2b ו- 2 c).
כדי לקבוע את c(z,t) ריכוז המתחרה, אנו מודדים בבארות נפרד (כיול וולס) אות הפא באופן דינמי המשתנה של הנילוס הכחול (NB) פאNB(z, t) (איור 2ו- 3). צבע זה intercalates לתוך ה-DNA, ובכך משמש חיישן ה-DNA עבור המתחרה הדנ א. עם מערכת מבוקרת זו מסירה, ניתן למדוד עשרות למאות הזיקות מחייב חלבון-דנ א שונים בתוך לוח רב טוב אחד (96 - או 384-ובכן צלחת תבנית). המדידה מתבצעת ואז ברצף עד תזוזה מוחלטת של ההפניה שכותרתו DNA מ TF. אנחנו נקבע יחודיות מחייב עבור גורם נתון על ידי מדידה של הזיקות של 3 N כל יחיד-בסיס מוטציות של רצף קונצנזוס באורך N. היפ-פא דורשת כמויות נמוכות של חלבון (~ pmols לפי עקומת טיטור) מראה השתנות בקביעת K sD[מקדם של וריאציה (CV) < 20%], תוך מתן אפשרות מדידות בקנה מידה גדול יחסית נמוך. השיטה יכול להתבצע באופן ידני או באופן מלא אוטומטית באמצעות מערכת רובוטית, וכתוצאה מכך CVs אפילו פחות (איור 4, החלונית העליונה). קבועי דיסוציאציה נמדדים עם רמת דיוק גבוהה עד 0.5 ננומטר. עבור הזיקות גבוהה מאוד (KD < 500 pM), אנו משתמשים טיטור תחרותי סטנדרטי (איור 5) עקב אי דיוקים מדידת ריכוזים מתחרה DNA ברמות נמוכות (< 100 ננומטר).
יכול להיות מיושם על כמעט בכל קנה מידה, הפוכה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescence, סיפק את הזמינות של שלב-תרשימי XY אוטומטיים ו שלב ציר z piezo היפ-פא. רכיבים אופטיים נבנו סביב התקנה אוטומטית widefield מצויד עם מטרה למרחקים ארוכים. בפועל, וזמינותו ניתן להתאים מטרות עם מאפיינים אחרים (ב עבודה מסוימת, מרחק ו מפתח נומרי). עם זאת, זה דורש אופטימיזציה של הפרמטרים (המרחקים בין z-פרוסות, נקבוביות וגובה agarose ג'ל, וכו '.). השימוש של סוגים אחרים של לייזרים או מצלמה אפשרי גם כן. תיאור מפורט של כל התהליך ניסיוני, ניתוח נתונים ניתנת להלן בסעיף פרוטוקול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:915px;" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:183px;">Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nile Blue A</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">N5632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">655891</td>
			<td>175 &#181;m thick glass bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">384 Well Sensoplate, black</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">788896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">A9414-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tween-20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:341px;">Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Q-POD Element</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZMQSP0DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Millipak 40 Gamma Gold Filter</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>MPGL04GK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Milli-Q Integral 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Quantum TIX</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>QTUMOTIX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mastercycler gradient</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:245px;">Z316083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.706.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tube 15 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MICROSCOPY SETUP:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Automated widefield microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long distance objective</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">638 nm line continuous diode laser</td>
			<td>Omicron</td>
			<td>PHOxX 638-40, 40mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back-illuminated EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon DV897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichroic mirror</td>
			<td>AHF</td>
			<td>640nm cut-off</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bandpass filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td>ET bandpass 700/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linear polarizer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">LPVISC050-MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">BS010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Achromatic lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>200 mm focal length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multimode optical fiber</td>
			<td>Optronis</td>
			<td>FVP600660710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ROBOTIC SYSTEM:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:341px;">Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek NXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SOFTWARE:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programming language</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Labview 9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Script for the HiP-FA software available at</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy

כימות מדויק של גורם שעתוק (TF)-DNA אינטראקציות חיוני להבנת ברגולציה של ביטוי גנים. מאז גישות קיימות סובלים מגבלות משמעותיות, פיתחנו שיטה חדשה לקביעת TF-DNA הזיקות מחייב עם רגישות גבוהה בקנה מידה גדול. וזמינותו מסתמך על העיקרון חיזקו (FA) זריחה הוקמה אך מציגה שיפורים טכניים חשובים. ראשית, אנו מודדים עיקול טיטור תחרותי מלא פא לבאר בודדת על-ידי שילוב TF והפניה fluorescently שכותרתו DNA במטריצה ג'ל agarose נקבובי. אוליגומר DNA ללא תווית טעון על גבי כמתחרה וצורות, באמצעות דיפוזיה, הדרגתי-עתיים. מעבר הצבע פא וכתוצאה מכך הוא אז לקרוא באמצעות מלכודת מיקרוסקופ epifluorescence מותאם אישית. תוכנית התקנה זו משופרת מגדיל מאוד את הרגישות של זיהוי האות פא, המאפשר קשירה חזקים וחלשים כאחד ניתן באופן אמין לכמת, אפילו עבור מולקולות של משקולות מולקולרי דומה. באופן זה, אנו יכולים למדוד עקומת טיטור אחד לכל טוב של צלחת רב טוב, באמצעות הליך מתאים, אנחנו יכולים לחלץ קבוע דיסוציאציה מוחלטת (דK) והן ריכוז חלבון פעיל. על-ידי בדיקת כל מוטציה נקודה אחת הווריאציות של קונצנזוס נתון מחייב רצף, אנחנו יכולים הסקר בנוף ירידה לפרטים הכריכה כולה של TF, בדרך כלל על לוח אחד. מטריצות משקל העמדה המתקבלת (PWMs) לפעול טוב יותר אלה נגזר בשיטות אחרות לניבוי ויוו TF תפוסה. כאן, אנו מציגים מדריך מפורט ליישום היפ-פא מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות קונבנציונאלי, הצינור ניתוח נתונים.

אנחנו יחולו היפ-פא TFs של פילוח ג'ין רשת25,26, אשר מפיק את תבנית הגוף הקדמי-אחוריים של עוברי דרוזופילה, בעיקר באמצעות רגולציה תעתיק. מ רשת זו, בחרנו bZIP את תחום TF ענק (Gt) עבור ניתוח מפורט (איור 4). מאז גורמי שעתוק באורך מלא מתקשה לבטא תשואות בעיקר בהעדפות מחייב אותו כמו שלהם מחייב תחומים (DBD) של הדנ א13, אנחנו המשמש את DBD דבוקה GST והביע הבונה ב e. coli GST פיוז'ן חלבונים לספק את אותן תוצאות כמו DBDs לבד20.
רצף הקונצנזוס Gt (TTACGTAAC) מייצג את רצף מחייב החזק קבענו כמתואר לעיל. אנחנו מכן חקר ההשפעה על האנרגיה איגוד של כל מוטציות נקודה אחת אפשרית בטווח 10-מר Gt רצף הסכמה (סך של 30), ולצדו בסיסים נוספים בקצוות 5' ו- 3'. מדדנו משכפל שתי דגימות ג'ל אשר הופקו באמצעות אוטומציה, אחד שכפול נוספים המיוצרים באופן ידני עבור השוואה. KDs נע בין 0.6 אל > 2000 nM עבור רצפי ביחידים מוטציה, אישר לנו גם העדר מוחלט של איגוד רצף "מחייב" (נתונים לא מוצג).
TF-DNA איגוד specificities הם בדרך כלל הדגם שימוש במטריצה משקל מיקום (PWM), שבו מוקצה ניקוד כל נוקלאוטיד אפשרי-כל תנוחה המוטיב מחייב. PWM מבוסס על ההנחה כי לכל תפקיד תורם מחייב כוח באופן עצמאי, ברוב המקרים מהווה מודל מספיק TF מחייב העדפות27. יצרנו PWMs מתוקנת המבוססת על המידות שלנו זיקה הבאים נוסדה הליכים28,29 , לעומת אותם שני PWMs דיווח בעבר בספרות. הראשונה מבוססת על נוקלאוטיד ספירות תדר של איגוד אתרי המזוהה על-ידי ה-DNA footprinting4,5, PWM השני היה מתקבל על ידי חיידקי אחד-היברידית (B1H) הנבחר. 15
הדמיון גבוהה של PWMs עבור שלושה משכפל (איור 4, החלונית העליונה), כולל עבור הדגימה להכין ידנית (שכפול 3), מדגים את הפארמצבטית גבוהה של השיטה היפ-פא. אמנם PWMs מתקבל על ידי היפ-פא הכוללת דומה PWMs שהושגו עם השיטות האחרות (איור 4, החלונית התחתונה), יש סטיות משמעותיות: במיקום 2 (חץ שחור), ההתחלה של המוטיב bZIP הליבה, מוטציות T > (G, C, A) להוביל להשלים את אבדן האיגוד ב מוטיב מתקבל על ידי היפ-פא, דבר העולה בקנה אחד עם מוטיב B1H אבל לא עם זה שהושג עם DNase footprinting, שבו האיגוד נשאר חזק יחסית עבור בסיסים (ז, א). לעומת זאת, ב מקם 7 (חץ אפור), המוטציה T > C מוביל הרבה איגוד חזק יותר מאשר הצפוי בהתבסס על PWMs נמדד קודם לכן.
סטיות אחרות הן עדינות יותר אבל לא פחות חשוב. הכולל, PWM היפ-פא הוא פחות ספציפית יותר השניים האחרים, המשקף את העובדה כי מוטציות רבות מהקונסנזוס עדיין להניב חזק בינוני מחייב. זה ניתן לכמת באמצעות התוכן מידע (IC). IC הוא 11.5 סיביות עבור המטריצה היפ-פא (ממוצע של משכפל שלוש), בהשוואה ל IC = סיביות 13.4 וסיביות 16.8 DNase footprinting ו B1H מטריצות, בהתאמה. בדרך כלל (אם כי לא אוניברסלית), PWMs מתקבל על ידי היפ-פא הן ספציפיות פחות מאשר אלה התקבלו ע י שיטות אחרות, בהתבסס על 26 TFs חקר20.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> איור 1:תיאורים סכמטי של הירך-פא assay, הגדרת הניסוי. (א) ג'ל מערכת משלוח עבור titrating מתחרה DNA בבארות יחיד. (ב) היפ-פא מיקרוסקופ כיוונון. התאמה אישית של מיקרוסקופ widefield אוטומטית עם זיהוי אור מקוטב זריחה על מצלמה EM-CCD. (ג) גלם התמונה זריחה עם שני האיזורים עניין לקביעת המקבילה (אדום) ו בניצב (ירוק) מקוטב רכיבים. (ד) הפריסה טיפוסי של צלחת 96-ובכן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> איור 2 : נתונים גולמי פא ועיקולים טיטור המשוחזרת. (א) מסלול FA(z,t) אופיינית עבור כיול טוב המכיל NB. (b, c) FA(z,t) הזמן מסלולים עבור שתי בארות טיטור מדידה איגוד חזק (b), המתחרה איגוד דנ א (ג) מתון יותר. (ד, ה) המתאים שיחזר פא טיטור מדידות ולהכניסם עקומות עבור חזקה (ד) ובינוני (e) מחייב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> איור 3 : קביעת הריכוז של מתחרה DNA c (z, t) באמצעות הנילוס הכחול (NB). (א) פא-ריכוז עקומת כיול עבור 16 oligomers DNA בסיסים. בסדרת טיטור קונבנציונאלי, NB שמוטבע agarose ג'ל יחד עם ריכוזים שונים של מתחרה DNA. זיקתו של NB ל- DNA הוא תלוי-רצף20; לכן, עקומות כיול אותו יכול לשמש לקביעת c (z, t) עבור רצפי דנ א שונים באותו אורך. (ב) המתחרה פרופיל הדנ א זמן דיפוזיה בגובה שרירותי z באמצעות חמש בארות כיול. עבור כל מחזור המדידה, FAs ממוצע של ארבע בארות המכילות NB מוצגים כמו נקודות לבנות. העקומות כוללים באמצעות משוואה 3 (הקו הלבן, בארות בודדים בצבע) ו- c (z, t) בריכוזים נמוכים (C < ~ 100 ננומטר) נקבע על ידי עקומת התאמה משוערים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> איור 4 : איגוד specificities של משפחת תחום bZIP TF ענק (Gt). PWMs היפ-פא של משכפל שלושה: שניים שהוכנו באמצעות אוטומציה ואחד שהוכנו באופן ידני (החלונית העליונה) לעומת PWMs שנוצר על ידי DNase footprinting על ידי חיידקי אחד-היברידית (B1H) בחירת השיטה (החלונית התחתונה). בסך הכל, המוטיבים איגוד היפ-פא מסכים עם הנתונים הקודמים, אבל גם מראים הבדלים משמעותיים, כפי שמודגש עם החצים שחור ואפור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> איור 5 : קונבנציונלי טיטור תחרותי עם הירך-פא. (א) עיצוב מראה 8 דנ א שונה מתחרה באופן סדרתי מדולל במאגר איגוד בשורה בודדת של צלחת 96-ובכן. מפת החום של הפא מוצג עבור קישור שרירותי שונים נקודות החוזק. (ב) טיטור תחרותי של שלושה מתחרים DNAs איגוד TF Bcd עם הזיקות השונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הזיקות מחייב שיווי משקל ועל בתמיסה עם רגישות גבוהה בקנה מידה גדול. זה משפר את ניתוח כמותי של שעתוק מקדם-DNA מחייב. השיטה מבוססת על מידות חיזקו פלורסצנטיות אוטומטי מערכת מבוקרת.

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

כדי לשפר את ההבנה של עקדת גורם שעתוק-DNA, פיתחנו שיטה למדידת קבועי דיסוציאציה בקנה מידה גדול באמצעות למשל מדידות אניזוטרופיה. טכניקה זו מאפשרת קבלת עקומות טיטרציה מלאות באופן אוטומטי כדי לקבוע את קבוע הדיסוציאציה ברגישות גבוהה. זה עובד בפתרון ב שיווי משקל, יש תפוקה מתונה טווח דינמי גדול.יישמו את HiP-FA כדי לחדד את נוף הזיקה המחייבת של גורמי שעתוק. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על סוגים אחרים של אירועים מחייבים כמו חלבון חלבון או חלבון-תגובות בין תרופתיות, למשל. אני ממליץ לבצע תחילה מספר טיטריות עם אותם שותפים מחייבים כדי לקבל הערכה לגבי השכפול של המדידות.אם אפשרות זו זמינה, השתמש במערכת אוטומטית כדי להפוך אותה לזמינה עוד יותר. כדי להפוך את אוליגומרים DNA של ה-DNA התייחסות, לערבב שבעה microliters של כל עשרה מילימולר די שכותרתו קדימה גדיל הפוך ללא תווית בצינור אחד. עבור ה-DNA המתחרה, לערבב 20 microliters של כל גדיל 100 מילימולאר ללא חגורה לשתי בארות של צלחת PCR 96 היטב.לאחר מכן, השתמש במכונת PCR סטנדרטית כדי לחמם את פתרונות הדנ"א ל-70 מעלות צלזיוס למשך שלוש הדקות. לאחר מכן, להפחית את טמפרטורת החדר בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה. השתמש בתנור מיקרוגל כדי להמיס 0.5 גרם אגרוז ב 100 מיליליטר מחייב חיץ.הוסף מים מזוקקים כפולים כדי להתאים את הנפח הסופי כדי לפצות על אידוי אפשרי. הכינו 10 מיליליטר עליות במניות. כדי להכין את בארות טיטרציה וכיול של צלחת 96 באר, להעביר שני aliquots מלאי ג'ל שייקר אינקובטור 75 מעלות צלזיוס.עבור כל titration היטב, להוסיף 1.4 ננומולים של DNA התייחסות, חלבון גורם שעתוק, בריכוז סופי של 20-60 nanomoles, 0.2 מילימולר DTT, ואת המאגר מחייב 240 microliters של ג'ל מומס. מערבבים היטב על ידי היפוך ורעידת הצינור. לאחר מכן, לאט פיפטה 200 microliters לכל באר של ג'ל המכיל DNA בארות טיטריון המיועד של צלחת 96 גם.עבור כל כיול היטב, להוסיף 5 ננומולים נייל כחול צבע ל 240 microliters של ג'ל מומס. הימנעות בועות אוויר, לאט pipette 200 microliters של פתרון ג'ל המכיל צבע בחמש עד שש בארות של צלחת 96 היטב. מניחים את הג'ל על משטח אופקי לחלוטין ודגירה במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר, ועוד 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.השתמש בקורא צלחות רב היטב כדי לבדוק את ההומוגניות של רמות גובה הג'ל בארות שונות של הצלחת. כדי להכין את פתרון הדנ"א המתחרה, שלבו תחילה את הדנ"א של הייחוס המסווים, את החלבון ואת מאגר הכריכה המרוכז בשלושה קיפולים. לאחר מכן, מערבבים 20 מיקרוליטרים של הפתרון עם 40 מיקרוליטרים של כל אחד מפתרונות הדנ"א המתחרים.עבור כל היטב כיול, לשלב את הכמויות המתאימות של אחד מפתרונות ה-DNA המתחרה annealed ואת חיץ כריכה מרוכזת פי שלושה המכיל 15 מילימולרי נימי כחול פתרון צבע. לבסוף, להוסיף 50 microliters של פתרונות מתחרים מעורבים על גבי הג'לים בו זמנית ככל האפשר. כדי להתחיל ברכישת תמונה, מקם את צלחת הבאר 96 על שלב המיקרוסקופ.לאחר מכן, לקחת סדרת זמן של תמונות מחסנית Z של בארות עד ביטול מוחלט של החלבון מן ה-DNA התייחסות. בצע את בדיקת התיסוס על פי כתב היד. לאחר מכן השתמש בתוכנת HiP-FA כדי ליצור עקומות טיטריות עבור רצפי מתחרים בודדים.לאחר מכן, לחץ על כפתור הייצוא כדי לקבל את קבוע הדיסוציאציה ואת הריכוז של החלבון הפעיל בכל טיטריאציה היטב. יש לדאוג במיוחד בעת צינורות פתרונות ג'ל כי הם צמיגים. צינורות לא מדויקים יכולים להוריד את הדיוק לקביעת קבועי הדיסוציאציה.במחקר זה, שיטת HiP-FA מוחלת כדי לקבוע את ההעדפות מחייבות DNA של גורם שעתוק B-מכווצת. ענק, מרשת הגנים של פילוח הזבובים. הדמיון הגבוה של ה- PWM עבור שכפולים שהוכנו באופן ידני או באמצעות טכניקות אוטומציה הדגים את הרבייה הגבוהה של שיטת HiP-FA.PWM של מתקבל על ידי שיטה זו ושיטות אחרות דומות בסך הכל. עם זאת, ניתן לראות סטיות משמעותיות בעמדות 2 ו-7 של מוטיב הליבה שבו מוטציות יכולות להוביל לאובדן מוחלט של כריכה, או קשירה חזקה בהרבה ממדידות קודמות. אנו משתמשים ב- HiP-FA כדי ליצור עידונים עבור כריכות של עשרות גורם שעתוק וזה מראה כי מקבל בסופו של דבר חיזוי טוב יותר של נתונים.אנו מאמינים כי המדד שלה של דיוק גבוה יכול להיות מאוד שימושי כדי להבין טוב יותר TF-DNA מחייב עבור כל המערכת או עבור כל מיני אינטראקציות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...