Name: high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00
Duration: 6 min 38 s
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Ringraziamo J. Müller per cloni di cDNA e membri del laboratorio Gallia, in particolare S. Bergelt, per i preziosi consigli e discussione vivace. Questo lavoro è stato supportato da 646 SFB, reti di regolazione nell'espressione del genoma e manutenzione (C.J., P.B.), il centro per la scienza di proteina integrato (U.G.) e la scuola di specializzazione per quantitativi Biosciences Monaco di Baviera (M.S.). U.G. riconosce supporto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie) e la fondazione Humboldt (Alexander von Humboldt, Cattedra).

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Anca-FA è un completo nuovo metodo per determinare i paesaggi di preferenza di associazione delle interazioni TF-DNA. Misura affinità di legame di mutational varianti del DNA motivo direttamente, evitando qualsiasi ipotesi che preferenze di associazione vengono riflesse nella frequenza di occorrenza del nucleotide in un set di raccoglitori di sopra-soglia. Misura avviene nella soluzione senza immobilizzazione e interferenza meccanica o chimica con la reazione di associazione, ravvicinamento delle condizioni di equilibrio più fedelmente possibile. Il sistema di erogazione controllato consente la misurazione di una curva di titolazione completa all'interno di un singolo bene e aumenta l'affidabilità e velocità effettiva durante il salvataggio della proteina. Utilizzando un obiettivo con un'apertura numerica elevata ed EM-CCD fotocamera con un'efficienza alta collezione light permette per rivelazione di luce fluorescente altamente sensibile. Quindi, con questa configurazione, piccolo FA cambia in basso come 10-15 mP possono essere rilevate con precisione; in pratica, ciò significa che qualsiasi reazione di associazione per la quale è facilmente rilevato l'aumento di massa dopo l'associazione è minimo (basso quanto un rapporto massa 2). Questo non è solitamente il caso con sistemi commerciali come lettori di micropiastre. Dovuto la relativa alta sensibilità, anca-FA amplia la gamma di costanti di dissociazione può essere attendibilmente nella gamma picomolare. Energie di legame sono determinate con precisione su più ordini di grandezza.
Per valutare la qualità del PWM riveduta, abbiamo effettuato due tipi di analisi20. Abbiamo testato, per cinque fattori della rete genica segmentazione, come ben diversi PWM può prevedere sperimentale ChIP-seq profili nelle regioni genomiche di 21 geni di segmentazione. Come una seconda prova, abbiamo utilizzato un modello di espressione di sequenza4 che predice il pattern di espressione di esaltatori di segmentazione sulla base della concentrazione di preferenza e proteina di associazione di TFs partecipanti. In entrambi gli esercizi, abbiamo trovato che il PWM HiP-FA meno specifici eseguire significativamente migliore rispetto al più specifico dell'impronta e B1H PWM20.
A differenza dei metodi de novo , anca-FA richiede una certa conoscenza preventiva di preferenza di un determinato TF associazione. Tuttavia, sequenze consenso sono noti per molti TFs, e molti metodi esistenti è in grado di fornirli13,14,15. Se necessario, la sequenza di true associazione ottimale si trovano in modo iterativo.
Abbiamo usato gli oligomeri di riferimento DNA fluorescente etichettati con Cy5 e Bodipy-650. Questi coloranti hanno dimostrato di svolgere bene per misurazioni FA poiché l'anisotropia di DNA di riferimento etichettato associato ed erano il più grande tra i diversi coloranti testati. Questo assicura una massima gamma dinamica per i valori di FA. In generale, qualsiasi colorante fluorescente con fluorescenza durata ≥ 1 ns rischia di essere adatto ma ha bisogno di essere testati prima. Se possibile, si consiglia di utilizzare coloranti fluorescenti nella gamma vicino-IR per minimizzare la proteina autofluorescenza.
La fase più critica delle procedure sperimentali è il pipettaggio del gel nei piatti ben. Buona riproducibilità richiede i volumi di gel per essere il più uniforme possibile. Cambiamenti in altezza di gel sono tradotte in modifiche di diffusività per il competitivo oligomero di DNA e quindi in cambiamenti apparenti di affinità quando si valutano i dati. Questa è la fonte principale della varianza in una tecnica replica. L'uso di un tecniche di dispensare o automazione elettronica migliora la riproducibilità. Bolle d'aria all'interno del gel può essere evitata pipettando lento ed accurato. È anche importante aggiungere tutte le soluzioni di concorrente in cima i pozzetti di titolazione con come piccolo ritardo possibile. Per la migliore riproducibilità, l'intero processo può essere automatizzato utilizzando un robot pipettaggio con incubatori di calore. Una parte critica per il trasferimento il protocollo di automazione è necessario ottimizzare temperatura incubatrice e i tempi di incubazione. Assicurati di trovare un equilibrio ottimale tra la viscosità del gel (i. e., non troppo freddo) e la stabilità delle proteine (cioè, non troppo caldo). Questo dipende sia dalla velocità erogazione dei gel in pozzi e stabilità della proteina utilizzata.
Anca-FA fa uso di un sistema di erogazione controllato per gli oligomeri del DNA di concorrente. Per costruire le curve di titolazione, è necessario determinare la concentrazione del DNA a concorrente c(z,t) per ogni dato z-posizione nella matrice del gel e tempo punto t. Questo è un altro passo fondamentale, poiché la determinazione del KDs dipende direttamente da c(z,t). Pozzi di calibrazione contenente il colorante NB come un sensore per la concentrazione di DNA sono utilizzati per questo scopo (Figura 1d, Figura 2a). In genere, 3-5 pozzi di calibrazione contenente NB per ciascuna piastra sono sufficienti. Prima di valutare qualsiasi HiP-FA sperimentare, una curva di calibrazione NB deve essere costruita per il set-up eseguendo una serie di titolazione convenzionale di NB dissolto nel gel dell'agarosi con un concorrente del DNA di qualsiasi sequenza a diverse concentrazioni (Figura 3 un), come spiegato in dettaglio nel passaggio 8. In caso di associazione molto forte (KD < 500 pM), l'estrapolazione utilizzato per la determinazione delle concentrazioni basse di concorrente del DNA diventa limitando, dal momento che è meno accurata rispetto una misura diretta. Tuttavia, per TFs con tale basso KDs, l'installazione di anca-FA utilizzabile per eseguire una titolazione competitiva convenzionale nel buffer di associazione senza l'utilizzo di una matrice di gel di agarosio (Figura 5). Ad esempio, una titolazione completa con 12 differenti concentrazioni di DNA competitore può essere eseguita in una singola riga di una piastra a 96 pozzetti.
Il sistema di erogazione controllato richiede anche veloce cinetica di legame di TF-DNA e proteine stabili, poiché la diffusione anche se il gel dell'agarosi è dinamico (anche se lento). Entrambe le proprietà possono essere testate direttamente con il programma di installazione di anca-FA da seguito, nel corso del tempo, la FA di TFs di interesse quando è associato ai rispettivi fluorescente etichettati riferimento DNA. Abbiamo misurato KON e KOFF tariffe per i fattori indagati e li ho trovati ad essere dell'ordine di millisecondi a secondi20, secondo altri studi30. Questo è sufficientemente veloce per garantire che le misure avvengono all'equilibrio. Nel caso di altre reazioni di associazione con la cinetica più lenta, la diffusività del concorrente può essere sintonizzata abbassando la sua concentrazione o riducendo la dimensione dei pori gel. Nel caso il testata TFs, che tutti hanno veloce TOFF (~ secondi), un tempo di misura totale di circa 1-2 h è sufficiente a garantire l'equilibrio termodinamico a ogni misurazione.
Un altro potenziale problema correlato alla proteina è la formazione di aggregati proteici che possono alterare le misurazioni FA. L'uso di altre condizioni di buffer contenente diversi additivi (come tensioattivi) può impedire la formazione di aggregati, se necessario.
Abbiamo lavorato sotto l'ipotesi di linearità del PWM; Tuttavia, anca-FA può essere scalata per includere tutte le mutazioni possibili di nucleotide della sequenza consenso. Infine, anca-FA può essere adattato per misurare altri tipi di interazione di legame. Il presupposto è quello di avere disponibile una molecola di riferimento adeguati vincolato dalla proteina che può essere etichettata fluorescente. Con il sistema di erogazione controllato, un gradiente di concentrazione può essere generato per qualsiasi tipo di legante; di conseguenza, interazioni proteina-proteina e farmaco-proteina possono essere misurate Analogamente ad alta fedeltà e throughput.

Dato il ruolo centrale di fattori di trascrizione (TFs) nella regolazione genica, determinare le preferenze di associazione in maniera quantitativa è di fondamentale importanza. Seminali studi di von Hippel ha introdotto il concetto che la regolamentazione TFs riconoscere rapidamente DNA, tale che la loro associazione è ben descritto dall'equilibrio termodinamico, mentre gli eventi a valle della RNA polimerasi al promotore di reclutamento sono controllati da più lenta cinetica1. Recenti studi di binding in vivo suggeriscono che questa immagine è probabilmente più complesso2,3; Tuttavia, questi presupposti generali servono come buone approssimazioni e hanno sostenuto molti approcci computazionali per trovare elementi cis-regolatori e predire espressione da sequenze4,5,6. Mentre l'associazione equilibrio così è stato impiegato con successo come un concetto, metodi attuali per determinare interazioni TF-DNA concentrano sull'associazione di specificità e in genere non direttamente misura affinità di legame all'equilibrio. La misurazione sistematica di TF-DNA binding rappresenta una notevole sfida tecnica e i metodi esistenti hanno diverse limitazioni diverse.
Immunoprecipitazione della cromatina seguita da deep sequencing (ChIP-seq)7, la tecnica più diffusa in vivo , non consente la misura dell'affinità di legame o la precisa localizzazione dei siti all'interno di frammenti genomic di legame. Sono in grado di misurare l'affinità di legame, diversi in vitro metodi, tra cui footprinting8DNasi, mobilità elettroforetica (EMSA) Maiusc9, surface plasmon resonance (SPR)10e Microscala submicronica11 ma essi sono relativamente bassa velocità effettiva. Viceversa, non sono in grado di misurare l'affinità di legame e in genere resa eccessivamente tecniche di throughput elevato compreso proteina associazione microarrays12, HT-SELEX13,14e batteriche monoibrido (B1H)15 specifiche sequenze, che è principalmente dovuto alla rigorosa selezione di associazione o fasi di lavaggio necessari. Gli sviluppi più recenti includono il sequenziamento profondo basato HiTS-FLIP16, SELEX-seq17e la base di microfluidica MITOMI18 o sorriso-Seq19, che permettono per l'estrazione di affinità di legame assoluto; Tuttavia, si basano sulla misurazione di intensità di fluorescenza di etichettati TF e DNA. Segnali di fluorescenza, di conseguenza, diventati limitando alle concentrazioni di proteina bassa e nella determinazione di bassi valori di KD (< ~ 10 nM). Inoltre, l'associazione di TF-DNA in questi metodi si svolge su superfici sottili, sollevare questioni con associazione aspecifici e/o auto-fluorescenza background, che lo rende difficile quantificare con precisione l'associazione debole.
Per risolvere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per determinare i paesaggi di affinità TF-DNA all'equilibrio e in soluzione, che abbiamo chiamato ad alte prestazioni fluorescenza anisotropia (HiP-FA)20. La tecnica è basata sulla fluorescenza stabilito anisotropia (FA) dosaggio21 ma modificata per misurare le costanti obbligatorie con l'alta sensibilità e su larga scala utilizzando un microscopio automatizzato su misura e installazione di analysis.
Il saggio FA monitora l'interazione di specie fluorescente contrassegnati (come un oligomero di DNA) a un partner di associazione, in questo caso un TF, misurando la rotazione molecolare della molecola con etichetta. Legandosi a TF, sua velocità di rotazione diminuisce a causa della maggiore raggio idrodinamico e peso molecolare del complesso associato, che si traduce in FA maggiore. La misura esatta del legame molto forte (KD < ~ 1 nM) richiede l'utilizzo di basse concentrazioni di riferimento etichettato, DNA (c < ~ 1 nM). Questo è difficile da ottenere con uno strumento commerciale come un lettore di micropiastre standard. Inoltre, una differenza di grandi dimensioni (10-100 volte superiore) tra i complessi associati ed è di solito necessaria, che vieta di misurazione delle interazioni tra domini di legame di TF e brevi oligomeri del DNA, che sono in genere di più o meno simili pesi molecolari . Infine, una curva di titolazione completa normalmente richiede la preparazione e misurazione dei pozzi multipli contenenti una serie di concentrazione per le specie di titolazione.
Per risolvere questi problemi, usiamo un setup di microscopia widefield, modificato per ottenere alta sensibilità di rilevazione e consentono misurazioni FA alle z-posizioni diverse di un singolo pozzo. Questo permette di monitorare l'interazione di legame tra specie di simile peso molecolare e con alta affinità. Throughput più elevato si ottiene misurando FA in piastra Multi-ben formati e lo svolgimento di una serie di titolazione intero in un unico bene utilizzando un sistema di erogazione controllato (Figura 1a). Inoltre, impiegando un'analisi di legame competitivo, estraiamo non solo le costanti di associazione, ma anche la concentrazione di proteina attiva. Si tratta di una caratteristica importante del test, poiché solo una parte delle molecole espresse TF sono attivi a causa di degrado o di misfolding proteico. La messa a punto sperimentale si basa su un microscopio a epifluorescenza commerciale dotato di x-y - e Z-piezo stadi. Abbiamo aggiornato il sistema di eccitazione laser esterno, poi rilevato che i due emessi componenti di polarizzazione lineare sul chip di una telecamera EM-CCD con efficienza quantica alta per rilevamento della luce (Figura 1b e c 1). Il sistema utilizza un obiettivo di alta apertura numerica (NA) accoppiato ad un sensore ultra-sensibile e consente in tal modo misure FA altamente sensibili. Tramite la registrazione fluorescenza z-stack, associazione interazioni può essere misurata lungo l'asse ottico z quando si utilizza una matrice eterogenea per i reagenti. Tutte queste modifiche possono essere facilmente implementate su un sistema esistente e sono convenienti.
Ci avvaliamo di un saggio di legame competitivo in cui l'affinità di legame di un oligomero di DNA adenoida è misurato rispetto al DNA fluorescente contrassegnato, che funge da riferimento. TF e riferimento del DNA sono integrate alle concentrazioni fisse in una matrice di gel di agarosio poroso (poro dimensioni ~ 1 µm) che costituisce un ambiente non interagenti per l'associazione. Il riferimento DNA è etichettato con Cy5. Questo colorante ha dimostrato di essere particolarmente adatto per misurazioni FA a causa della sua durata di fluorescenza relativamente lungo (~ 1ns) e l'emissione di fluorescenza nella da' dello spettro visibile (priorità bassa bassa auto-fluorescenza). La concentrazione di TF è in eccesso molare sopra DNA Cy5-riferimento, assicurando che tutti i riferimento DNA è legato alle proteine. Una soluzione di adenoide concorrente del DNA viene quindi depositata sulla superficie del gel e si diffonde all'interno della matrice porosa, che istituisce un gradiente di concentrazione c (z, t) che cambia sopra il z-posizione del piano focale e tempo t (Figura 1una, Figura 2a-2 c). Il TF associato al DNA di Cy5-riferimento localmente è pertanto esposto a diverse concentrazioni del concorrente del DNA che compete per l'associazione, che conduce a una FA dinamicamente mutevole la Cy5-riferimento DNA FAREF(z, t) (Figura 2b e 2 c).
Per determinare il c(z,t) di concentrazione del concorrente, misuriamo in pozzetti separati (pozzi di calibrazione) la FA dinamicamente mutevole del segnale del Nilo blu (NB) FANB(z, t) (Figura 2una e 3). Questa tintura intercala nel DNA e quindi agisce come un sensore di DNA per il concorrente del DNA. Con questo sistema di erogazione controllato, decine o centinaia di differenti affinità di legame del DNA-proteina possono essere misurate all'interno di una piastra multi-pozzetto (formato piastra 96 o 384 pozzetti). Misurazione viene quindi eseguita in modo sequenziale fino a spostamento completo del riferimento con etichettato DNA da TF. Abbiamo determinato la specificità di legame per un dato fattore misurando le affinità di tutte le mutazioni del singolo-base di 3 N della sequenza consenso di lunghezza N. Anca-FA richiede basse quantità di proteina (~ pmols a curva di titolazione) e spettacoli bassa variabilità nella determinazione di KDs [coefficiente di variazione (CV) < 20%], consentendo misure su scala relativamente ampia. Il metodo può essere effettuato manualmente o completamente automatizzato usando un sistema robotizzato, con conseguente CVs ancora più basso (Figura 4, pannello superiore). Costanti di dissociazione sono misurate con alta precisione fino a 0,5 nM. Per affinità estremamente alta (KD < 500 pM), usiamo una titolazione standard competitiva (Figura 5) a causa di imprecisioni nella misurazione delle concentrazioni di DNA competitore a livelli bassi (< 100 nM).
Anca-FA può essere implementato su quasi qualsiasi standard, invertito, fluorescenti microscopio a epifluorescenza, fornito la disponibilità di un automatizzati XY-palcoscenico e una fase di z-axis di piezo. Componenti ottici sono stati costruiti intorno a un'installazione automatizzata widefield equipaggiata con un obiettivo a lunga distanza. In pratica, il dosaggio può essere adattato agli obiettivi con altre caratteristiche (in particolare lavoro, distanza e apertura numerica). Tuttavia, questo richiede l'ottimizzazione dei parametri (Distanze tra la z-fette, porosità e altezza del gel dell'agarosi, ecc.). È anche possibile l'uso di altri tipi di laser o macchina fotografica. Una descrizione dettagliata della intera procedura sperimentale e analisi dei dati è dato qui sotto nella sezione protocollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:915px;" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:183px;">Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16- / 18-bp DNA-oligomers</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nile Blue A</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">N5632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">655891</td>
			<td>175 &#181;m thick glass bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">384 Well Sensoplate, black</td>
			<td style="width:145px;">Greiner</td>
			<td style="width:245px;">788896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">A9414-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tween-20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:341px;">Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:145px;">Merck</td>
			<td style="width:245px;">1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Q-POD Element</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZMQSP0DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Millipak 40 Gamma Gold Filter</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>MPGL04GK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Milli-Q Integral 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Quantum TIX</td>
			<td style="width:145px;">Merck Millipore</td>
			<td>QTUMOTIX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:245px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mastercycler gradient</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:245px;">Z316083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.706.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tube 15 mL</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td>
			<td style="width:145px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:245px;">72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MICROSCOPY SETUP:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Automated widefield microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long distance objective</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">638 nm line continuous diode laser</td>
			<td>Omicron</td>
			<td>PHOxX 638-40, 40mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back-illuminated EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon DV897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichroic mirror</td>
			<td>AHF</td>
			<td>640nm cut-off</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bandpass filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td>ET bandpass 700/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linear polarizer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">LPVISC050-MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:245px;">BS010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Achromatic lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>200 mm focal length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Multimode optical fiber</td>
			<td>Optronis</td>
			<td>FVP600660710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ROBOTIC SYSTEM:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:341px;">Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek NXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">SOFTWARE:</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programming language</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Labview 9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Script for the HiP-FA software available at</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high sensitivity measurement of transcription factor-dna binding affinities by competitive titration using fluorescence microscopy

Quantificazione accurata del fattore di trascrizione (TF)-interazioni DNA è essenziale per la comprensione della regolazione dell'espressione genica. Poiché gli attuali approcci soffrono di limitazioni significative, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per determinare l'affinità di legame di TF-DNA con alta sensibilità su larga scala. Il test si basa sul principio di anisotropia (FA) stabilito fluorescenza ma introduce importanti miglioramenti tecnici. In primo luogo, si misura una curva di titolazione competitivo FA completa in un singolo pozzo incorporando un riferimento fluorescente contrassegnato del DNA in una matrice di gel di agarosio poroso e TF. Senza etichetta oligomero di DNA viene caricato sulla cima di un concorrente e, attraverso diffusione, forma un gradiente spazio-temporali. La pendenza risultante FA viene poi letto utilizzando una configurazione di microscopio epifluorescenza su misura. Questa installazione migliorata notevolmente aumenta la sensibilità di rilevamento del segnale FA, consentendo l'associazione sia debole e forte, da quantificare in modo affidabile, anche per le molecole di simili pesi molecolari. In questo modo, possiamo misurare una curva di titolazione per pozzetto di una piastra multi-pozzetto e attraverso una procedura di montaggio, possiamo estrarre sia la costante di dissociazione assoluta (KD) e la concentrazione di proteina attiva. Testando tutte le varianti di mutazione di punto singolo di un dato consenso vincolante sequenza, noi possiamo indagine il paesaggio di specificità di intera associazione di un TF, in genere su un singolo piatto. Le matrici di peso posizione risultante (PWM) sovraperformare quelli derivati da altri metodi nella predizione in vivo occupazione TF. Qui, presentiamo una guida dettagliata per l'implementazione dell'anca-FA su un microscopio fluorescente automatizzato convenzionale e la pipeline di analisi di dati.

Abbiamo applicato HiP-FA a TFs della segmentazione gene rete25,26, che genera il modello anteriore-posteriore corpo di embrioni della drosofila, in gran parte attraverso la regolazione trascrizionale. Da questa rete, abbiamo scelto la bZIP dominio TF gigante (Gt) per un'analisi dettagliata (Figura 4). Poiché fattori di trascrizione full-length sono difficili da esprimere e produrre per lo più le stesse preferenze di associazione come loro DNA associazione domini (DBD)13, abbiamo usato il DBD fuso a GST ed espresso il costrutto in proteine di fusione di e. coli GST per fornire gli stessi risultati come DBDs solo20.
La sequenza di consenso di Gt (unTTACGTAAC) rappresenta la sequenza di associazione più forte che abbiamo determinato come descritto sopra. Poi abbiamo studiato l'influenza sull'energia di legame di tutte le possibili mutazioni di singolo punto all'interno della sequenza di consenso Gt 10-mer (un totale di 30), affiancata da altre basi alle estremità 5' e 3'. Abbiamo misurato due repliche cui campioni di gel sono stati prodotti utilizzando l'automazione e una replica aggiuntiva prodotte manualmente per il confronto. KDs variavano da 0,6 a > 2000 nM per sequenze singolarmente mutati, e inoltre abbiamo confermato la completa mancanza di associazione a una sequenza di "vincolanti" (dati non mostrati).
Specificità di legame di TF-DNA sono in genere modellate utilizzando una matrice di peso posizione (PWM), in cui viene assegnato un punteggio per ogni nucleotide possibili in ogni posizione nel motivo dell'associazione. Il PWM si presuppone che ogni posizione contribuisce alla forza di associazione in modo indipendente e in molti casi costituisce un modello sufficiente per TF vincolanti preferenze27. Abbiamo generato riveduta PWM basato sulle nostre misure di affinità segue stabilito procedure28,29 e li hanno confrontati a due PWM precedentemente segnalati nella letteratura. Il primo è basato su conteggi di frequenza del nucleotide da associazione siti individuati da DNA footprinting4,5, e il secondo PWM è stato ottenuto da batterica monoibrido (B1H) selezione. 15
L'alta somiglianza di PWM per le tre repliche (Figura 4, pannello superiore), anche per il campione preparato manualmente (replica 3), dimostra l'alta riproducibilità del metodo HiP-FA. Mentre il PWM ottenuti da HiP-FA sono nel complesso simile a PWM ottenuti con altri metodi (Figura 4, pannello inferiore), ci sono deviazioni significative: posizione 2 (freccia nera), l'inizio del motivo bZIP core, mutazioni T > (G, C, A) portare a perdita totale dell'associazione nel motivo ottenuto da HiP-FA, che è coerenza con il motivo B1H ma non con quella ottenuta con footprinting DNasi, in cui l'associazione rimane relativamente forte per le basi (G, A). Al contrario, in posizione 7 (freccia grigia), la mutazione di T > C conduce a molto associazione più forte rispetto a quello che si aspettava basato sul PWM misurato in precedenza.
Altre deviazioni sono più sottili ma non meno importante. Nel complesso, il PWM HiP-FA è meno specifico rispetto agli altri due, che riflette il fatto che molte mutazioni dal consenso ancora provocano moderatamente forte legame. Questo può essere quantificato utilizzando il contenuto di informazioni (IC). L'IC è 11,5 bit per la matrice di anca-FA (media dei tre replicati), rispetto alla IC = 13,4 bit e bit 16,8 per il footprinting DNasi e matrici B1H, rispettivamente. In generale (anche se non universalmente), il PWM ottenuti da HiP-FA sono meno specifici di quelli ottenuti da altri metodi, basati su 26 TFs studiato20.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> Figura 1:rappresentazioni schematiche del anca-FA analisi e messa a punto sperimentale. (a) sistema di consegna gel per titolazione concorrente del DNA a singolo wells. (b) installazione di microscopia HIP-FA. Su misura automatizzata widefield microscopio con luce rilevazione della fluorescenza polarizzata su una fotocamera di EM-CCD. (c) Raw immagine di fluorescenza con le due regioni d'interesse utilizzato per determinare il parallelo (rosso) e il perpendicolarmente (verde) polarizzati componenti. (d) layout tipico di una piastra a 96 pozzetti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> Figura 2 : FA raw dati e curve di titolazione ricostruita. (a) tipica FA(z,t) traiettoria per una calibrazione contenente ben NB (b, c) Traiettorie di tempo fa(z,t) per due pozzi di titolazione misura vincolante per una forte (b) e la più moderata (c) DNA associazione concorrente. (d, e) Corrispondente ricostruito misure titolazione FA e montato le curve per il forte (d) e moderata (e) associazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> Figura 3 : Determinazione della concentrazione del DNA c concorrente (z, t) utilizzando il Nilo blu (NB). (a) curva di taratura FA-concentrazione per 16 oligomeri di coppie di basi del DNA. In una serie di titolazione convenzionale, NB è incorporato in gel di agarosio insieme a diverse concentrazioni di concorrente del DNA. L'affinità di NB al DNA è indipendente dalla sequenza20; di conseguenza, le stesse curve di calibrazione possono essere utilizzate per la determinazione di c (z, t) per diverse sequenze di DNA della stessa lunghezza. (b) profilo di diffusione del DNA tempo concorrente ad un'altezza di arbitrario z determinato utilizzando cinque pozzi di calibrazione. Per ogni ciclo di misura, la FAs medio di quattro pozzi contenenti NB vengono visualizzati come puntini bianchi. Le curve sono montate usando equazione 3 (linea bianca, singoli pozzetti in colore) e la c (z, t) a basse concentrazioni (C < ~ 100 nM) è determinata dalla curva estrapolata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> Figura 4 : Associazione delle specificità della famiglia dominio bZIP TF gigante (Gt). ANCA-FA PWM di tre repliche: due preparati utilizzando automazione e uno preparati manualmente (pannello superiore) vengono confrontati con PWM generato da dell'impronta della dnasi e dal metodo di selezione (B1H) monoibrido batterico (pannello inferiore). Nel complesso, i motivi che legano HIP-FA d'accordo con i dati precedenti ma anche mostrano differenze significative, come evidenziato con le frecce nere e grigie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> Figura 5 : Titolazione convenzionale competitivo con HIP-FA. (a) piastra design Mostra 8 DNA diverso concorrente in serie diluito in un tampone di associazione in una singola riga di una piastra a 96 pozzetti. Una mappa di calore FA è indicata per i punti di forza di associazione diversa arbitraria. (b) competitivo titolazione di tre concorrente DNAs vincolanti per il TF Bcd con diverse affinità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Qui vi presentiamo un nuovo metodo per la determinazione dell'affinità di legame all'equilibrio e in soluzione con alta sensibilità su larga scala. Questo migliora l'analisi quantitativa di associazione del DNA di fattore di trascrizione. Il metodo si basa su misure di anisotropia di fluorescenza automatizzato in un sistema controllato di consegna.

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Per migliorare la comprensione del legame fattore di trascrizione-DNA, abbiamo sviluppato un metodo per misurare le costanti di dissociazione su larga scala usando ad esempio misurazioni dell'anisotropia. Questa tecnica consente di ottenere automaticamente curve di titolazione complete per determinare la costante di dissociazione con alta sensibilità. Funziona in soluzione all'equilibrio, ha una produttività moderata e una vasta gamma dinamica.È stato applicato HiP-FA per perfezionare il panorama dell'affinità di associazione dei fattori di trascrizione. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere applicato ad altri tipi di eventi vincolanti come le interazioni proteina-proteina o proteina-farmaco, per esempio. Consiglio di eseguire prima più titolazioni con gli stessi partner di legame per ottenere una stima sulla riproducibilità delle misurazioni.Se disponibile, utilizzare un sistema automatizzato per una ridutbilità ancora migliore. Per ricotturare gli oligomeri di DNA del DNA di riferimento, mescolare sette microlitri di ogni dieci millimolare dietichettato in avanti e filamento inverso senza etichetta in un unico tubo. Per il DNA concorrente, mescolare 20 microlitri di ogni filamento non etichettato da 100 millimolari in due pozzi di una piastra PCR ben data 96.Quindi, utilizzare una macchina PCR standard per riscaldare le soluzioni di DNA a 70 gradi Celsius per i tre minuti. Quindi, ridurre a temperatura ambiente alla velocità di 0,1 gradi Celsius al secondo. Utilizzare un forno a microonde per sciogliere 0,5 grammi di agarosio in tampone leganti da 100 millilitri.Aggiungere acqua distillata doppia per regolare il volume finale per compensare la possibile evaporazione. Preparare dieci aliquote di magazzino millilitro. Per preparare i pozzi di titolazione e taratura di una piastra di 96 pozza, trasferire due aliquote di gel stock in uno shaker dell'incubatore Celsius di 75 gradi Celsius.Per ogni bene di titolazione, aggiungere 1,4 nanomoli di DNA di riferimento, proteina del fattore di trascrizione, ad una concentrazione finale di 20-60 nanomoli, 0,2 MTT millimolare e il tampone di legame a 240 microlitri del gel fuso. Mescolare accuratamente invertendo e scuotendo il tubo. Quindi, pipettare lentamente 200 microlitri per pozzo del gel contenente DNA nei pozzi di titolazione designati di una piastra di pozzo 96.Per ogni pozzo di calibrazione, aggiungere 5 nanomoli nilo colorante blu a 240 microlitri del gel fuso. Evitando bolle d'aria, pipettare lentamente 200 microlitri della soluzione di gel contenente colorante in cinque o sei pozzi della piastra del pozzo 96. Posizionare il gel su una superficie perfettamente orizzontale e incubare per dieci minuti a temperatura ambiente e altri 10 minuti a 4 gradi Celsius.Utilizzare un lettore di piastre multi-pozzo per verificare l'omogeneità dei livelli di altezza del gel in diversi pozzi della piastra. Per preparare la soluzione di DNA concorrente, combinare prima il DNA di riferimento etichettato, la proteina e il triplice tampone di legame concentrato. Quindi, mescolare 20 microlitri della soluzione con 40 microlitri di ciascuna delle soluzioni di DNA concorrenti ricotte.Per ogni pozzo di taratura, combinare le quantità appropriate di una delle soluzioni di DNA della concorrente ricottura e il tre volte tampone di legame concentrato contenente 15 millimolare soluzione di colorante blu nilo. Infine, aggiungere 50 microlitri delle soluzioni miste concorrenti sopra i gel il più simultaneamente possibile. Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, posizionare la piastra del pozzo 96 sullo stadio del microscopio.Quindi, prendi una serie di serie temporali di immagini Z-stack di pozzi fino a quando non completa disassociazione della proteina dal DNA di riferimento. Eseguire il saggio di titolazione secondo il manoscritto. Quindi utilizzare il software HiP-FA per creare curve di titolazione per singole sequenze concorrenti.Quindi, fare clic sul pulsante di esportazione per ottenere la costante di dissociazione e la concentrazione della proteina attiva in ogni bene di titolazione. Prestare particolare attenzione quando si tubazionano le soluzioni di gel viscose. La pipettazione imprecisa può ridurre la precisione per la determinazione delle costanti di dissociazione.In questo studio, il metodo HiP-FA viene applicato per determinare le preferenze di legame del DNA di un fattore di trascrizione con zip B. Gigante, dalla rete genica di segmentazione della mosca. L'elevata somiglianza delle PWM per le repliche preparate manualmente o utilizzando tecniche di automazione ha dimostrato l'elevata riproducibilità del metodo HiP-FA.Le PWM ottenute con questo metodo e altri metodi sono nel complesso simili. Tuttavia, deviazioni significative possono essere viste nelle posizioni due e sette del motivo centrale in cui le mutazioni possono portare a una completa perdita di legame o a un legame molto più forte rispetto alle misurazioni precedenti. Usiamo HiP-FA per generare perfezionamenti per le associazioni di decine di fattori di trascrizione e mostra che ottiene alla fine una migliore previsione dei dati.Crediamo che la sua misura di alta precisione possa essere molto utile per comprendere meglio il legame TF-DNA per tutto il sistema o per tutti i tipi di interazioni.

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Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fluorescenza della riflessione interna totale ad alto consumo e microscopia della ricostruzione ottica stocastica diretta utilizzando un chip fotonico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...