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November 14th, 2018
DOI :
November 14th, 2018
•0:04
Title
0:27
Identification and Cloning of Guide RNA Sequence
4:28
Designing and Generation of Repair Template
5:33
Transformation of C. albicans with Repair Template and Plasmid
7:47
Colony PCR
8:52
Results: Evaluation of Successful Genome Editing in C. albicans
9:27
Conclusion
Transcript
यह विधि आणविक स्तर पर कवक और स्तनधारियों के बीच मतभेदों को प्रकट करने में मदद कर सकती है। नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों की पहचान करने के लिए इस तरह के मतभेदों का लाभ उठाया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह क्लासिक समरूप पुनर्संयोजन तकनीकों की तुलना में सी एल्बिकान के जीनोम को अधिक कुशलता से संशोधित करता है।
गाइड आरएनए अनुक्रम की पहचान करने के लिए जहां स्टॉप कॉडन डाला जाएगा के करीब एक NGG पाम अनुक्रम की पहचान करें । यहां दिखाया गया है, सभी पाम दृश्यों TPK2, एक चक्रीय AMP kinase उत्प्रेरक उपइकांस के पहले १०० आधार जोड़े में पाया जाता है । फॉरवर्ड गाइड प्राइमर थ्री सीक्वेंस की पहचान करें।
यह अनुक्रम एक NGG पाम साइट के सीधे अपस्ट्रीम 20 कुर्सियां होगी और इसमें एक पंक्ति में पांच से अधिक टी शामिल नहीं होंगे । NGG के सीधे ऊपर के आधार पर बाएं क्लिक करें और कर्सर 20 कुर्सियां खींचें । इसके बाद प्राइमर जोड़ने के लिए प्राइमर टैब पर क्लिक करें।
अब रिवर्स गाइड प्राइमर थ्री सीक्वेंस की पहचान करें, जो फॉरवर्ड गाइड सीक्वेंस की तारीफ होगी। NGG के सीधे ऊपर के आधार पर चाटना छोड़ दिया और कर्सर 20 कुर्सियां खींचें । प्रत्येक प्राइमर के लिए प्राइमर जोड़ने के लिए प्राइमर टैब पर क्लिक करें।
प्राइमर पर सही क्लिक करें और कॉपी प्राइमर डेटा का चयन करें। दृश्यों को एक पाठ संपादन कार्यक्रम में चिपकाएं। क्लोनिंग की सुविधा के लिए आगे और रिवर्स गाइड ओलिगो के लिए ओवरहांग दृश्यों जोड़ें।
आगे गाइड प्राइमर तीन के पांच प्रमुख अंत करने के लिए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम ATTTG जोड़ें और आगे गाइड प्राइमर तीन के तीन प्रमुख छोर करने के लिए जी जोड़ें । अंत में, न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम AAAAC में रिवर्स गाइड प्राइमर तीन के पांच प्रमुख अंत करने के लिए और खरीद से पहले रिवर्स गाइड प्राइमर तीन के तीन प्रमुख अंत में सी जोड़ें । डाई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पीवी1524, 10x बफर, बीएस9बी1 और पानी को 50 माइक्रो लीटर में जोड़कर कैंडिडा अनुकूलित कैस9 अभिव्यक्ति वेक्टर का परीक्षण करें और 20 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
पाचन मिश्रण को कमरे के तापमान में ठंडा करें और ट्यूब के नीचे संघनन लाने के लिए 2348 बार जी पर 30 सेकंड के लिए स्पिन करें। पचा रीढ़ का इलाज करने के लिए, पाचन मिश्रण में बछड़े आंतों के फॉस्फेट का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। एक घंटे पहले के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया इनक्यूबेट ।
अब, फॉस्फोरिलेट और एनियल फॉरवर्ड गाइड प्राइमर थ्री और रिवर्स गाइड प्राइमर थ्री, उन्हें 10x T4 Ligase बफर, T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ और एक पीसीआर ट्यूब में पानी के साथ जोड़कर। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक दूसरी पीसीआर ट्यूब में 10x T4 लिगाज़ बफर, T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़, और आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी जोड़ें। एक थर्मोसाइकिलर में प्रतिक्रिया मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
अल्पाधिकार को एनील करने के लिए सबसे धीमी रैंप दर पर मिश्रण को 16 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। फिर एनील्ड ओलिगो मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अब पचा PV1524 में annealed ओलिगोस ligate।
पहली पीसीआर ट्यूब में, 10x T4 Ligase बफर, t4 डीएनए Ligase, annealed ओलिगो मिश्रण, पचा सीआईपी-शुद्ध प्लाज्मिड, और पानी एक 10 माइक्रोलीटर कुल मात्रा में जोड़ें । इसी तरह एनील्ड ओलिगो मिक्स के बजाय निगेटिव कंट्रोल मिक्स का इस्तेमाल करते हुए दूसरी पीसीआर ट्यूब तैयार करें। 30 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोसाइकिलर में दोनों ट्यूबों इनक्यूबेट, तो 10 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर, और अंत में 25 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत ।
लिगेशन के बाद, लिगेशन मिश्रण को रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं में बदल दें और फिर टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित प्लाज्मिड को शुद्ध और अनुक्रम करें। मरम्मत टेम्पलेट को डिजाइन करने के लिए, जीन अनुक्रम में बाएं क्लिक करके एक स्टॉप कोडन डालें और न्यूक्लियोटाइड्स डालें जो स्टॉप कोडन और प्रतिबंध पाचन साइट को एन्कोड करते हैं। बाएं क्लिक करें जहां उत्परिवर्तन किया जाएगा के नीचे 10 ठिकानों पर क्लिक करें और कर्सर ६० कुर्सियां ऊपर खींचें ।
प्राइमर जोड़ने के लिए प्राइमर टैब पर चाटना छोड़ दिया। इससे रिपेयर टेम्पलेट फॉरवर्ड थ्री जुड़ जाएगा। फिर बाएं क्लिक करें 10 कुर्सियां जहां उत्परिवर्तन किया जाएगा और कर्सर ६० कुर्सियां नीचे खींचें ।
प्राइमर जोड़ने के लिए प्राइमर टैब पर बाएं क्लिक करें। इससे रिपेयर टेम्पलेट रिवर्स थ्री जुड़ जाएगा। मरम्मत टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए, चार पीसीआर ट्यूबों में से प्रत्येक में मरम्मत टेम्पलेट फॉरवर्ड प्राइमर, मरम्मत टेम्पलेट रिवर्स प्राइमर, डिऑक्सी न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट, बफर, टैच पॉलीमरेज और पानी जोड़ें।
अब पीसीआर के 20 से 30 राउंड के बीच दौड़ लगाकर प्राइमर एक्सटेंशन करें। सही ढंग से क्लोन प्लाज्मिड को पचाने के लिए, प्लाज्मिड, 10x बफर, गोजातीय सीरम एल्बुमिन, केपीएन 1, सैक 1 और पानी को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कुल मात्रा में जोड़ें। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
इस बीच, यूरिडीन पूरक YPD में 25 डिग्री सेल्सियस पर C.albicans SC5314, जंगली प्रकार प्रोटोट्रोफ की एक रात संस्कृति हो जाना । संस्कृति को 600 नैनोमीटर या ओडी 600 से कम छह में ऑप्टिकल घनत्व में उगाएं। गोली पांच ओडी २३४८ बार जी पर पांच मिनट के लिए कताई द्वारा परिवर्तन प्रति कोशिकाओं की ६०० इकाइयों तो TE/लिथियम एसीटेट के १०० माइक्रोलीटर में गोली कोशिकाओं को निलंबित ।
अब, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए और क्रम में, फिर से निलंबित कोशिकाओं, उबला हुआ और जल्दी ठंडा सामन शुक्राणु डीएनए, प्लाज्मा पाचन, शुद्ध मरम्मत टेम्पलेट, और प्लेट बफर जोड़ें। एक ही तरीके से एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें, सिवाय पानी को बदलने वाले डीएनए के बराबर मात्रा में स्थानापन्न करने के लिए। रात भर परिवर्तनों को इनक्यूबेटिंग करने के बाद, गर्मी कोशिकाओं को 25 मिनट के लिए ४४ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखकर चक ।
एक बेंच टॉप अपकेंद्रित्र में 2348 बार जी पर पांच मिनट के लिए स्पिन करें और प्लेट मिश्रण सुपरनेट को हटा दें। फिर से उड़ीडीन पूरक वाईपीडी और अपकेंद्रित्र के एक मिलीलीटर जोड़कर एक बार धोएं। उरीडीन पूरक YPD के 0.1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित करने के बाद, रात भर 25 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम या शेखर पर निलंबन इनक्यूबेट।
अगले दिन, यूरिडीन सप्लीमेंट वाईपीडी पर कोशिकाओं को 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर nourseothricin के साथ प्लेट करें। कॉलोनियां दो से पांच दिनों में दिखाई देंगी और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित एकल कॉलोनियों के लिए लकीर बनाई जानी चाहिए । कॉलोनी पीसीआर करने के लिए, शुरू की गई प्रतिबंध साइट की स्ट्रीम के बारे में 200 बेस जोड़े के बारे में एक फॉरवर्ड चेक प्राइमर डिजाइन करें, साथ ही एक रिवर्स प्राइमर लगभग 300 बेस जोड़े डाउनस्ट्रीम।
फॉरवर्ड चेक प्राइमर के 03 माइक्रोलीटर, रिवर्स चेक प्राइमर के 0.3 माइक्रोलीटर, थर्मोस्टेबल पॉलीमरेज के 0.3 माइक्रोलीटर, डीएनटीपी के तीन माइक्रोलीटर, एक्सटीएसी बफर के तीन माइक्रोलीटर और एक ट्यूब में 23 माइक्रोलीटर पानी जोड़ें। फिर एक P10 पिपेट टिप का उपयोग करके मिश्रण में एक खमीर कॉलोनी के 0.25 माइक्रोलीटर जोड़ें और एगर को परेशान न करने का ख्याल रखें। पीसीआर द्वारा डीएनए को बढ़ाने के बाद, प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए जेल पर पीसीआर के पांच माइक्रोलीटर चलाएं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब के नीचे सेल मलबे गोली को परेशान न करें।
सी एल्बिकान में CRISPR मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाए गए हैं । C.Albicans गाइड RNAs और मरम्मत टेम्पलेट्स के साथ बदल दिया गया था जो सी.एल्बिकान टीपीके 2 को लक्षित करते हैं। एक EcoR1 प्रतिबंध पाचन साइट और मरम्मत टेम्पलेट में codons बंद पाम साइट को बाधित और सही म्यूटेंट के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा ।
कॉलोनी पीसीआर प्रतिबंध पाचन के बाद जल्दी से संपादित दृश्यों से जंगली प्रकार अलग करती है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पीवी1524 में क्लोन किए गए गाइड आरएनए की कई प्रतियों की जांच करना याद रखना महत्वपूर्ण है। चूंकि इससे जीनोम संपादन दक्षता कम होगी।
मत भूलना, C.Albicans एक BL2 रोगजनक है, और हमेशा जहां उचित प्रयोगशाला पोशाक और इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करते समय सभी सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें ।
Candida albicans के कुशल जीनोम इंजीनियरिंग रोगजनन और चिकित्सकीय के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम जल्दी और सही CRISPR का उपयोग कर सी albicans जीनोम को संपादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं बिंदु उत्परिवर्तनों, निवेशन, और विलोपन सहित आनुवंशिक संशोधनों की एक विस्तृत विविधता लागू करने की अनुमति देता है ।
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