Denna metod kan hjälpa till att avslöja skillnaderna mellan svampar och däggdjur på molekylär nivå. Sådana skillnader kan utnyttjas för att identifiera nya terapeutiska metoder. Den största fördelen med denna teknik är att den mer effektivt modifierar genomet av C.Albicans än klassiska homologa rekombinationstekniker.

För att identifiera guide RNA-sekvens identifiera en NGG PAM-sekvens nära där stopp-kodon kommer att införas. Visas här, är alla PAM sekvenser som finns i de första 100 baspar TPK2, en cyklisk AMP-kinas katalytisk underenhet. Identifiera den framåtriktat vägledaprimertre ordnar.

Denna sekvens kommer att vara 20 baser direkt uppströms en NGG PAM webbplats och kommer inte att innehålla mer än fem T:ar i rad. Vänsterklicka på basen direkt uppströms av NGG och dra markören 20 baser. Sedan, vänster klicka på primer fliken för att lägga till primer.

Nu, identifiera omvänd guide primer tre sekvens, som kommer att vara komplimangen till framåt guide sekvens. Vänster slicka på basen direkt uppströms NGG och dra markören 20 baser. För varje primer, vänster klicka på primer fliken för att lägga till primer.

Högerklicka på primern och välj kopiera primerdata. Klistra in sekvenserna i ett textredigeringsprogram. Lägg till överhängssekvenser för att vidarebefordra och omvända guide oligos för att underlätta kloning.

Lägg nukleotidsekvensen ATTTG till den fem främsta änden av den framåtriktade styrprimer tre och lägg till G i den tre främsta änden av den främre guideprimer tre. Slutligen, vid nukleotidsekvensen AAAAC till de fem främsta änden av den omvända guideprimer tre och lägg till C till de tre främsta slutet av omvänd guide primer tre innan du köper. Dye testa Candida optimerad cas9 uttryck vektor genom att lägga till pv1524, 10x buffert, bs9b1, och vatten till 50 mikro liter i en 1,5 milliliter rör och inkubera vid 55 grader Celsius i 20 minuter.

Kyl nedslutningsblandningen till rumstemperatur och snurra i 30 sekunder vid 2348 gånger G för att få kondens till botten av röret. Att fosfatas behandla den smälta ryggraden, tillsätt en mikroliter av Kalv Intestinal Phosphatase till matsmältningsblandningen. Inkubera reaktionen vid 37 grader Celsius i en timme innan.

Nu, fosforylera och glödg fram guide primer tre och omvänd guide primer tre, genom att kombinera dem med 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase, och vatten i ett PCR-rör. Lägg till 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase och Molecular Biology Grade Water till ett andra PCR-rör som en negativ kontroll. Inkubera reaktionsblandningarna i en Thermocycler vid 37 grader Celsius i 30 minuter, sedan vid 95 grader Celsius i 5 minuter.

Kyl blandningen i den långsammaste ramphastigheten till 16 grader Celsius för att glödga oligos. Sedan inkubera den glödgade oligo blandningen vid 4 grader Celsius. Nu ligate den glödgade oligos i röt PV1524.

I den första PCR-röret, tillsätt 10x T4 Ligase Buffert, t4 DNA Ligase, glödgad oligo mix, rötad CIP-behandlade renad plasmid, och vatten till en 10 microliter total volym. På samma sätt förbereda en andra PCR röret med hjälp av den negativa kontrollblandningen i stället för den glödgade oligo mix. Inkubera båda rören i en Thermocycler vid 16 grader Celsius i 30 minuter, sedan vid 65 grader Celsius i 10 minuter, och slutligen svalna till 25 grader Celsius.

Efter ligering, omvandla ligering blandningarna till kemiskt kompetenta celler och sedan rena och sekvens plasmiderna som beskrivs i textprotokollet. För att utforma reparationsmallen, sätt in ett stoppkodon genom att vänsterklicka i gensekvensen och lägga till nukleotider som kodar för en stop-kodon och begränsningss digestionsplats. Vänsterklicka 10 baser nedströms av var mutationen kommer att göras och dra markören 60 baser uppströms.

Vänster slicka på primer fliken för att lägga till primer. Detta kommer att lägga till reparationsmallen framåt tre. Sedan vänster klicka 10 baser uppströms där mutationen kommer att göras och dra markören 60 baser nedströms.

Vänsterklicka på primer-fliken för att lägga till primern. Detta kommer att lägga till reparationsmallen omvänd tre. För att generera reparationsmallen, lägga till reparation mall framåt primer, reparation mall omvänd primer, deoxynucleotide triphosphates, buffert, TACH polymeras och vatten till var och en av de fyra PCR-rör.

Nu utför primer förlängning genom att köra mellan 20 och 30 rundor av PCR. För att smälta de korrekt klonade plasmiderna, tillsätt plasmid, 10x Buffer, Bovine Serum Albumin, KPN 1, SAC 1, och vatten till 40 mikroliters totala volym i ett 1,5 milliliter rör. Inkubera vid 37 grader Celsius över natten.

Under tiden, odla en övernattning kultur av C.albicans SC5314, vild-typ prototroph, vid 25 grader Celsius i uridin kompletteras YPD. Odla kulturen till en optisk densitet vid 600 nanometer eller OD 600 på mindre än sex. Pellet fem OD 600 enheter av celler per omvandling genom att snurra i fem minuter på 2348 gånger G.Then upphäva pelleterade celler i 100 mikroliter te / litiumacetat.

Nu, till en 1,5 milliliter rör och i ordning, tillsätt åter upphängda celler, kokt och snabbt kyld lax spermier DNA, plasma matsmältningen, den renade reparation mall, och tallrik buffert. Förbered en negativ kontroll på samma sätt, förutom att ersätta vatten vid en volym som är lika med den omvandlande DNA. Efter inkubering omvandlingarna över natten, värme chuck cellerna genom att placera dem i en 44 grader Celsius vattenbad i 25 minuter.

Snurra i fem minuter vid 2348 gånger G i en bänkskiva centrifug och ta bort plattan blandningen supernatant. Tvätta en gång genom att lägga till en milliliter av Uridin Kompletterad YPD och centrifug igen. Efter att ha suspenderat cellerna i 0,1 milliliter av Uridin Kompletterad YPD, inkubera suspensionen på en rulltrumma eller shaker vid 25 grader Celsius över natten.

Nästa dag, platta cellerna på Uridin Kompletteras YPD med 200 mikrogram per milliliter nourseothricin. Kolonier kommer att dyka upp om två till fem dagar och bör vara streckade för enstaka kolonier enligt beskrivningen i textprotokollet. För att utföra koloni PCR, designa en framåt kontroll primer om 200 bas par upp ström av begränsningen webbplats som infördes, samt en omvänd primer cirka 300 baspar nedströms.

Lägg 0,3 mikroliter av framåt kontrollera primer, 0,3 mikroliter av omvänd kontrollera primer, 0,3 mikroliter av termostabil polymeras, tre mikroliter dNTP: s, tre mikroliter av XTAC buffert, och 23 mikroliter vatten till ett rör. Tillsätt sedan 0,25 mikroliter av en enda jästkoloni till blandningen med hjälp av en P10-pipettspets och var noga med att inte störa ager. Efter att ha förstärkt DNA genom PCR, kör fem mikroliter av PCR på gelen för att säkerställa förstärkning är framgångsrik, var noga med att inte störa cellen skräp pelleten i botten av röret.

Representativa resultat för CRISPR-medierad genomredigering i C.Albicans visas här. C.Albicans förvandlades med guide RNAs och mallar reparation som riktar C.Albicans TPK2. En EcoR1 begränsning matsmältningsplats och stoppa kodon i reparationsmallen störa PAM plats och underlätta screening för korrekta mutanter.

Colony PCR följt av begränsning matsmältningen snabbt skiljer vild typ från redigerade sekvenser. Medan du försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att kontrollera om flera kopior av guiden RNAs klonade i PV1524. Eftersom detta kommer att sänka genomet redigering effektivitet.

Glöm inte, C.Albicans är en BL2 patogen, och att alltid där lämpliga lab klädsel och följa alla säkerhetsrutiner medan du utför detta förfarande.

Summary

Explore More Videos