Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Mus blev behandlet humant i overensstemmelse med alle relevante offentlige retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr af National Institutes of Health og deres anvendelse blev godkendt til denne hele studiet ved University of Miami institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget (protokol 16-053).
1. forberedelse celler for infektion
<ol><li>Udbrede mus makrofag-lignende cellelinie RAW 264.7 i DMEM vævskultur media suppleret med 10% føtalt kalveserum (herefter benævnt DMEM/FCS) ved hjæl...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

På grund af sin hurtige og processive cellulær infektion program er Lm en ideel patogen at sonde cellulære aktiviteter, der påvirker infektion. En række vært faktorer er blevet identificeret, enten positivt eller negativt påvirker Lm cellulære infektion11,12,13,14. To sådanne vært faktorer karakteriseret i vores laboratorium, Perforin-2 og hæm reguleret Inhibitor (P...

Infektion-baserede eksperimentelle modeller er i sagens natur udfordrende på grund af deres afhængighed af start stat betingelserne for vært og patogen, de forskellige patogen infektion strategier og vanskeligheden ved at tillægge patogen og værtsinitierede processer baseret på resultater. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) er blevet en ideel patogen at sonde vært forsvar svar på grund af dens genetiske og mikrobiologiske sporbarhed, sin hurtige og processive cellulær infektion strategi og den relativt klart forholdet mellem dens cellulær - og organismens-niveau infektion fænotyper. Den cellulære infektion af Lm gennemløber fire særskilte faser1: (i) cellulære invasion, der afslutter hos Lm er indkapslet i en vacuole; (ii) Lm-instrueret opløsning af vacuole membran og frigivelse af Lm i cytosol; (iii) intracytosolic replikering; og (iv) fysiske penetration af plasma membran, som resulterer i enten infektionen direkte tilstødende celler (f.eks. i en epitelial ark) eller ensomme celler, frigivelse af Lm i det ekstracellulære miljø. Hver af disse faser er fremmet af specifikke Lm-kodet faktorer (benævnt "virulens faktorer"), når slettet, forårsage infektion defekter i cellulær og animalske modeller. Denne generelle infektion strategi har været selvstændigt udviklet sig af en række af de såkaldte 'kemi' patogener2.
Kolonidannende enhed (CFU) assays er bredt ansat til at evaluere både in vitro (dvs., cellulære) samt in vivo (dvs. organismens) infektion resultater. Ud over deres høj følsomhed, især for in vivo infektioner, give CFU assays en utvetydig udlæsning for patogenet invasion og intracellulære overlevelse/spredning. CFU assays har været flittigt brugt til at analysere både Lm og vært celle determinanter, der påvirker infektion. Så informativ som disse forudgående undersøgelser har været at analysere cellulære invasion og intracytosolic replikering, CFU assays har ikke, at bedst af vores viden, blevet brugt til at spore den fjerde fase af Lm infektion proces: cellulære undslippe. Her beskriver vi relativt simpel, hvordan cellulære udgangsveje (i det følgende benævnt 'opståen') kan overvåges ved CFU assay (samt ved flowcytometri) og Vis eksempler på hvordan både patogen - og host-kodet faktorer regulere denne fase af Lm infektion cyklus. Analyse af den terminale fase af cellulære Lm infektion cyklus kan gøre det muligt at identificere yderligere patogen og vært celle infektion-specifikke faktorer og aktiviteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Der er en række forskellige strategier bakterielle patogener ansætte til at overleve og formere sig en gang inde i den eukaryote celle. De såkaldte 'kemi' patogener (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisog Rickettsia spp.) få adgang til den inficerede celle cytosol af fysisk og enzymatisk nedværdigende primære vacuolar membranen. En gang i cytosol, disse patogener såvel formere sig som generere tilstrækkelig mekaniske kræfter at trænge igennem plasma membranen af cellen vært for at inficere nye celler. Her viser vi hvordan denne terminal trin af den cellulære infektion cyklus af L. monocytogenes (Lm) kan kvantificeres ved både kolonidannende enhed assays og flowcytometri og give eksempler på, hvordan både patogen - og host-kodet faktorer indvirkning dette proces. Vi også vise en tæt korrespondance af Lm infektion dynamikken i kulturperler celler inficeret in vitro- og dem af hepatiske celler, der stammer fra mus inficeret in vivo. Disse funktion-baserede assays er relativt simple og let kan skaleres til discovery-baserede høj overførselshastighed skærme for modulatorer af eukaryote cellefunktion.

Vurdering af patogenet og vært-kodet faktorer påvirker cellulære infektion rolle Bruger infektion betingelserne beskrevet ovenfor, er 0,15% af input vildtype Lm genoprettet efter 1,5 h Co inkubation med kulturperler makrofager (fig. 1A). I den efterfølgende 1,5 h Co inkubation (3 h efter infektion, hpi), der var en 4-fold stigning i nyttiggørelse af levedygtige Lm og fra 3 til 6 hpi var der en yderli...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Vi beskriver både in vitro- og in vivo infektion assays, der kan bruges til at analysere aktiviteterne i host-kodning faktorer.

Ved hjælp af en bakteriel patogen til sonden for cellulære og organismens-niveau vært svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Mikrobielle patogener, der replikerer intracellularly skal i sidste ende forlade den inficerede celle. Hvilket, sammenlignet med andre aspekter af vært patogen interaktioner er relativt understudy. Her beskriver vi teknikker til at analysere patogen efflux.Vi viser, hvordan relativt enkelt analyser kan bruges til enten at evaluere effektivitet eller karakterisere post-efflux patogener De generelle teknikker, der er beskrevet her, er bredt anvendelige, selv om specifikke patogenværtscellemodeller kan variere i kinetik, doser og eventuelt udlæste. Som ved oprettelsen af ethvert forsøgssystem er det vigtigt, at der etableres klare kontroller, som vil sikre, at der observeres ægte, biologiske processer i forsøgsprøver eller kohorter. Demonstration af proceduren vil være Petoria Gayle, en kandidat studerende fra mit laboratorium.Til at begynde med infektionen eksperiment, bruge en pipette til at tilføje 20 mikroliter af frisklavet Lm inoculum til brønde, med skålen lidt vippes og pipette spidsen omhyggeligt placeret i de overliggende medier. Undgå at røre ved væggene i brønden med pipetten spidsen. Pipetter forsigtigt indholdet af hver brønd for at sikre fuldstændig blanding.Pladen må ikke rystes eller vippes væsentligt for at undgå at sprede LM over brøndens vægge. Retur cellekultur parabol til 37 grader Celsius, fem procent kuldioxid inkubator. Brug betinget medie fra ikke-inficerede celler som fortyndingst til at forberede en 10 mikrogram pr. milliliter gentamicinopløsning.Ved 30 minutter efter infektion, forsigtigt tilføje 30 mikroliter af gentamicin opløsning i skålen for at nå en endelig koncentration af to-punkt-fem mikrogram per milliliter. Forsigtigt pipette indholdet af brønden til at blande og returnere cellekultur parabol til rugemaskinen. At høste, lidt vippe skålen og omhyggeligt bruge en pipette til at fjerne hele medierne fra brønden.Tilføj punkt-fem milliliter destilleret, sterilt vand til brønden. Efter 30 sekunder overføres det resulterende vandlysat til et 1-punkts-fem milliliter mikrocentrifugerør og vortex kraftigt i 10 sekunder. Der tilsættes firepunkts fem mikroliter og 50 mikroliter af vandlysatet til 450 mikroliter af destilleret, sterilt vand for at forberede de tidobbelte og hundredegange fortyndinger.Kort vortex for at sikre grundig blanding. Tilsæt 50 mikroliter af de oprindelige tidobbelte fortyndede og hundredegange fortyndede prøver på lysogene bouillon agar plader, og spredes ved hjælp af en plade spreder. At analysere for nye LM, udtrække 10 mikroliter af overliggende medier fra skålen og opdele det i to fem-mikroliter aliquots og mikro centrifuge rør.Der tilsættes fem mikroliter DMEM/FCS til en aliquot, og der tilsættes fem mikroliter DMEM/FCS, der indeholder fem mikroliter pr. milliliter gentamicin, til den anden aliquot som kontrol. Vent fem minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 90 mikroliter af destilleret sterilt vand til hver aliquot og vortex de to kraftigt i 10 sekunder.Derefter tilsættes 50 mikroliter af prøven på LB agar plader og spredes ved hjælp af en plade spreder. Pladerne opbevares i 37 grader celsius inkubator i to dage, før lmkolonierne optæller. Ved hjælp af en automatiseret celletæller justeres de forberedte, rå to-seks-fire-punkt-syv celler til koncentrationen af en gange 10 til den sjette celle pr. milliliter.Tilsæt en milliliter af prøven til brønde af en seks-godt væv kultur plade. Inficere cellerne med en forberedt Lm inoculum, svarende til en mangfoldighed af infektion på 50. På et-punkt-fem timer efter infektion, i en et-punkt-fem milliliter mikrocentrifuge rør fyldt med 500 mikroliter på fire procent PFA, indsamle medier fra det første sæt af brønde og placere røret på is.For at indsamle intracellulære Lm, tilsæt en milliliter destilleret, sterilt vand til hver brønd. Efter 60 sekunder overføres det resulterende vandlysat til et 1-punkts-fem milliliter mikrocentrifugerør med 500 mikroliter på fire procents PFA. Vortex røret kraftigt i 10 sekunder og læg det på is.For resterende brønde, fjerne medier og erstatte med en milliliter DMEM / FCS med fem-mikrogram per milliliter gentamicin at dræbe ekstracellulære Lm.Straks returnere skålen til inkubatoren. Efter 30 minutter fjernes mediet og udskiftes med DMEM/FCS uden gentamicin. Efter yderligere to og fire timer, indsamle medier i lysates for anden og tredje gang punkter i rørene og læg dem på is til at køle.Centrifuge rør ved 10,000 gange G i syv minutter. Brug en pipette, fjerne supernatant uden at forstyrre pellet. Tilføj farvning cocktail indeholder 50 mikroliter af fire-procent PFA og 15 mikroliter af falloskin i røret og bland at suspendere hver pellet.Inkuber rør i mørke ved fire grader Celsius i 20 minutter. Efter inkubation tilsættes en milliliter FACS-buffer til hvert rør og pipette op og ned for at blande. Spin rør i centrifugen ved 10,000 gange G i syv minutter.Fjern supernatant uden at forstyrre pellet. Til øjeblikkelig brug skal hver pellet suspenderes i 400 mikroliter af FAX-buffer. Hvis opbevaring til senere analyse, tilføje 200 mikroliter af FAX buffer og 200 mikroliter af fire procent PFA i røret og bland at suspendere.Brug af infektion betingelser i den korte behandling med antibiotika gentamicin at fjerne ikke-internaliseret Lm, nul-punkt-en-fem procent af wild-type Lm inddrives efter et-punkt-fem timers co-inkubation med dyrkede makrofager. I den efterfølgende co-inkubation var der en firedobling og syvpunkts-femdobling i genopretningen af levedygtige Lm, som udelukkende repræsenterer intracellulær spredning. Der blev observeret en sammenlignelig profil for Lm-stammen, der havde en hypervirulent prfA under den første infektion, men ikke mellem tre og seks HPI.Når prfA blev slettet fra Lm stammen, der er en efterfølgende reduktion i inddrivelse af stammen efter langvarig co-inkubation. Når gentamicin fjernes fra brøndene ved seks HPI, kan ekstracellulære LM påvises en time senere for både vildtype og hypervirulente prfA-stammer, men ikke for stammen med prfA slettet. Medier overlaying både uinficeret og inficerede makrofager indeholdt lys-spredning, bakterie-størrelse partikler.Men kun medier fra inficerede makrofager havde GFP positive signaler inden for størrelsen gating. En tidsafhængig stigning i udseendet af falloidin-positive Lm blev observeret med inficerede makrofager. Når plating ud makrofager i 48-godt væv kultur parabol, efterlade nogle brønde uden celler.Disse no-celle kontrol brønde behandles derefter nøjagtig det samme som de celleholdige brønde, med hensyn til tilsætning af patogenet, antibiotika osv. Svarende til de forsøg, der er vist i figur et og tre, patogen eller vært faktorer og eller små molekyler kan testes med hensyn til deres indvirkning på patogen cellulære efflux.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering af bakterielt toksin Inducerede Responses Brug af Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Den<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Undersøgelse Patogen og Host Bidrag til infektiøs colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Sekretion at undersøge Cellular Infektion med bakteriepatogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering af en permeabel membran Insert-baserede infektion System at studere virkningerne af udskilt bakterielle toksiner på pattedyrværtsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic drab Assay at vurdere immunologiske reaktioner mod bakterielle patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...