Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Muizen werden humaan behandeld overeenkomstig alle richtlijnen van de desbetreffende overheid voor de verzorging en gebruiken van proefdieren van het National Institutes of Health en het gebruik ervan werd goedgekeurd voor deze hele studie door de Universiteit van Miami institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité (protocol 16-053).
1. voorbereiding van de cellen voor infectie
<ol><li>Muis macrofaag-achtige cellijn RAW 264.7 in DMEM weefsel voedingsbodems aangevuld met 10% foetaal kalf...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

Vanwege zijn snelle en processive cellulaire infectie programma is Lm een ideale pathogen sonde van cellulaire activiteiten die van invloed zijn infectie. Een aantal gastheer factoren geïdentificeerd die positief dan wel negatief Lm cellulaire infectie11,12,13,14 beïnvloeden. Twee dergelijke gastheer factoren gekenmerkt in ons laboratorium, Perforine-2 en de Heem geregeld re...

Infectie-gebaseerde experimentele modellen zijn inherent uitdagend vanwege hun afhankelijkheid van de startende staat voorwaarden van de gastheer en ziekteverwekker, de verschillende pathogen infectie strategieën en de moeilijkheid van de toerekening van de pathogeen - en gastinstellingen gestuurde processen gebaseerd op de resultaten. De bacterie Listeria monocytogenes (Lm) is een ideale pathogen sonde host defense reacties vanwege haar genetische en microbiologische werkwillig, haar snelle en processive cellulaire infectie-strategie en de relatief duidelijk geworden relatie tussen de mobiele - en organismic-level infectie fenotypen. De cellulaire infectie van Lm verloopt via vier fasen1: (i) cellulaire invasie die wordt afgesloten met Lm worden omsloten binnen een vacuole; (ii) Lm-gestuurde ontbinding van de vacuole membraan en introductie van Lm in het cytosol; (iii) intracytosolic replicatie; en (iv) fysieke penetratie van het plasma-membraan dat in ofwel de infectie van de direct aangrenzende cellen (zoals in een epitheliale blad) of, in de eenzame cellen resulteert, introductie van Lm in de extracellulaire milieu. Elk van deze fasen worden gepromoot door specifieke Lm-gecodeerd factoren (hierna aangeduid als 'virulentiefactoren') die, wanneer verwijderd, infectie defecten veroorzaken in zowel cellulaire en dierlijke modellen. Deze algemene infectie strategie is onafhankelijk geëvolueerd door een aantal van de zogenaamde 'cytosolische' ziekteverwekkers2.
Kolonie-vormende eenheid (CFU) testen te evalueren zowel in vitro algemeen werkzaam zijn (dat wil zeggen, cellulaire) zo goed als in vivo (d.w.z. organismic) infectie resultaten. Naast hun hoge gevoeligheid, met name voor in vivo infecties, voorzien CFU assays in een duidelijke uitlezing pathogen invasie en intracellulair overleven/proliferatie. CFU testen zijn uitgebreid gebruikt voor het analyseren van zowel Lm en gastheer cel bepalende factoren die van invloed zijn infectie. Zo informatief als deze voorafgaande studies zijn geweest voor het analyseren van cellulaire invasie en intracytosolic replicatie, CFU testen hebben, tot de beste van onze kennis, niet gebruikt voor het bijhouden van de vierde fase van het proces van de infectie Lm : cellulaire ontsnappen. Hier beschrijven we relatief eenvoudig hoe cellulaire ontsnappingsvoorzieningen (hierna te noemen 'opkomst') kan worden gecontroleerd door CFU assay (en stroom cytometry) en Toon voorbeelden van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde regelen deze fase van de Lm infectie cyclus. De analyse van de terminale fase van de cellulaire Lm infectie cyclus kan maken het mogelijk om extra pathogenen en host cel infectie-specifieke factoren en activiteiten te identificeren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Er zijn een verscheidenheid van strategieën bacteriële pathogenen in dienst om te overleven en eenmaal binnen de eukaryote cel vermenigvuldigen. De zogenaamde 'cytosolische' pathogenen (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisen Rickettsia spp) toegang tot de geïnfecteerde cel cytosol door fysiek en enzymatisch verlaagt het primaire vacuolar membraan. Eenmaal in het cytosol, deze ziekteverwekkers zowel vermenigvuldigen als het genereren van voldoende mechanische krachten te doordringen van het plasma-membraan van de gastheercel om nieuwe cellen infecteren. Hier, laten we zien hoe deze terminal stap van de cellulaire infectie cyclus van L. monocytogenes (Lm) kunnen worden gekwantificeerd door zowel kolonie-vormende eenheid testen en stroom cytometry en voorbeelden geven van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde effect dit proces. We tonen ook een nauwe correspondentie van Lm infectie dynamiek van gekweekte cellen in vitro geïnfecteerd en die van de hepatische cellen afgeleid van muizen geïnfecteerd in vivo. Deze functie gebaseerde testen zijn relatief eenvoudig en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald voor ontdekking gebaseerde high-throughput schermen voor modulatoren van eukaryotische cel functie.

Beoordeling van de rol van pathogenen en host-gecodeerde factoren invloed van cellulaire infectie De voorwaarden van de infectie hierboven beschreven gebruiken, wordt 0,15% van de invoer van wild-type Lm hersteld na 1,5 uur van co incubatie met gekweekte macrofagen(Figuur 1). In de daaropvolgende 1,5 h co incubatietijd (3 h post infectie, hpi), was er een toename van de terugwinning van levensvatbare Lm 4...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Microbiële pathogenen die intracellulair repliceren, moeten uiteindelijk de geïnfecteerde cel verlaten. Die, in vergelijking met andere aspecten van gastheerpathogen interacties is relatief understudied. Hier beschrijven we technieken om pathogene efflux te analyseren.We laten zien hoe relatief eenvoudig testen kunnen worden gebruikt om de efflux-efficiëntie te evalueren of post-effluxpathogenen te karakteriseren De algemene hier beschreven technieken zijn breed toepasbaar, hoewel specifieke pathogene gastheercelmodellen kunnen verschillen in kinetiek, doseringen en eventueel uitlezingen. Zoals bij het opzetten van elk experimenteel systeem is het van essentieel belang dat er duidelijke controles worden vastgesteld die ervoor zorgen dat echte, biologische processen worden waargenomen in experimentele monsters of cohorten. Het aantonen van de procedure zal Petoria Gayle zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Om te beginnen met de infectie experiment, gebruik maken van een pipet om 20 microliters van de vers bereide Lm entmateriaal toe te voegen aan putten, met de schotel iets gekanteld en de pipet tip zorgvuldig geplaatst in de bovenbakkende media. Raak de wanden van de put niet aan met de pipetpunt. Voorzichtig pipette de inhoud van elke put om volledig mengen te garanderen.Schud of kantel de plaat niet om verspreiding van LM over de wanden van de put te voorkomen. Terugkeer cel cultuur schotel aan de 37 graden Celsius, vijf procent kooldioxide incubator. Gebruik geconditioneerde media van niet-geïnfecteerde cellen als verdunningsmiddel om een 10 microgram per milliliter gentamicine oplossing voor te bereiden.Voeg na 30 minuten na infectie voorzichtig 30 microliter van de gentamicine-oplossing toe aan de schotel om een uiteindelijke concentratie van twee-punt-vijf microgram per milliliter te bereiken. Voorzichtig pipette de inhoud van de put te mengen en terug te keren van de cel cultuur schotel naar de couveuse. Om te oogsten, lichtjes kantelen van de schotel en voorzichtig gebruik maken van een pipet om de hele media te verwijderen uit de put.Voeg punt-vijf milliliter gedistilleerd, steriel water aan de put. Breng na 30 seconden het resulterende waterlysaat gedurende 10 seconden krachtig over op een microcentrifugebuis van één punt en vortex. Voeg vier-punt-vijf microliter en 50 microliter van het water lysaat aan 450 microliter van gedestilleerd, steriel water om de tienvoudige en honderdvoudige verdunningen voor te bereiden.Kort vortex om een grondige mix te garanderen. Voeg 50 microliter van de originele tienvoudig verdunde en honderdvoudig verdunde monsters toe aan lysogeny bouillonplaten en verdeel met een plaatspreader. Om te testen voor opkomende LM, extract 10 microliter van de overlaying media uit de schotel en verdeel het in twee vijf-microliter aliquots en micro centrifuge buizen.Voeg vijf microliter van DMEM/ FCS toe aan een aliquot en voeg vijf microliter DMEM/FCS met vijf microliter per milliliter gentamicine toe aan de tweede aliquot als controle. Wacht vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 90 microliter gedestilleerd steriel water toe aan elk aliquot en vortex de twee krachtig gedurende 10 seconden.Voeg vervolgens 50 microliter van het monster op LB agar platen en verspreid met behulp van een plaatspreader. Bewaar de platen in 37 graden celsius incubator voor twee dagen voor het opsommen van Lm kolonies. Met behulp van een geautomatiseerde cel teller, pas de voorbereide, ruwe twee-zes-vier-punt-zeven cellen aan de concentratie van een keer 10 tot de zesde cellen-per-milliliter.Voeg een milliliter van het monster toe aan putten van een zes-goed weefselkweekplaat. Infecteer de cellen met een voorbereid Lm-entmateriaal, wat overeenkomt met een veelheid aan infectie van 50. Op een-punt-vijf uur na infectie, in een one-point-five milliliter microcentrifuge buis gevuld met 500 microliters van vier procent PFA, verzamelen media uit de eerste set van putten en plaats de buis op ijs.Om intracellulaire Lm te verzamelen, voeg een milliliter gedistilleerd, steriel water aan elke put. Breng na 60 seconden het resulterende waterlysaat over naar een microcentrifugebuis van één punt met 500 microliter van vier procent PFA. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden en plaats het op ijs.Voor de resterende putten, verwijder de media en vervang met een milliliter DMEM / FCS met vijf microgram per milliliter gentamicine te doden extracellulaire Lm.Prompt terug te keren naar de couveuse. Na 30 minuten, verwijder de media en vervang met DMEM / FCS zonder gentamicin. Na nog eens twee en vier uur, verzamelen media in lysates voor de tweede en derde keer punten in de buizen en leg ze op ijs om te koelen.Centrifuge buizen op 10.000 keer G gedurende zeven minuten. Verwijder met behulp van een pipet supernatant zonder de pellet te storen. Voeg kleuringcocktail met 50 microliters van vier procent PFA en 15 microliter phalloidin in de buis en meng om elke pellet op te schorten.Incubeerbuizen in het donker op vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Na incubatie, voeg een milliliter FACS buffer aan elke buis en pipet op en neer te mengen. Spinbuizen in de centrifuge op 10.000 keer G gedurende zeven minuten.Verwijder supernatant zonder de pellet te storen. Voor onmiddellijk gebruik, hang elke pellet in 400 microliter van FAX buffer. Als opslag voor latere analyse, voeg 200 microliter fax buffer en 200 microliters van vier procent PFA in de buis en meng op te schorten.Met behulp van de infectie voorwaarden in de korte behandeling met het antibioticum gentamicine te elimineren niet-geïnternaliseerde Lm, nul-punt-een-vijf procent van de wilde-type Lm wordt hersteld na een-punt-vijf uur co-incubatie met gekweekte macrofagen. In de daaropvolgende co-incubatie was er een verviervoudiging en zevenmaal vervijfvoudigde toename van het herstel van levensvatbare Lm, die uitsluitend intracellulaire proliferatie vertegenwoordigt. Vergelijkbaar profiel werd waargenomen voor de Lm stam met een hypervirulente prfA tijdens de eerste infectie, maar niet tussen de drie en zes HPI.Wanneer de prfA uit de Lm-stam is verwijderd, is er een daaropvolgende vermindering van het herstel van de stam na langdurige co-incubatie. Wanneer gentamicine wordt verwijderd uit de putten op zes HPI, extracellulaire Lm kan worden gedetecteerd een uur later voor zowel wilde en hypervirulente prfA stammen, maar niet voor de stam met prfA verwijderd. Media die zowel niet-geïnfecteerde als geïnfecteerde macrofagen overlays bevatten lichtverstrooiing, bacterie-sized fijnstof.Echter, alleen de media van geïnfecteerde macrofagen bezat GFP positieve signalen binnen de grootte gating. Een tijdafhankelijke toename van het uiterlijk van phalloïden-positieve Lm werd waargenomen met geïnfecteerde macrofagen. Bij het plating van de macrofagen in de 48-well weefsel cultuur schotel, laat een aantal putten zonder cellen.Deze no-cell controleputten worden dan precies hetzelfde behandeld als de celhoudende putten, in termen van de toevoeging van de ziekteverwekker, antibiotica, enz. Vergelijkbaar met de experimenten in figuren een en drie, kunnen pathogene of gastheerfactoren en of kleine moleculen worden getest op hun impact op pathogene cellulaire efflux.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasie van menselijke cellen door een bacteriële pathogenen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

De<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Een nauwkeurig pathogeen lever-en Terugwinningssysteem voor Muriene modellen van secundaire bacteriële pneumonie

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...