Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Souris ont été traitées avec humanité conformément à toutes les directives gouvernementales appropriées pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health et leur utilisation a été approuvées pour cet ensemble de l’étude par les soins animaux institutionnel de l’Université de Miami et le Comité de l’urbanisme (protocole 16-053).
1. préparer des cellules pour une Infection
<ol><li>Propager la lignée de macrophage-comme cellules ...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

En raison de son programme d’infection cellulaire rapide et processive, Lm est un pathogène idéal pour sonder les activités cellulaires qui ont une incidence de l’infection. Un certain nombre de facteurs de l’hôte ont été identifié qui soit positivement, soit négativement affecter Lm infection cellulaire11,12,13,14. Deux de ces facteurs caractérisés dans notre ...

Axée sur l’infection des modèles expérimentaux sont intrinsèquement difficiles en raison de leur dépendance sur les conditions initiales d’état de l’hôte et pathogène, les différentes stratégies d’infection pathogène et la difficulté d’attribuer pathogène et hôte-processus axés sur basé sur les résultats. La bactérie Listeria monocytogenes (Lm) est devenu un pathogène idéal pour sonder les réactions de défense de l’hôte en raison de sa traçabilité génétique et microbiologique, sa stratégie d’infection cellulaire rapide et processive et le relativement claire relation entre les phénotypes de ses niveaux cellulaires et organismique infection. L’infection cellulaire de Lm passe par quatre phases distinctes1: (i) invasion cellulaire qui se termine par Lm être enfermé dans une vacuole ; (ii) Lm-a ordonné la dissolution de la membrane de la vacuole et libération de Lm dans le cytosol ; (iii) réplication d’intracytosolic ; et (iv) la pénétration physique de la membrane plasmique qui entraîne soit l’infection des cellules directement adjacentes (par exemple dans une feuille épithéliale) ou, dans les cellules solitaires, libération de Lm dans le milieu extracellulaire. Chacune de ces phases sont promus par spécifique Lm-codé facteurs (appelés « facteurs de virulence ») qui, lors de la suppression, causer des infections congénitales chez modèles cellulaires et animaux. Cette stratégie d’infection générale a évolué indépendamment par un certain nombre des dits pathogènes « cytosolique »2.
Tests d’unité (CFU) formatrices sont largement utilisés pour évaluer les deux études in vitro (c.-à-d., cellulaire) ainsi qu’in vivo (c.-à-d. organismique) résultats infection. En plus de leur grande sensibilité, notamment pour les infections in vivo, UFC essais fournissent un affichage sans ambiguïté l’invasion de l’agent pathogène et survie intracellulaire/prolifération. CFU dosages ont été largement utilisées pour analyser fois Lm et hôte déterminants de cellules qui ont une incidence d’infection. Aussi instructif que ces études préalables ont été d’analyser l’invasion cellulaire et réplication intracytosolic, UFC dosages ont pas, au meilleur de notre connaissance, été utilisés pour suivre la quatrième phase du processus d’infection Lm : évasion cellulaire. Nous décrivons ici relativement simples moyens d’évacuation comment cellulaire (ci-après dénommée « émergence ») peuvent être contrôlés par dosage de l’UFC (ainsi que par cytométrie en flux) et voir l’exemples de comment ces deux facteurs encodés en agent pathogène et hôte réglementent cette phase de la Lm cycle d’infection. L’analyse de la phase terminale du cycle cellulaire Lm infection peut rendre possible d’identifier l’agent pathogène supplémentaire et des activités et des facteurs d’infection spécifique cellule hôte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Il existe une variété de stratégies de bactéries pathogènes emploient pour survivre et proliférer une fois à l’intérieur de la cellule eucaryote. Les pathogènes dits « cytosoliques » (monocytogenes de Listeria, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensiset Rickettsia SPP.) avoir accès dans le cytosol des cellules infectées par physiquement et par voie enzymatique dégrade la membrane vacuolaire primaire. Une fois dans le cytosol, ces agents pathogènes se multiplient tant que génèrent des forces mécaniques suffisantes pour pénétrer la membrane plasmique de la cellule hôte afin d’infecter de nouvelles cellules. Ici, nous montrons comment cette étape terminale du cycle cellulaire infection de L. monocytogenes (Lm) peut être quantifié par les dosages d’unité formant colonie et cytométrie en flux et donner des exemples de comment les deux effets de facteurs encodés en agent pathogène et hôte ceci processus. Nous montrons également une correspondance étroite de Lm dynamique de l’infection des cellules cultivées infectés in vitro et celles des cellules hépatiques provenant de souris infectés in vivo. Ces dosages selon les fonctions sont relativement simples et peuvent être facilement transposés pour écrans de haut débit basé sur la découverte de modulateurs de la fonction des cellules eucaryotes.

Évaluation du rôle de l’agent pathogène et l’hôte codé des facteurs ayant une incidence de l’infection cellulaire En utilisant les conditions de l’infection décrites ci-dessus, 0,15 % du type sauvage d’entrée Lm est récupéré après 1,5 h d’incubation co avec les macrophages (Figure 1A). Dans le h 1,5 subséquentes d’incubation co (3 h après l’infection, hpi), on observe une augmentation ...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Nous décrivons les deux tests in vitro et in vivo de l’infection qui peuvent être utilisés pour analyser les activités des facteurs de l’hôte-codage.

À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Les agents pathogènes microbiens qui se répliquent intracellulairement doivent éventuellement sortir de la cellule infectée. Ce qui, par rapport à d’autres aspects des interactions avec les pathogènes de l’hôte, est relativement sous-étudié. Ici, nous décrivons les techniques d’analyse des efflux pathogènes.Nous montrons comment des analyses relativement simples peuvent être employées pour évaluer l’efficacité d’efflux ou caractériser des agents pathogènes post-efflux Les techniques générales décrites ici sont largement applicables bien que les modèles spécifiques de cellules hôtes pathogènes puissent différer dans la cinétique, les dosages et peut-être les read-outs. Comme dans la mise en place de tout système expérimental, il est essentiel que des contrôles clairs soient établis pour s’assurer que des processus biologiques authentiques sont observés dans des échantillons ou des cohortes expérimentaux. Petoria Gayle, une étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer l’expérience d’infection, utilisez une pipette pour ajouter 20 microlitres de l’inoculum Lm fraîchement préparé aux puits, avec le plat légèrement incliné et la pointe pipette soigneusement placée dans le média qui s’en aille. Évitez de toucher les parois du puits avec la pointe de la pipette. Pipette doucement le contenu de chaque puits pour assurer un mélange complet.Ne secouez pas ou n’inclinez pas de façon significative la plaque pour éviter de répandre du LM sur les parois du puits. Retourner le plat de culture cellulaire à l’incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de cinq pour cent. Utilisez des supports conditionnés provenant de cellules non infectées comme diluant pour préparer une solution de gentamicine de 10 microgrammes par millilitre.À 30 minutes après l’infection, ajouter soigneusement 30 microlitres de la solution de gentamicine dans le plat pour atteindre une concentration finale de deux points cinq microgrammes par millilitre. Pipette doucement le contenu du puits pour mélanger et retourner le plat de culture cellulaire à l’incubateur. Pour récolter, inclinez légèrement le plat et utilisez soigneusement une pipette pour retirer tout le corps du puits.Ajouter des millilitres d’eau distillée stérile au puits. Après 30 secondes, transférer vigoureusement le lysate d’eau qui en résulte dans un tube de microcentrifugeuse d’un point cinq millilitres et vortex vigoureusement pendant 10 secondes. Ajouter quatre points cinq microlitres et 50 microlitres du lysate d’eau à 450 microlitres d’eau distillée et stérile pour préparer les dilutions décuplées et cent fois.Vortex brièvement pour assurer un mélange complet. Ajouter 50 microlitres des échantillons dilués et cent fois dilués d’origine sur des plaques d’agar de bouillon de lysogène, et étendre à l’aide d’un épéiste de plaques. Pour faire des analyses pour l’émergence de LM, extraire 10 microlitres des supports superposés du plat et le diviser en deux aliquots de cinq microlitres et tubes de micro centrifugeuse.Ajouter cinq microlitres de DMEM/FCS à un aliquot et ajouter cinq microlitres de DMEM/FCS contenant cinq microlitres par gentamicine millilitre au deuxième aliquot comme contrôle. Attendez cinq minutes à température ambiante. Ajouter 90 microlitres d’eau stérile distillée à chaque aliquot et vortex les deux vigoureusement pendant 10 secondes.Ajouter ensuite 50 microlitres de l’échantillon sur les plaques d’agar LB et étendre à l’aide d’un épéiste. Conserver les assiettes dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant deux jours avant d’énumérer les colonies de Lm. À l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, réglez les cellules préparées à deux six-quatre points sept brutes à la concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre.Ajouter un millilitre de l’échantillon aux puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Infecter les cellules avec un inoculum Lm préparé, correspondant à une multiplicité d’infection de 50. À un point cinq heures après l’infection, dans un tube de microcentrifugeuse d’un point cinq millilitres rempli de 500 microlitres de quatre pour cent de PFA, recueillir les médias de la première série de puits et placer le tube sur la glace.Pour recueillir lm intracellulaire, ajouter un millilitre d’eau distillée et stérile à chaque puits. Après 60 secondes, transférer le lysate d’eau résultant à un tube de microcentrifugeuse d’un point cinq millilitres avec 500 microlitres de PFA de quatre pour cent. Vortex le tube vigoureusement pendant 10 secondes et le placer sur la glace.Pour les puits restants, retirer les supports et les remplacer par un millilitre de DMEM/FCS par de cinq microgrammes par gentamicine millilitre pour tuer lm.Promptement retourner le plat à l’incubateur. Après 30 minutes, retirer les supports et les remplacer par du DMEM/FCS sans gentamicine. Après encore deux et quatre heures, recueillir les médias en lysates pour les deuxième et troisième points dans les tubes et les placer sur la glace pour se détendre.Tubes de centrifugeuse à 10 000 fois G pendant sept minutes. À l’aide d’une pipette, retirer le surnatant sans déranger la pastille. Ajouter le cocktail de coloration contenant 50 microlitres de PFA de quatre pour cent et 15 microlitres de phalloidin dans le tube et mélanger pour suspendre chaque granule.Incuber les tubes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, ajouter un millilitre de tampon FACS à chaque tube et pipette de haut en bas pour mélanger. Faire tourner les tubes dans la centrifugeuse à 10 000 fois G pendant sept minutes.Retirer le surnatant sans déranger la pastille. Pour une utilisation immédiate, suspendre chaque granulé dans 400 microlitres de tampon FAX. Si vous stockez pour une analyse ultérieure, ajouter 200 microlitres de tampon FAX et 200 microlitres de quatre pour cent PFA dans le tube et mélanger à suspendre.En utilisant les conditions d’infection dans le traitement bref avec la gentamicine antibiotique pour éliminer lm non intériorisé, zéro point-un-cinq pour cent du Lm de type sauvage est récupéré après un point-cinq heures de co-incubation avec des macrophages cultivés. Dans la co-incubation suivante, il y a eu une multiplication par quatre et sept points-quintuple dans le rétablissement de Lm viable, qui représentent exclusivement la prolifération intracellulaire. Profil comparable a été observé pour la souche Lm possédant un prfA hypervirulent pendant l’infection initiale, mais pas entre trois et six HPI.Lorsque le prfA a été supprimé de la souche Lm, il y a une réduction subséquente de la récupération de la souche après une co-incubation prolongée. Lorsque la gentamicine est retirée des puits à six HPI, lm extracellulaire peut être détecté une heure plus tard pour les souches prfA de type sauvage et hypervirulent, mais pas pour la souche avec prfA supprimé. Les macrophages non infectés et infectés par les médias contenaient des particules de la taille d’une bactérie qui se répandaient dans la lumière.Cependant, seuls les médias provenant de macrophages infectés possédaient des signaux positifs GFP dans la taille gating. Une augmentation temps-dépendante de l’aspect du Lm phalloidin-positif a été observée avec les macrophages infectés. Lors du placage des macrophages dans le plat de culture tissulaire de 48 puits, laissez certains puits sans cellules.Ces puits de contrôle sans cellule sont ensuite traités exactement de la même manière que les puits contenant des cellules, en termes d’ajout de l’agent pathogène, des antibiotiques, etc. pour s’assurer que les signaux expérimentaux dépendent de la présence de cellules hôtes. À l’semblable des expériences présentées dans les figures 1 et 3, les facteurs pathogènes ou hôtes et ou les petites molécules peuvent être testés quant à leur impact sur les efflux cellulaires pathogènes.

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