Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
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Mäuse wurden in Übereinstimmung mit allen zuständigen staatlichen Richtlinien für die Pflege menschlich behandelt und verwenden von Versuchstieren von den National Institutes of Health und deren Verwendung für die gesamte Studie von der University of Miami institutionelle Tierbetreuung genehmigt wurde und Use Committee (16-053-Protokoll).
1. vorbereiten Infektion Zellen
<ol><li>Propagieren Maus Makrophagen-ähnliche Zelllinie RAW 264,7 in DMEM Gewebe Kulturmedien mit 10 % fetalen Kälbe...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

Aufgrund seiner schnellen und prozessualen zelluläre Infektion Programm ist Lm eine ideale Erreger, zelluläre Aktivitäten zu erforschen, die Infektion auswirken. Eine Reihe von Host Faktoren wurden identifiziert, die entweder positiv oder negativ Lm zelluläre Infektion11,12,13,14 beeinflussen. Zwei solche host Faktoren gekennzeichnet, die in unserem Labor Perforin-2 und de...

Infektion-basierte experimentelle Modelle sind von Natur aus schwierig wegen ihrer Abhängigkeit von der Staat Startbedingungen der Host und Erreger, die verschiedenen Erreger Infektion Strategien und die Schwierigkeiten bei der Zuschreibung von Erreger und Wirt-gesteuerte Prozesse anhand der Ergebnisse. Das Bakterium Listeria Monocytogenes (Lm) ist eine ideale Erreger, Wirt Verteidigung Antworten wegen seine genetische und mikrobiologische Lenkbarkeit, seine schnelle und prozessualen zelluläre Infektion Strategie und relativ klar Sonde geworden. Beziehung zwischen der zellulären und organismische Ebene Infektion Phänotypen. Die zelluläre Infektion von Lm durchläuft vier Phasen1: (i) zellulären Invasion, die mit Lm wird eingeschlossen in einer Vakuole; schließt (Ii) Lm-Regie Auflösung der Vakuole Membran und Freisetzung von Lm in das Zytosol; (Iii) Intracytosolic Replikation; und (iv) körperliche Penetration der Plasmamembran, das ergibt sich entweder die Infektion der direkt benachbarten Zellen (z. B. in einem epithelialen Blatt) oder in einsamen Zellen, Freisetzung von Lm in das extrazelluläre Milieu. Jede dieser Phasen werden gefördert durch spezifische Lm-Faktoren (bezeichnet als "Virulenzfaktoren") kodiert, wenn gelöscht, verursachen Infektion Mängel in zellulären und tierischen Modellen. Diese Allgemeininfektion Strategie hat unabhängig von einer Reihe von sogenannten "cytosolischen" Krankheitserreger2entwickelt worden.
Koloniebildenden Einheit (KBE) Assays werden häufig eingesetzt, um sowohl in-vitro-bewerten (d. h. zellulären) als auch in vivo (d. h. Organismische) Infektion Ergebnisse. Neben ihrer hohen Empfindlichkeit, besonders für in-vivo-Infektionen bieten KBE-Assays eine eindeutige Anzeige für Erreger Invasion und intrazelluläre überleben/Verbreitung. KBE-Assays wurden ausgiebig zur Lm und Host Zelle Determinanten zu analysieren, die Infektion auswirken. So informativ, wie diese früheren Studien gewesen, zellulären Invasion und Intracytosolic Replikation zu analysieren, KBE-Assays nicht, nach bestem Wissen und Gewissen, wurden verwendet, um die vierte Phase des Lm -Infektion-Prozesses zu verfolgen: zelluläre entkommen. Hier beschreiben wir relativ einfach, wie zelluläre Fluchtwege (nachfolgend "Entstehung") lässt sich durch KBE-Assay (sowie durch Durchflusszytometrie) und zeigen Beispiele wie die beiden Erreger - und Host-codierte Faktoren regulieren diese Phase der Lm Infektionszyklus. Die Analyse der terminalen Phase des zellulären Lm -Infektionszyklus besteht dann die Möglichkeit, zusätzliche Erreger und Wirt Zelle Infektion-spezifische Faktoren und Aktivitäten zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Es gibt eine Vielzahl von Strategien, die bakterielle Krankheitserreger zu beschäftigen, um zu überleben und vermehren sich einmal im Inneren der eukaryotischen Zelle. Die so genannte "cytosolischen" Erreger (Listeria Monocytogenes, Shigella Flexneri Burkholderia Pseudomallei, Francisella Tularensisund Rickettsien spp.) erhalten Sie Zugriff auf die infizierte Zelle Zytosol durch physisch und enzymatisch erniedrigender die primäre Vacuolar-Membran. Einmal in das Zytosol, diese Erreger sowohl vermehren sowie generieren ausreichende mechanische Kräfte, die Plasmamembran der Wirtszelle zu durchdringen, um neue Zellen zu infizieren. Hier zeigen wir, wie dieses terminal Schritt von den zellulären Infektionszyklus von L. Monocytogenes (Lm) von koloniebildenden Einheit Assays und Durchflusszytometrie quantifiziert werden kann und geben Beispiele dafür, wie die beiden Erreger - und Host-codierte Faktoren Auswirkungen dieses Prozesses. Wir zeigen auch eine enge Übereinstimmung von Lm -Infektion Dynamik der kultivierten Zellen infiziert in-vitro- und denen der hepatischen Zellen aus Mäusen infiziert in-vivo. Diese Funktion basierende Assays sind relativ einfach und können leicht für Entdeckung-basierte Hochdurchsatz-Bildschirme für Modulatoren der eukaryotic Zelle Funktion skaliert werden.

Bewertung der Rolle von Erreger und Wirt-codierte Faktoren beeinflussen zellulären Infektion Mit den oben beschriebenen Infektionsbedingungen, 0,15 % von der Eingabe Wildtyp Lm erholte sich nach 1,5 h Co Inkubation mit kultivierten Makrophagen (Abb. 1A). In der anschließenden 1,5 h Co Inkubation (3 h Post Infektion, Hpi) gab es ein 4-facher Anstieg bei der Beitreibung von lebensfähigen Lm und von 3 bis...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Mikrobielle Pathogene, die sich intrazellulär replizieren, müssen schließlich die infizierte Zelle verlassen. Welche, im Vergleich zu anderen Aspekten der Wirt spathogen Wechselwirkungen ist relativ unterstudiert. Hier beschreiben wir Techniken zur Analyse der Pathogen-Effizienz.Wir zeigen, wie relativ einfach Assays verwendet werden können, um entweder die Effizienz der Effizienz zu bewerten oder Post-Efflux-Erreger zu charakterisieren Die hier beschriebenen allgemeinen Techniken sind allgemein anwendbar, obwohl sich spezifische Pathogen-Wirtszellmodelle in Kinetik, Dosierungen und möglicherweise Auslesungen unterscheiden können. Wie bei der Einrichtung eines Versuchssystems ist es von wesentlicher Bedeutung, dass klare Kontrollen eingeführt werden, die sicherstellen, dass echte, biologische Prozesse in Versuchsproben oder Kohorten beobachtet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Petoria Gayle, einer Studentin aus meinem Labor.Um mit dem Infektionsexperiment zu beginnen, verwenden Sie eine Pipette, um 20 Mikroliter des frisch zubereiteten Lm Inoculum zu Den Brunnen hinzuzufügen, wobei die Schale leicht geneigt und die Pipettenspitze sorgfältig in die darüber liegenden Medien gelegt wird. Vermeiden Sie es, die Wände des Brunnens mit der Pipettenspitze zu berühren. Den Inhalt jedes Brunnens vorsichtig pipette, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.Schütteln oder kippen Sie die Platte nicht, um zu vermeiden, dass LM über die Wände des Brunnens verteilt wird. Geben Sie die Zellkulturschale auf den 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator zurück. Verwenden Sie konditionierte Medien aus nicht infizierten Zellen als Verdünnungsmittel, um eine 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin-Lösung vorzubereiten.Nach 30 Minuten nach der Infektion 30 Mikroliter der Gentamicin-Lösung vorsichtig in die Schale geben, um eine endgültige Konzentration von zwei Punkt-fünf Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Den Inhalt des Brunnens sanft pipette, um die Zellkulturschale zu mischen und an den Inkubator zurückzugeben. Um zu ernten, leicht kippen Sie die Schale und verwenden Sie vorsichtig eine Pipette, um das gesamte Medium aus dem Brunnen zu entfernen.Fügen Sie Punkt-fünf Milliliter destilliertes, steriles Wasser in den Brunnen. Nach 30 Sekunden das resultierende Wasserlysat in ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und Wirbel kräftig für 10 Sekunden übertragen. Fügen Sie vier Punkt-fünf Mikroliter und 50 Mikroliter des Wasserlysats zu 450 Mikroliter destilliertes, steriles Wasser hinzu, um die zehn- und hundertfachen Verdünnungen vorzubereiten.Kurz Wirbel, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. 50 Mikroliter der ursprünglichen zehnfach verdünnten und hundertfach verdünnten Proben auf Lysogeny-Brühe-Agarplatten geben und mit einem Plattenstreuer verteilen. Um nach aufkommenden LM zu suchen, extrahieren Sie 10 Mikroliter der überlagernden Medien aus der Schale und teilen Sie sie in zwei Fünf-Mikroliter-Aliquots und Mikrozentrifugenröhren auf.Fügen Sie fünf Mikroliter DMEM/FCS zu einem Aliquot hinzu und fügen Sie dem zweiten Aliquot als Kontrolle fünf Mikroliter DMEM/FCS mit fünf Mikrolitern pro Milliliter Gentamicin hinzu. Warten Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 90 Mikroliter destilliertes steriles Wasser zu jedem Aliquot hinzu und wirbeln Sie die beiden 10 Sekunden lang kräftig aus.Dann 50 Mikroliter der Probe auf LB Agarplatten hinzufügen und mit einem Plattenstreuer verteilen. Bewahren Sie die Platten in 37 Grad Celsius Inkubator für zwei Tage auf, bevor Sie Lm-Kolonien aufzählen. Passen Sie mit einem automatisierten Zellzähler die vorbereiteten, rohen Zwei-Sechs-Punkte-Sieben-Zellen auf die Konzentration von ein mal 10 auf die sechste Zelle pro Milliliter an.Fügen Sie einen Milliliter der Probe zu den Brunnen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte hinzu. Infizieren Sie die Zellen mit einem vorbereiteten Lm-Inokulum, was einer Vielzahl von Infektionen von 50 entspricht. Bei einer Punkt-fünf Stunden nach der Infektion, in einem Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikroliter von vier Prozent PFA gefüllt, sammeln Medien aus dem ersten Satz von Brunnen und legen Sie die Röhre auf Eis.Um intrazelluläres Lm zu sammeln, fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter destilliertes, steriles Wasser hinzu. Übertragen Sie das resultierende Wasserlysat nach 60 Sekunden in ein Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikrolitern vierprozentigen PFA. Wirbeln Sie die Röhre 10 Sekunden lang kräftig an und legen Sie sie auf Eis.Für die verbleibenden Brunnen entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie mit einem Milliliter DMEM/FCS mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin, um extrazelluläres Lm zu töten. Nach 30 Minuten Medien entfernen und ohne Gentamicin durch DMEM/FCS ersetzen. Nach weiteren zwei und vier Stunden, sammeln Sie Medien in Lysaten für den zweiten und dritten Zeitpunkt in die Röhren und legen Sie sie auf Eis zu kühlen.Zentrifugenrohre bei 10.000 mal G für sieben Minuten. Entfernen Sie mit einer Pipette überstand, ohne das Pellet zu stören. Färbecocktail mit 50 Mikrolitern PFA und 15 Mikroliter Phalloidin in die Röhre geben und mischen, um jedes Pellet aufzuhängen.Röhren im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie jedem Rohr und jeder Pipette einen Milliliter FACS-Puffer nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen. Spin Rohre in der Zentrifuge bei 10.000 mal G für sieben Minuten.Entfernen Sie Überstand, ohne das Pellet zu stören. Für den sofortigen Gebrauch, setzen Sie jedes Pellet in 400 Mikroliter FAX Puffer. Wenn Sie für eine spätere Analyse speichern, fügen Sie 200 Mikroliter FAX-Puffer und 200 Mikroliter von vier Prozent PFA in die Röhre und mischen, um zu suspendieren.Mit den Infektionsbedingungen in der kurzen Behandlung mit dem Antibiotikum Gentamicin, um nicht-internalisiertes Lm zu beseitigen, wird Nullpunkt-ein-fünf Prozent des Wildtyps Lm nach einem Punkt-fünf Stunden Co-Inkubation mit kultivierten Makrophagen wiederhergestellt. In der anschließenden Ko-Inkubation gab es eine vervierfachte und sieben-punkte-verfünffachte Zunahme der Wiederherstellung von lebensfähigem Lm, die ausschließlich die intrazelluläre Proliferation darstellen. Vergleichbares Profil wurde für den Lm-Stamm beobachtet, der während der Erstinfektion einen hyperviruleenten PrfA besitzt, jedoch nicht zwischen drei und sechs HPI.Wenn die prfA aus dem Lm-Stamm gelöscht wurde, gibt es eine nachfolgende Verringerung der Erholung des Stammes nach längerer Ko-Inkubation. Wenn Gentamicin bei sechs HPI aus den Brunnen entfernt wird, kann extrazelluläres Lm eine Stunde später sowohl für Wildtyp- als auch für hypervirulenprfA-Stämme nachgewiesen werden, jedoch nicht für die Sorte mit gelöschtem prfA. Medien, die sowohl nicht infizierte als auch infizierte Makrophagen überlagerten, enthielten lichtstreuende, bakteriumgroße Partikel.Allerdings besaßen nur Medien aus infizierten Makrophagen GFP-positive Signale innerhalb der Größe gating. Eine zeitabhängige Zunahme des Auftretens von Phalloidin-positivem Lm wurde mit infizierten Makrophagen beobachtet. Beim Ausschichten der Makrophagen in der 48-Well-Gewebekulturschale lassen Sie einige Brunnen ohne Zellen.Diese no-cell Control-Brunnen werden dann genau so behandelt wie die zellhaltigen Brunnen, in Bezug auf die Zugabe des Erregers, Antibiotika usw., um sicherzustellen, dass experimentelle Signale von der Anwesenheit von Wirtszellen abhängig sind. Ähnlich wie in den Abbildungen eins und drei gezeigt, können Krankheitserreger oder Wirtsfaktoren oder kleine Moleküle auf ihre Auswirkungen auf den zellulären Exlux des Erregers getestet werden.

Research

JoVE Journal

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