Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

עכברים טופלו בצורה אנושית לפי כל ההנחיות המתאימות לטיפול ולא להשתמש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת השימוש בהם אושרה במחקר זה כולו על ידי אוניברסיטת מיאמי. טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדת שימוש (פרוטוקול 16-053).
1. מכינים את התאים לדלקת
<ol><li>הפץ שורת התאים מקרופאג ד...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

בשל תוכנית תהליכית וברכבות זיהום הסלולר שלה, Lm הוא פתוגן אידיאלי כדי לחקור את פעילות הסלולר להשפיע זיהום. זוהו מספר גורמים המארח, המשפיעות באופן חיובי או שלילי Lm זיהום הסלולר11,12,13,14. לארח שתיים כאלה גורמים מאופ...

זיהום מבוססי מודלים ניסיוניים הם מאתגר מיסודו בשל תלותם התנאים מדינת המוצא של המארח הפתוגן, את האסטרטגיות זיהום שונים של הפתוגן, ואת הקושי של ייחוס הפתוגן, המארח-מונחי תהליכים בהתבסס על תוצאות. החיידק ליסטריה (Lm) הפך פתוגן אידיאלי כדי לחקור את המארח ההגנה תגובות בגלל שלה גנטי, מיקרוביולוגי ללקוחות שלנו את האסטרטגיה מהיר ולא תהליכית זיהום הסלולר שלה, צלולים יחסית קשר בין פנוטיפים זיהום סלולרי-אורגניזם-ורמת שלה. זיהום הסלולר של Lm ממשיך דרך ארבעה שלבים ברורים1: (i) הפלישה הסלולר אשר מסכם עם Lm סגירות בתוך חלולית; (ii) Lm-בבימויו של התפרקות של קרום חלולית שחרורו של Lm לתוך ציטוזול; (iii) שכפול intracytosolic; חדירה פיזית (iv) של קרום פלזמה כי התוצאות גם זיהום של תאים סמוכים ישירות (כמו למשל גיליון אפיתל) או, בכל תאי בידוד, שחרורו של Lm לתוך חצרו חוץ-תאית. כל אחד משלבים אלה מקודמים על ידי ספציפי Lm-מקודד גורמים (המכונה 'הגורמים התקפה אלימה'), נמחק, לגרום למומים זיהום במודלים הסלולר והן בבעלי חיים. אסטרטגיה זו זיהום כללי התפתח באופן עצמאי על-ידי מספר של פתוגנים 'cytosolic' כביכול2.
המושבה יוצרי מבחני יחידה (CFU) מועסקים באופן נרחב כדי להעריך את שניהם במבחנה (קרי, סלולר) כמו גם ויוו (קרי, אורגניזם) תוצאות הזיהום. בנוסף את רגישותם גבוהה, במיוחד עבור זיהומים ויוו, מבחני CFU מספקים readout ברורה וחד משמעית של פתוגן פלישה והתפשטות תאיים הישרדות /. CFU מבחני היו בשימוש נרחב כדי לנתח גורמים תא באימות Lm ומארח, שמשפיעים על זיהום. מחקרים קודמים אלה להיות לנתח הפלישה הסלולר ושכפול intracytosolic אינפורמטיבי, CFU מבחני. לא, לפי מיטב ידיעתנו, השתמשו כדי לעקוב אחר השלב הרביעי של תהליך זיהום Lm : הבריחה הסלולר. כאן, אנו מתארים פשוטה יחסית ניתן לנטר אמצעי לבריחה איך הסלולר (ןלהל 'הופעתה') על ידי CFU assay (כמו גם על ידי cytometry זרימה), הצג דוגמאות איך שני גורמים הפתוגן, המארח-מקודד לווסת את השלב הזה של Lm מחזור זיהום. הניתוח של השלב מסוף של מחזור הסלולר של זיהום Lm עלולה להפוך את זה ניתן לזהות הפתוגן נוספים, גורמים ספציפיים זיהום תא מארח ופעילויות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

ישנם מגוון רחב של אסטרטגיות פתוגנים חיידקיים להעסיק כדי לשרוד להתרבות פעם אחת בתוך התא האיקריוטים. מה שנקרא 'cytosolic' פתוגנים (ליסטריה, שיגלה flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisו ריקטסיה spp.) לקבל גישה ציטוזול תא נגוע על-ידי enzymatically ופיזית משפילים קרום vacuolar הראשי. פעם אחת ציטוזול, פתוגנים אלה הן להתרבות כמו גם ליצור כוחות מספיקים מכני לחדור קרום פלזמה של התא המארח כדי להדביק תאים חדשים. . הנה, אנחנו מראים כיצד מסוף שלב של מחזור הסלולר זיהום של ל' monocytogenes (Lm) ניתן לכמת על ידי המושבה יוצרי יחידת מבחני והן cytometry זרימה, לתת דוגמאות איך שני השפעת גורמים הפתוגן, המארח-בקידוד זה תהליך. אנו גם מראים התכתבות קרוב של Lm הדינמיקה זיהום של תאים בתרבית נגוע במבחנה, אלה בתאי הכבד נגזר עכברים נגועים ויוו. אלה מבחני מבוססי פונקציה פשוטה יחסית, ניתן בקלות לשנות-מבוססות-גילוי מסכי תפוקה גבוהה עבור מאפננים של תפקוד התאים האיקריוטים.

הערכת תפקידה של פתוגן וגורמים מקודד מארח להשפיע על זיהום הסלולר שימוש בתנאים זיהום המתוארים לעיל, 0.15% פראי-סוג הקלט Lm הוא התאושש לאחר h 1.5 של דגירה שיתוף עם תרבותי מקרופאגים (איור 1א'). ב ה 1.5 עוקבות של שיתוף דגירה (3 h פוסט זיהום, מדד מח?...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

פתוגנים מיקרוביאליים המשכפלים תאית חייבים בסופו של דבר לצאת מהתא הנגוע. אשר, בהשוואה להיבטים אחרים של אינטראקציות פתוגן המארח הוא understudied יחסית. כאן, אנו מתארים טכניקות לניתוח שפעת פתוגן.אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ב- assays פשוט יחסית כדי להעריך יעילות efflux או לאפיין פתוגנים שלאחר efflux הטכניקות הכלליות המתוארות כאן ישימות באופן נרחב למרות מודלים ספציפיים תא מארח פתוגן עשויים להיות שונים קינטיקה, המינונים ואולי לקרוא החוצה. כמו בהקמת כל מערכת ניסיונית, חיוני שיקבעו בקרות ברורות שיבטיחו שתהליכים ביולוגיים אמיתיים ינצפיו בדגימות ניסיוניות או בקובות. הפגנת ההליך תהיה פטריה גייל, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בניסוי הזיהום, השתמשו ב-pipette כדי להוסיף 20 מיקרוליטרים של Lm inoculum שהוכן טרי ל הבאר, כאשר המנה מוטה מעט וקץ הפיפטי ממוקם בקפידה במדיה המוזלת. הימנע מנגיעה בקירות של באר עם קצה פיפטה. בעדינות pipette את התוכן של כל באר כדי להבטיח ערבוב מלא.אין לנער או להטות באופן משמעותי את הצלחת כדי למנוע הפצת LM על קירות הבירה. להחזיר את צלחת תרבות התא ל 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים פחמן דו חמצני אינקובטור. השתמש במדיה מותנה מתאים לא מודבקים כמו diluent להכין 10 מיקרוגרם לכל פתרון ג'נטמיצין מיליליטר.ב 30 דקות לאחר ההדבקה, בזהירות להוסיף 30 microliters של פתרון ג'נטמיצין לתוך המנה כדי להגיע לריכוז סופי של שתי נקודות חמש מיקרוגרם למיליליטר. בעדינות pipette את התוכן של הבאר לערבב ולהחזיר את צלחת תרבות התא לאנקובטור. כדי לקצור, מעט להטות את המנה בזהירות להשתמש פיפטה כדי להסיר את המדיה כולה מן הבאר.הוסף נקודה-חמישה מיליליטר של מים מזוקקים וסטריליים ל באר. לאחר 30 שניות, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate לצינור microcentrifuge נקודה אחת חמש מיליליטר ומערבולת במרץ במשך 10 שניות. הוסיפו 4-5 מיקרוליטרים ו-50 מיקרוליטרים של המים ליאזט ל-450 מיקרוליטרים של מים מזוקקים וסטריליים כדי להכין את הדילול פי עשרה ומאה.מערבולת בקצרה כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הדגימות המדוללים והמדוללים פי מאה המקוריים על צלחות אגר מרק ליסוגני, והתפשטו בעזרת מפזר צלחות. כדי להגיד על LM המתעוררים, לחלץ 10 microliters של מדיה כיסוי מן המנה ולחלק אותו לשני aliquots חמישה מיקרוליטר צינורות מיקרו צנטריפוגה.הוסף חמישה מיקרוליטרים של DMEM / FCS לאליקוט אחד והוסף חמישה מיקרוליטרים של DMEM / FCS המכילים חמישה מיקרוליטרים למיליליטר ג'נטמיצין לאליקוט השני כבקרה. חכה חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 90 מיקרוליטרים של מים סטריליים מזוקקים לכל אליטוט ומערבולת את השניים במרץ למשך 10 שניות.לאחר מכן להוסיף 50 microliters של המדגם על צלחות אגר LB ולהפיץ באמצעות מפזר צלחת. לאחסן את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך יומיים לפני ספירת מושבות Lm. באמצעות מונה תאים אוטומטי, התאם את התאים המוכנים, הגולמיים של 2-6-4 נקודות-7 לריכוז של פי 10 לתא השישי למיליליטר.הוסף מיליליטר אחד של המדגם ל בארות של צלחת תרבות רקמה שש בארות. להדביק את התאים עם inoculum Lm מוכן, המתאים ריבוי של זיהום של 50. בנקודה אחת וחמש שעות לאחר ההדבקה, בצינור מיקרוצנטריפוגה של נקודה אחת וחמישה מיליליטר מלא ב-500 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזי PFA, לאסוף מדיה מהסט הראשון של בארות ולה מניח את הצינור על קרח.כדי לאסוף Lm תאי, להוסיף מיליליטר אחד של מים מזוקקים, סטריליים לכל באר. לאחר 60 שניות, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate לצינור מיקרוצנטריפוגה נקודה אחת וחמישה מיליליטר עם 500 microliters של ארבעה אחוזים PFA. מערבולת הצינור במרץ במשך 10 שניות ולה מניחים אותו על קרח.עבור בארות שנותרו, להסיר מדיה ולהחליף עם מיליליטר אחד של DMEM / FCS עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר ג'נטמיצין להרוג Lm.Lm.מיד להחזיר את המנה לאנקובטור. לאחר 30 דקות, להסיר מדיה ולהחליף עם DMEM / FCS ללא ג'נטמיצין. אחרי עוד שעתיים וארבע שעות, אוספים את התקשורת ב"ליזטס" בפעם השנייה והשלישית לתוך הצינורות ומ מניחים אותם על קרח כדי לצנן.צינורות צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שבע דקות. באמצעות פיפטה, להסיר על טבעי מבלי להפריע גלולה. הוסף קוקטייל מכתים המכיל 50 microliters של ארבעה אחוזים PFA ו 15 microliters של פאלודין לתוך הצינור ומערבבים להשעות כל גלולה.צינורות דגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר FACS לכל צינור ופיגט למעלה ולמטה כדי לערבב. צינורות ספין בצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שבע דקות.הסר על-טבעי מבלי להפריע לכדור. לשימוש מיידי, השהה כל גלולה ב- 400 מיקרוליטרים של מאגר FAX. אם מאחסנים לניתוח מאוחר יותר, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר FAX ו-200 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזי PFA לצינור וערבבו כדי להשעות.באמצעות תנאי הזיהום בטיפול הקצר עם ג'נטמיצין אנטיביוטי לחסל Lm לא הפנימה, אפס נקודה אחת-1-5 אחוז של Lm מסוג פראי הוא התאושש לאחר נקודה אחת וחמש שעות של דגירה במשותף עם מקרופאגים מתורבתים. בה דגירה שותף לאחר מכן, חלה עלייה פי ארבעה ושבע נקודות וחמש בהתאוששות של Lm קיימא, אשר מייצגים באופן בלעדי התפשטות תאית. פרופיל דומה נצפתה עבור זן Lm בעל prfA היפר-ויראלי במהלך ההדבקה הראשונית, אך לא בין שלושה לשישה HPI.כאשר prfA נמחק מזן Lm, יש ירידה לאחר מכן בהתאוששות של הזן לאחר דגירה שותף ממושך. כאשר ג'נטמיצין מוסר מן בארות בשש HPI, Lm חוץ תאית ניתן לזהות שעה מאוחר יותר עבור שני סוג פראי וזנים prfA hypervirulent, אבל לא עבור המתח עם prfA נמחק. כיסוי מדיה הן מקרופאגים נגועים והן נגועים הכיל חומר חלקיקי מפוזר באור, בגודל חיידק.עם זאת, רק למדיה ממאקרופגים נגועים היו אותות חיוביים של GFP בתוך הגודל. עלייה תלוית זמן במראה של Lm חיובי פאלואידין נצפתה עם מקרופאגים נגועים. כאשר ציפוי את מקרופאגים בצלחת תרבות רקמות 48 היטב, להשאיר כמה בארות ללא תאים.בארות שליטה אלה ללא תאים מטופלות אז בדיוק כמו בארות המכילות תאים, במונחים של תוספת של פתוגן, אנטיביוטיקה, וכו 'כדי להבטיח כי אותות ניסיוניים תלויים בנוכחות של תאים מארחים. בדומה לניסויים המוצגים בנתונים 1 ו-3, ניתן לבדוק גורמים פתוגן או מארח או מולקולות קטנות באשר להשפעתם על שפעת תאית פתוגנית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

משלוח הפתוגן מדויק מערכת השחזור של מודלים Murine של דלקת ריאות משנית בקטריאלי

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...