Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
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चूहों देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए सभी उचित सरकारी दिशानिर्देशों के अनुसार humanely इलाज किया गया और उनके उपयोग मियामी विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देख?...

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	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

अपने तेजी से और processive सेलुलर संक्रमण कार्यक्रम के कारण, एल एम एक आदर्श रोगज़नक़ सेलुलर गतिविधियों है कि प्रभाव संक्रमण की जांच करने के लिए है । मेजबान कारकों की एक संख्या की पहचान की गई है कि या तो सकार...

संक्रमण आधारित प्रायोगिक मॉडल स्वाभाविक रूप से मेजबान और रोगज़नक़, विभिंन रोगज़नक़ संक्रमण रणनीतियों, और रोगज़नक़ के निस्बत की कठिनाई और मेजबान संचालित प्रक्रियाओं की शुरुआत राज्य की स्थिति पर उनकी निर्भरता के कारण चुनौतीपूर्ण है परिणामों के आधार पर । जीवाणु लिस्टिरिया monocytogenes (एल एम) एक आदर्श रोगज़नक़ की वजह से अपनी आनुवंशिक और सूक्ष्मजीवविज्ञानी tractability, अपनी तेजी से और processive सेलुलर संक्रमण रणनीति की मेजबानी की रक्षा प्रतिक्रियाओं जांच बन गया है, और अपेक्षाकृत स्पष्ट इसके सेलुलर-और जैविक स्तर के संक्रमण phenotypes के बीच संबंध । एल एम के सेलुलर संक्रमण चार अलग चरणों के माध्यम से आय1: (i) सेलुलर आक्रमण है कि एल एम के साथ समाप्त एक vacuole के भीतर संलग्न किया जा रहा है; (पप) एल-धानी झिल्ली के विघटन का निर्देश तथा एल एम एल को साइटोसोल में जारी करना; (iii) intracytosolic प्रतिकृति; और (iv) प्लाज्मा झिल्ली के शारीरिक प्रवेश कि या तो सीधे आसन्न कोशिकाओं के संक्रमण में परिणाम (जैसे एक उपकला पत्रक में के रूप में) या, एकांत कोशिकाओं में, एल एम के extracellular वातावरण में जारी. इन चरणों में से प्रत्येक विशिष्ट Lm-इनकोडिंग कारकों द्वारा पदोंनत कर रहे हैं (' के रूप में ' virulence कारकों को संदर्भित) कि, जब नष्ट कर दिया, दोनों सेलुलर और पशु मॉडल में संक्रमण दोष के कारण. इस सामांय संक्रमण रणनीति स्वतंत्र रूप से तथाकथित ' cytosolic रोगजनकों2के एक नंबर से विकसित किया गया है ।
कॉलोनी बनाने वाली इकाई (cfu) assays व्यापक रूप से विट्रो में दोनों का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित कर रहे हैं (यानी, सेलुलर) और साथ ही vivo में (यानी, जैविक) संक्रमण परिणाम. उनके उच्च संवेदनशीलता के अलावा, विशेष रूप से वीवो संक्रमण के लिए, cfu assays रोगज़नक़ आक्रमण और इंट्रासेलुलर अस्तित्व के लिए एक स्पष्ट readout प्रदान/ cfu assays बड़े पैमाने पर दोनों Lm और मेजबान सेल निर्धारकों कि प्रभाव संक्रमण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन पूर्व अध्ययनों के रूप में जानकारीपूर्ण के रूप में सेलुलर आक्रमण और intracytosolic प्रतिकृति का विश्लेषण किया गया है, cfu assays हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए नहीं है, Lm संक्रमण प्रक्रिया के चौथे चरण को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया: सेलुलर एस्केप. यहां, हम कैसे सेलुलर एस्केप के अपेक्षाकृत सरल साधनों का वर्णन (बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए ' उद्भव ') cfu परख द्वारा निगरानी की जा सकती है (के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रवाह cytometry) और कैसे दोनों रोगज़नक़ के उदाहरण दिखाने के और मेजबान-एनकोडेड कारकों एल एम के इस चरण को विनियमित संक्रमण चक्र । सेलुलर एल एम संक्रमण चक्र के टर्मिनल चरण का विश्लेषण यह संभव अतिरिक्त रोगज़नक़ और मेजबान सेल संक्रमण-विशिष्ट कारकों और गतिविधियों की पहचान करने के लिए कर सकते हैं.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

वहां रणनीतियों की एक किस्म है बैक्टीरियल रोगजनकों जीवित रहने के लिए और एक बार यूकार्योटिक कोशिका के अंदर पैदा करना रोजगार । तथाकथित ' साइटोसोलिक ' रोगजनकों (लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन, शिगेला फ्लेक्नेरी, बुर्खोल्डेरिया स्यूमोऐल्ली, फ्रांसेला तुलारेन्सिस, और रिक्केटसिया एसपीपी.) द्वारा संक्रमित कोशिका साइटोसोल तक पहुँच प्राप्त करना प्राथमिक धानी झिल्ली को शारीरिक और एंजाइमिक रूप से नीचा करना. cytosol में एक बार, इन रोगज़नक़ों दोनों के रूप में अच्छी तरह के रूप में पर्याप्त यांत्रिक बलों उत्पन्न करने के लिए मेजबान सेल के प्लाज्मा झिल्ली घुसना करने के लिए नई कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए पैदा करते हैं । यहां, हम बताते है कि कैसे एल monocytogenes के सेलुलर संक्रमण चक्र के इस टर्मिनल कदम (एलएम) दोनों कॉलोनी के गठन इकाई assays और प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है और कैसे दोनों रोगज़नक़ और मेजबान एनकोडेड कारकों के उदाहरण दे इस प्रभाव प्रक्रिया. हम यह भी एक करीबी पत्राचार में संवर्धित कोशिकाओं की सुसंस्कृत विट्रो में संक्रमित की गतिशीलता और उन हेपेटिक कोशिकाओं के उन चूहों से व्युत्पंन प्राप्त करने के लिए शो vivo में संक्रमित । ये समारोह आधारित assays अपेक्षाकृत सरल कर रहे है और आसानी से यूकर्योटिक सेल समारोह के नियन्त्रक के लिए खोज आधारित उच्च throughput स्क्रीन के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

सेलुलर संक्रमण को प्रभावित करने वाले रोगज़नक़ और मेजबान-एन्कोडेड कारकों की भूमिका का आकलन करना ऊपर वर्णित संक्रमण स्थितियों का उपयोग करते हुए, इनपुट वाइल्ड-टाइप Lm के ०.१५% को सु?...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

हम दोनों विट्रो में और vivo संक्रमण assays कि मेजबान के गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एंकोडिंग कारकों का वर्णन ।

सेलुलर और जैविक स्तर के मेजबान प्रतिक्रियाओं के लिए जांच करने के लिए एक जीवाणु रोगज़नक़ का उपयोग करना

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

माइक्रोबियल रोगजनक जो इंट्रासेलरली को दोहराते हैं, अंततः संक्रमित कोशिका से बाहर निकलना चाहिए। जो, जब मेजबान रोगजनक बातचीत के अन्य पहलुओं की तुलना में अपेक्षाकृत कम अध्ययन किया जाता है। यहां, हम रोगजनक efflux का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं।हम दिखाते हैं कि कैसे अपेक्षाकृत बस परख का उपयोग या तो efflux दक्षता का मूल्यांकन करने या पोस्ट-एफफ्लक्स रोगजनकों की विशेषता के लिए किया जा सकता है यहां वर्णित सामान्य तकनीकें मोटे तौर पर लागू होती हैं, हालांकि विशिष्ट रोगजनक मेजबान सेल मॉडल काइनेटिक्स, खुराक और संभवतः पढ़ने-आउट में भिन्न हो सकते हैं। किसी भी प्रायोगिक प्रणाली की स्थापना के रूप में, यह आवश्यक है कि स्पष्ट नियंत्रण स्थापित किए जाएं जो यह सुनिश्चित करेंगे कि प्रायोगिक नमूनों या साथियों में वास्तविक, जैविक प्रक्रियाओं का अवलोकन किया जाए । प्रक्रिया का प्रदर्शन पेटोरिया गेल, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा ।संक्रमण प्रयोग के साथ शुरू करने के लिए, कुओं में ताजा तैयार एलएम इनोकुलम के 20 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, पकवान थोड़ा झुका हुआ है और पिपेट टिप ध्यान से ओवरलाइंग मीडिया में रखा गया है। पिपेट टिप के साथ कुएं की दीवारों को छूने से बचें। पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक कुएं की सामग्री को धीरे-धीरे पिपेट करें।कुएं की दीवारों पर एलएम फैलने से बचने के लिए प्लेट को हिला या काफी झुकाएं न करें। ३७ डिग्री सेल्सियस, पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर के लिए सेल संस्कृति पकवान वापसी । 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर जेंटामिसिन समाधान तैयार करने के लिए कीटाणुरहित कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करें।संक्रमण के बाद 30 मिनट पर, ध्यान से डिश में gentamicin समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए दो सूत्री-पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । धीरे-धीरे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और इनक्यूबेटर के लिए सेल संस्कृति पकवान वापस करने के लिए सामग्री पिपेट। फसल करने के लिए, पकवान को थोड़ा झुकाएं और पूरे मीडिया को कुएं से हटाने के लिए ध्यान से एक पिपेट का उपयोग करें।प्वाइंट- पांच मिलीलीटर आसुत, बाँझ पानी कुएं में डालें। 30 सेकंड के बाद, परिणामस्वरूप पानी को एक बिंदु-पांच मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और भंवर को 10 सेकंड के लिए सख्ती से स्थानांतरित करें। पानी के चार-पांच माइक्रोलीटर और 50 माइक्रोलीटर डालकर 450 माइक्रोलीटर आसुत, बाँझ पानी को दस गुना और एक सौ गुना कमजोर करने के लिए तैयार करें।पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में भंवर। lysogeny शोरबा आगर प्लेटों पर मूल दस गुना पतला और एक सौ गुना पतला नमूनों के ५० माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक प्लेट स्प्रेडर का उपयोग कर फैल गया । उभरते एलएम के लिए परख करने के लिए, डिश से ओवरलेइंग मीडिया के 10 माइक्रोलीटर निकालें और इसे दो पांच माइक्रोलीटर एलिकोट्स और माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूबों में विभाजित करें।डीएमईएम/एफसीएस के पांच माइक्रोलीटर को एक एलिकोट में जोड़ें और डीएमईएम/एफसीएस के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें पांच माइक्रोलीटर प्रति मिलीलीटर जेंटामिसिन को नियंत्रण के रूप में दूसरे एलिकोट में शामिल किया गया है । कमरे के तापमान पर पांच मिनट रुको । प्रत्येक एलिकोट में आसुत बाँझ पानी के 90 माइक्रोलीटर जोड़ें और 10 सेकंड के लिए दोनों को सख्ती से भंवर करें।फिर एलबी आगर प्लेटों पर नमूने के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक प्लेट स्प्रेडर का उपयोग करके फैलें। एलएम कॉलोनियों की गणना करने से पहले दो दिन तक प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्टोर करें। एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके, तैयार, कच्चे दो-छह-चार-बिंदु-सात कोशिकाओं को छठी कोशिकाओं-प्रति-मिलीलीटर के लिए एक गुना 10 की एकाग्रता में समायोजित करें।एक छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के कुओं के लिए नमूना के एक मिलीलीटर जोड़ें । 50 के संक्रमण की बहुलता के अनुरूप एक तैयार एलएम इनोकुलम के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें। संक्रमण के बाद एक बिंदु-पांच घंटे में, चार प्रतिशत पीएफए के ५०० माइक्रोलीटर से भरी एक बिंदु-पांच मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, कुओं के पहले सेट से मीडिया एकत्र करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें ।इंट्रासेलुलर एलएम एकत्र करने के लिए, प्रत्येक कुएं में आसुत, बाँझ पानी का एक मिलीलीटर जोड़ें। 60 सेकंड के बाद, परिणामस्वरूप पानी को चार प्रतिशत पीएफए के 500 माइक्रोलीटर के साथ एक बिंदु-पांच मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। भंवर ट्यूब को 10 सेकंड तक सख्ती से रखें और इसे बर्फ पर रखें।शेष कुओं के लिए, मीडिया को हटा दें और डीएमईएम/एफसीएस के एक मिलीलीटर के साथ पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर gentamicin के साथ प्रति अतिरिक्त Lm. तुरंत इनक्यूबेटर को पकवान वापस करने के लिए बदलें । 30 मिनट के बाद, मीडिया को हटा दें और बिना जेंटामिसिन के डीएमईएम/एफसीएस से बदलें । एक और दो और चार घंटे के बाद, ट्यूबों में दूसरी और तीसरी बार अंक के लिए lysates में मीडिया इकट्ठा और उन्हें बर्फ पर जगह ठंडा करने के लिए ।सात मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज ट्यूब। एक पिपेट का उपयोग करके, गोली को परेशान किए बिना सुपरनैट को हटा दें। चार प्रतिशत पीएफए के 50 माइक्रोलीटर और ट्यूब में पीएलोडिन के 15 माइक्रोलीटर युक्त धुंधला कॉकटेल जोड़ें और प्रत्येक गोली को निलंबित करने के लिए मिश्रण करें।20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट ट्यूब। इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब में FACS बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। सात मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र में स्पिन ट्यूब।गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट निकालें। तत्काल उपयोग के लिए, फैक्स बफर के 400 माइक्रोलीटर में प्रत्येक गोली को निलंबित करें। यदि बाद में विश्लेषण के लिए भंडारण, फैक्स बफर के २०० माइक्रोलीटर और ट्यूब में चार प्रतिशत पीएफए के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें और निलंबित करने के लिए मिश्रण ।गैर-आंतरिक एलएम को खत्म करने के लिए एंटीबायोटिक जेंटामिसिन के साथ संक्षिप्त उपचार में संक्रमण की स्थिति का उपयोग करके, शून्य-बिंदु-एक-पांच प्रतिशत जंगली प्रकार के एलएम को सुसंस्कृत मैक्रोफेज के साथ सह-इनक्यूबेशन के एक बिंदु-पांच घंटे के बाद बरामद किया जाता है। बाद के सह-इनक्यूबेशन में, व्यवहार्य एलएम की वसूली में चार गुना और सात सूत्री-पांच गुना वृद्धि हुई, जो विशेष रूप से इंट्रासेलुलर प्रसार का प्रतिनिधित्व करता है । प्रारंभिक संक्रमण के दौरान हाइपरवायरुलेंट प्रिफा रखने वाले एलएम तनाव के लिए तुलनीय प्रोफ़ाइल देखी गई थी लेकिन तीन और छह एचपीआई के बीच नहीं।जब एलएम स्ट्रेन से पीआरएफए को हटाया गया तो लंबे समय तक सीओ इनक्यूबेशन के बाद स्ट्रेन की रिकवरी में बाद में कमी आई है। जब जेंटामिसिन को छह एचपीआई में कुओं से हटा दिया जाता है, तो एक्सट्रासेलुलर एलएम को एक घंटे बाद जंगली प्रकार और हाइपरवायरुलेंट प्रिफा उपभेदों दोनों के लिए पता लगाया जा सकता है, लेकिन प्रिफा के साथ तनाव के लिए नहीं हटाया जाता है। मीडिया ने असंक्रमित और संक्रमित मैक्रोफेज दोनों को ओवरलेइंग करने से हल्का बिखरने वाला, जीवाणु आकार का पार्टिकुलेट मैटर निहित था ।हालांकि, संक्रमित मैक्रोफेज से केवल मीडिया के पास आकार गेटिंग के भीतर GFP सकारात्मक संकेत थे। संक्रमित मैक्रोफेज के साथ फालोडिन-पॉजिटिव एलएम की उपस्थिति में एक समय पर निर्भर वृद्धि देखी गई। जब ४८-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान में मैक्रोफेज बाहर चढ़ाना, कोशिकाओं के बिना कुछ कुओं छोड़ दें ।इन नो-सेल नियंत्रण कुओं को तब कोशिका युक्त कुओं के समान माना जाता है, रोगजनक, एंटीबायोटिक्स आदि के अलावा यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रायोगिक संकेत मेजबान कोशिकाओं की उपस्थिति पर निर्भर हैं। आंकड़ों में दिखाए गए प्रयोगों के समान एक और तीन, रोगजनक या मेजबान कारक और या छोटे अणुओं को रोगजनक सेलुलर efflux पर उनके प्रभाव के रूप में परीक्षण किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

मानव कोशिकाओं के एक बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा आक्रमण

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

लंबे समय तक मेजबान रोगज़नक़ सहभागिता निस्र्पक के लिए EpiAirway मॉडल का उपयोग

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

बैक्टीरियल विष प्रेरित लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रतिक्रियाएँ की विज़ुअलाइज़ेशन

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

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<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; माउस मॉडल: अध्ययन संक्रामक बृहदांत्रशोथ पैथोजन और मेजबान योगदान

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

मेजबान पैथोजन प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता के लैंडस्केप विशेषताएँ एक तुलनात्मक दृष्टिकोण

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

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बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

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अलगाव साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त Phagosomes का

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

चूहों में मेजबान-रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं और वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

बैक्टीरियल रोगजनकों के खिलाफ Immunological प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए Opsonophagocytic हत्या परख

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया के Murine मॉडल के लिए एक सटीक रोगजनक वितरण और वसूली प्रणाली

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...