Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
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ケアのため、すべての適切な政府ガイドラインに従ってマウスが人道的扱われ、国立衛生研究所の実験動物の使用とその使用方法は、この全体の研究のためのマイアミ大学の制度上の動物の世話が承認されましたおよび使用委員会 (プロトコル 16 053)。
1. 感染症の細胞を準備
<ol><li>DMEM 培養培地 10% 牛胎児血清 (今後 DMEM/FCS と呼ばれる) でマウスのマクロファージ様細胞?...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

その迅速かつプロセッシブ細胞感染プログラムLm感染に影響を与える細胞の活動を調査する理想的な病原体です。ホストの要因の数が肯定的または否定的に影響を与えるLm細胞感染11,12,13,14に同定されています。2 つのような宿主因子研究室、パーフォリン 2 とヘム調節剤の特徴 (P2、?...

感染症に基づく実験的モデル、ホスト、そして病原体、様々 な病原体の感染戦略と病原体がホスト主導するプロセスに結び付ける難易度の開始状態への依存のために本質的に挑戦結果に基づきます。菌リステリア菌(Lm) の遺伝学的および微生物学的少ない、その迅速かつプロセッシブ細胞感染戦略と比較的明確なのためのに対する宿主の防御をプローブする理想的な病原体となっています。その携帯と生体レベルの感染症の表現型間の関係。Lmの細胞感染を通過 4 段階1: (i) Lm ; 液胞で囲まれた中で結んで細胞浸潤(ii) Lm-液胞膜の溶解と細胞質; にLmの放出を指示(iii) intracytosolic レプリケーションそして (iv) 膜結果直接隣接する細胞 (上皮シートなど) のどちらかの感染または孤独な細胞は細胞外の環境にLmのリリースの物理的な侵入。特定Lmによって促進される、これらの各フェーズ-要因 ('病原因子」と呼ばれる) をエンコードされたが、削除されると、原因の感染欠陥細胞と動物のモデル。この一般的な感染戦略されて独立して進化しているいわゆる '細胞' 病原体2の数によって。
コロニー形成単位 (CFU) 試金は体外の両方を評価するため利用されています (すなわち、細胞) 同様の in vivo (すなわち、,) 感染症の結果。生体内での感染症のために特に感度が高くに加えて CFU の試金は病原体の侵入と細胞の生存/増殖のため明確な読み出しを提供します。CFU アッセイは、感染に影響を与えるLmとホストの両方の細胞の要因を分析するため広く使用されています。これらの先行研究は細胞浸潤と intracytosolic レプリケーションを分析されている有益 CFU の試金、我々 の知識を最大限に使用されていないLm感染プロセスの第 4 段階を追跡する: 細胞エスケープ。ここでは、比較的単純な CFU の試金 (およびフローサイトメトリーによって) (以下、出現') 携帯の脱出の手段を監視ことができ、どのように両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の例を示す規制Lm のこの段階について述べる感染サイクル。携帯電話のLm感染サイクル ターミナル相の解析追加病原体および宿主細胞感染特異的因子と活動を識別することが可能になります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

細菌性病原体が存続し、かつて真核生物の細胞内増殖を採用戦略のさまざまながあります。いわゆる '細胞' 病原体 (リステリア菌赤痢菌、細菌病菌 pseudomallei、野兎病菌、リケッチア属) による感染細胞の細胞質へのアクセスします。物理的に、酵素によってプライマリの液胞膜を分解します。一度、細胞質でこれらの病原体増殖し同様両方新しい細胞を感染させるために宿主細胞の細胞膜を貫通する十分な機械的な力を生成します。ここで、菌、リステリア菌(Lm) の細胞感染サイクルのこの最終段階のコロニー形成単位アッセイとフローサイトメトリーにより定量化することができ、これ両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の影響の例を与える方法を紹介します。プロセス。また, Lm感染培養細胞動態の近い対応が生体外で感染しているし、感染肝細胞に由来するマウスの体内.これらの関数に基づく試金は比較的単純であり、真核生物細胞の機能の変調器のための高スループット画面の検出ベース容易に拡張できます。

病原体と感染細胞に影響を与えるホスト エンコード要因の役割を評価します。 上記の感染条件を使用して、入力の野生型Lmの 0.15% は 1.5 h 培養マクロファージ (図 1A) と共同の孵化の後回復します。共同インキュベーション (3 h ポスト感染、hpi) の後続の 1.5 h で実行可能なLmの回復で 4 倍の増加があったし...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

ホスト エンコード要因の活動を分析する使用ことができます両方生体外でそして生体内で感染の試金を記述します。

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

細胞内で複製する微生物病原体は、最終的に感染した細胞から出て行かなければならない。これは、宿主病原体相互作用の他の局面と比較すると、比較的研究が行われている。ここでは、病原体流出を解析する手法について述べている。我々は、比較的単純なアッセイを使用して流出効率を評価するか、またはポスト・エフラックス病原体を特徴付けることができる方法を示す ここで説明する一般的な技術は広く適用可能であるが、特定の病原体宿主細胞モデルは運動、用量、およびおそらく読み出しで異なる可能性がある。実験システムの設定と同様に、実験サンプルやコホートで本物の生物学的プロセスが確実に観察されるように明確な制御が確立することが不可欠です。手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるペトリア・ゲイルです。感染実験から始めるには、ピペットを使用して、準備したてのLm接種物の20マイクロリットルを井戸に加え、皿をわずかに傾け、ピペットチップを慎重に上の媒体に入れます。ピペットチップで井戸の壁に触れないようにしてください。完全な混合を確実にするために、各ウェルの内容物を穏やかにピペット。ウェルの壁にLMを広がらないように、プレートを揺らすか、または大幅に傾けないでください。細胞培養皿を摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターに戻す。希釈剤として未感染細胞からのコンディションされた培地を使用して、1ミリリットルのゲンタマイシン溶液あたり10マイクログラムを調製する。感染後30分で、1ミリリットル当たり2ポイント5マイクログラムの最終濃度に達するために、30マイクロリットルのゲンタマイシン溶液を皿に慎重に加える。ウェルの内容物を軽くピペットし、培養皿を培養液に還元します。収穫するには、皿を少し傾け、慎重に井戸からメディア全体を取り除くためにピペットを使用しています。蒸留された無菌水のポイント5ミリリットルを井戸に加えます。30秒後、得られた水を1ポイント5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、渦を10秒間激しく移動させます。4ポイント5マイクロリットルと50マイクロリットルの水溶出液を450マイクロリットルの蒸留された無菌水に加え、10倍および100倍の希釈液を調製します。徹底的な混合を確実にするために簡単に渦。元の10倍希釈したサンプルと100倍希釈したサンプルをリソゲニーブロス寒天プレートに50マイクロリットル加え、プレートスプレッダーを使用して広げます。新興LMのアッセイのために、皿から重ね合う媒体の10マイクロリットルを抽出し、2つの5マイクロリットルのアリコートおよびマイクロ遠心分離管に分ける。DMEM/FCSの5マイクロリットルを1つのアリコートに加え、ミリリットルゲンタマイシンあたり5マイクロリットルを含むDMEM/FCSの5マイクロリットルをコントロールとして2番目のアリコートに加えます。室温で5分待ちます。各アリコートに90マイクロリットルの蒸留無菌水を加え、2つを10秒間激しく渦液化します。LB寒天プレートにサンプル50マイクロリットルを加え、プレートスプレッダーを使用して広げます。Lmコロニーを列挙する前に、プレートを摂氏37度のインキュベーターで2日間保存します。自動セルカウンターを使用して、調製された生の2-6-4ポイント7細胞を10倍から6番目の細胞/ミリリットルの濃度に調整します。6ウェル組織培養プレートの井戸にサンプル1ミリリットルを加えます。50の感染の多重度に対応して、調製されたLm接種で細胞を感染させる。感染後1ポイント5時間で、PFA4%の500マイクロリットルで満たされた1点5ミリリットルマイクロ遠心チューブで、井戸の最初のセットから培地を収集し、チューブを氷の上に置く。細胞内Lmを収集するには、各井戸に蒸留された無菌水を1ミリリットル加えます。60秒後、得られた水のライセートを、4%PFAの500マイクロリットルの1ポイント5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。チューブを10秒間激しく渦を出し、氷の上に置きます。残りの井戸の場合は、培地を取り除き、1ミリリットルのDMEM/FCSを5マイクログラム/ミリリットルのジェンタマイシンで交換して細胞外Lmを殺します。30分後、メディアを取り外し、ゲンタマイシンなしでDMEM/FCSに交換してください。さらに2時間と4時間後、2回目と3回目のポイントをチューブにライセートしてメディアを収集し、氷の上に置いて冷やします。遠心管は10,000倍Gで7分間用いた。ピペットを使用して、ペレットを邪魔することなく上清を除去する。4%PFAの50マイクロリットルと15マイクロリットルのファロイジンを含む染色カクテルをチューブに加え、混合して各ペレットを懸濁します。暗闇の中でチューブを摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーションの後、各チューブにFACSバッファーの1ミリリットルを加え、ピペットを上下に加えて混合します。遠心分離機のスピンチューブを10,000倍Gで7分間回転させる。ペレットを邪魔することなく上清を除去します。すぐに使用するには、各ペレットを400マイクロリットルのFAXバッファにサスペンドします。後で分析するために保管する場合は、200マイクロリットルのFAXバッファと4%PFAの200マイクロリットルをチューブに加え、混合して中断します。抗生物質ジェンタマイシンによる短時間治療における感染条件を使用して非内在Lmを排除し、野生型Lmのゼロポイント-1-5%は、培養マクロファージとの共培養の1ポイント-5時間後に回収される。その後の共培養では、細胞内増殖のみを表す実行可能なLmの回収率が4倍、7ポイントの5倍の増加があった。初期感染時に過大性のprfAを有するLm株に対して同等のプロファイルが観察されたが、3〜6回のHPIの間では観察されなかった。prfAがLm株から削除されたとき、長期の共培養後の歪みの回収に続く減少がある。ゲンタマイシンが6つのHPIでウェルから取り除かれると、細胞外Lmは野生型および過毒性のprfA株の両方について1時間後に検出することができるが、prfAを有する株は削除されない。感染していないマクロファージと感染したマクロファージの両方を重ねたメディアには、光散乱、細菌サイズの粒子状物質が含まれていました。しかし、感染したマクロファージからの培地のみが、サイズの格言内にGFP陽性信号を有していた。フェロイジン陽性Lmの出現の時間依存性の増加は、感染したマクロファージで観察された。48ウェル組織培養皿でマクロファージをめっきする場合は、細胞なしでいくつかの井戸を残します。これらの非細胞制御井戸は、病原体、抗生物質などを加えて細胞含有ウェルとまったく同じように処理され、実験シグナルが宿主細胞の存在に依存することを保証する。図1および3に示す実験と同様に、病原体または宿主因子およびまたは小分子は、病原体細胞流出に対する影響について試験することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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