Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
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마우스는 치료에 대 한 모든 적절 한 정부 지침에 따라 고통 없이 치료 했다 하 고 사용의 실험실의 동물 건강의 국가 학회 및 그들의 사용 마이애미 대학 기관 동물 관리가 전체 연구에 대 한 승인 했다 그리고 사용 위원회 (프로토콜 16-053).
1. 감염에 대 한 셀을 준비합니다.
<ol><li>마우스 대 식 세포와 같은 세포 선 RAW 264.7 DMEM 조직 문화 미디어 10% 태아 종 아리 혈 청 (이제부?...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 프로그램 Lm 은 감염에 영향을 주는 세포 활동을 조사 하는 이상적인 병원 체. 호스트 요인의 수는 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 Lm 세포 감염11,12,,1314확인 되었습니다. 두 같은 Perforin 2와 헤 규제 억제제 우리의 실험실에서 특징 요소 호스...

감염-기반 실험 모델은 호스트와 병원 체, 다양 한 병원 체 감염 전략, 그리고 병원 체 및 호스트-기반 프로세스를 할당의 어려움의 시작 상태 조건에 그들의 의존 때문에 본질적으로 도전 결과 기반으로 합니다. Listeria monocytogenes (Lm) 박테리아의 유전과 미생물의 추적성, 그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 전략 및 상대적으로 분명 호스트 방어 응답을 이상적인 병원 체 되고있다 그것의 휴대 organismic-수준 감염 고기 사이의 관계. Lm 의 세포 감염 4 가지 단계1를 통해 진행: (i) 세포 침공 Lm 공포; 포함 되 고로 종결 (ii) Lm-공포 막의 해체 그리고 cytosol;에 Lm 의 릴리스 감독 (iii) intracytosolic 복제; 그리고 (iv)는 플라즈마 막 직접 인접 한 세포 (상피 시트 등)의 감염 또는, 독방 세포, extracellular 환경으로 Lm 의 출시의 물리적 침투. 이러한 단계의 각 특정 Lm에 의해 추진 됩니다-인코딩된 요소 ('독성 요인' 라고도 함), 삭제, 감염 결함 세포 및 동물 모델에서 발생할. 이 일반적인 감염 전략은 독립적으로 진화 되었습니다 아니라 소위 'cytosolic' 병원 체2의 숫자에 의해.
콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험 둘 다 생체 외에서 평가를 널리 고용 됩니다 (즉, 셀룰러) 뿐으로 vivo에서 (즉, organismic) 감염 결과. Vivo에서 감염에 대 한 특히 그들의 높은 감도 뿐만 아니라 분석 실험 CFU 병원 체 침입 및 세포내 생존/확산에 대 한 명확한 판독을 제공합니다. CFU 분석 광범위 하 게 영향을 미치는 감염 Lm 및 호스트 셀 결정 요인 분석에 사용 되었습니다. 이러한 사전 연구 분석 세포 침입과 intracytosolic 복제 하 왔다 유익한, CFU 분석 사용 되지 않은, 우리의 지식의 최선을 Lm 감염 과정의 4 단계를 추적 하: 셀룰러 탈출. 여기, 우리는 상대적으로 간단한 CFU 분석 결과 (물론 cytometry) ('출현' 라 함)는 어떻게 세포 탈출 수단을 모니터링할 수 있습니다 및 어떻게 두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요소의 표시 예 규제 Lm의이 단계 설명 감염 주기. 세포질 Lm 감염 사이클의 터미널 단계 분석 추가 병원 체 및 호스트 세포 감염 관련 요인 및 활동 파악 가능 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

세균성 병원 체 생존 하 고 한 번 진 핵 세포 안에 증식 고용 전략의 다양 한이 있다. 소위 'cytosolic' 병원 균 (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, 그리고 리케차 종)에 의해 감염 된 세포 cytosol에 액세스 육체적으로 그리고 효소 저하 기본 vacuolar 막. 일단, cytosol에서이 균 모두 증식 뿐 아니라 새로운 세포를 감염 하기 위하여 주인 세포의 원형질 막에 침투 하는 충분 한 기계적인 힘을 생성. 여기, 우리 보여 어떻게 L. monocytogenes (Lm)의 세포 감염 주기의이 터미널 단계 식민지 형성 단위 분석 및 cytometry 양이 정해질 수 있다이 어떻게 모두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요인 영향의 예를 들 프로세스입니다. 우리 또한 보여 쥐에서 파생 된 간 세포의 감염 및 배양된 세포의 Lm 감염 역학의 가까운 통신 감염 생체 외에서 vivo에서. 이러한 함수 기반 분석 실험은 상대적으로 간단 하 고 변조기의 진 핵 세포의 기능에 대 한 높은 처리 화면 검색 기반 쉽게 확장 될 수 있습니다.

병원 체와 세포 감염에 영향을 미치는 호스트 인코딩된 요인의 역할 평가 위에서 설명한 감염 조건 사용 하 여, 입력된 야생-타입 Lm 의 0.15%는 배양된 세포 (그림 1A)를 가진 공동 외피의 1.5 h 후 복구 됩니다. 공동 보육 (3 h 게시물 감염, hpi)의 후속 1.5 h에서 가능한 Lm 의 복구에 4-fold 증가 하 고 3 ~ 6 hpi 가능한 <em...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

세포내를 복제하는 미생물 병원균은 결국 감염된 세포를 빠져나가야 합니다. 어느, 숙주 병원체 상호 작용의 다른 양상에 비교될 때 상대적으로 과소 평가됩니다. 여기서는 병원균 의 효능을 분석하는 기술을 설명합니다.우리는 어떻게 상대적으로 간단한 분석이 efflux 효율성을 평가하거나 포스트 efflux 병원체를 특성화하기 위하여 이용될 수 있는지 보여줍니다 특정 병원체 호스트 세포 모형이 운동, 복용량 및 가능한 독서에서 다를 수 있더라도 여기에서 기술된 일반적인 기술은 광범위하게 적용됩니다. 모든 실험 시스템을 설정하는 것과 마찬가지로, 실험 샘플이나 코호트에서 진정한 생물학적 과정이 관찰되도록 명확한 제어가 확립되는 것이 필수적입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 페토리아 게일입니다.감염 실험으로 시작하려면 파이펫을 사용하여 새로 준비된 Lm 접종소 20 마이크로리터를 우물에 추가하고 접시가 약간 기울어지고 파이펫 팁이 중앙 미디어에 조심스럽게 배치됩니다. 파이펫 끝으로 우물의 벽을 만지지 마십시오. 각 웰의 내용물들을 부드럽게 피펫하여 완전한 혼합을 보장합니다.우물의 벽에 LM이 퍼지는 것을 피하기 위해 접시를 흔들거나 크게 기울이지 마십시오. 세포 배양 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터5%로 되돌려 보겠습니다. 감염되지 않은 세포에서 조건된 미디어를 희석제로 사용하여 밀리리터 젠타미신 용액당 10 마이크로그램을 준비하십시오.감염 후 30분 만에 젠타미킨 용액 30마이크로리터를 접시에 넣고 밀리리터당 2점-5마이크로그램의 최종 농도에 도달합니다. 웰의 내용물의 내용을 부드럽게 피펫하여 세포 배양 접시를 인큐베이터에 섞어 반품합니다. 수확하려면 접시를 약간 기울이고 파이펫을 사용하여 전체 미디어를 우물에서 제거합니다.증류된 멸균 물의 포인트 파이브 밀리리터를 우물에 넣습니다. 30초 후, 생성된 물을 1점-5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 10초 동안 적극적으로 소용돌이를 일으킵니다. 4점-5마이크로리터와 50마이크로리터의 소리터를 증류소, 멸균 수의 450마이크로리터에 추가하여 10배 의 희석제와 100배의 희석물을 준비합니다.철저한 혼합을 보장하기 위해 잠시 소용돌이. 원래 10배 의 마이크로리터 50개와 희석된 100배의 희석된 샘플을 리조제니 국물 한천 접시에 넣고 플레이트 스프레더를 사용하여 확산합니다. 신흥 LM에 대한 분석하기 위해 접시에서 오버레이 미디어의 10 마이크로 리터를 추출하고 두 개의 5 마이크로 리터 알리 쿼트와 마이크로 원심 분리 튜브로 나눕니다.DMEM/FCS 5마이크로리터를 하나의 알리쿼트에 추가하고 두 번째 알리쿼트에 밀리리터 젠타미신당 5마이크로리터를 포함하는 DMEM/FCS의 5마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 5분 간 기다립니다. 각 알리쿼트에 증류살균물 90마이크로리터를 넣고 10초 동안 두 마리를 적극적으로 소용돌이치게 합니다.그런 다음 LB 한천 플레이트에 50 마이크로리터를 추가하고 플레이트 스프레더를 사용하여 확산합니다. Lm 식민지를 열거하기 전에 이틀 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 보관하십시오. 자동화된 세포 카운터를 사용하여, 제조된 2-6-4점-7세포를 1회 10-밀리리터당 10분의 농도로 조정한다.6웰 조직 배양 플레이트의 우물에 샘플 1 밀리리터를 추가합니다. 50의 감염의 복합성에 대응하는 준비된 Lm 접종으로 세포를 감염시. 감염 후 1점-5시간 동안, 4%의 PFA의 500 마이크로리터로 채워진 1점-5 밀리리터 마이크로센티어 유역에서 첫 번째 우물 세트에서 미디어를 수집하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.세포 내 Lm을 수집하려면 각 우물에 증류된 멸균 수1 밀리리터를 추가하십시오. 60초 후, 생성된 물을 4%의 PFA 500 마이크로리터가 있는 1점-5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 튜브를 10초 동안 활발하게 소용돌이치며 얼음 위에 놓습니다.남아있는 우물의 경우, 미디어를 제거하고 세포 외 Lm을 죽일 밀리리터 젠타미신 당 5 마이크로 그램DMEM / FCS의 1 밀리 리터로 교체.즉시 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 30분 후, 미디어를 제거하고 젠타미신없이 DMEM /FCS로 교체하십시오. 또 다른 2 시간 및 4 시간 후, 튜브에 두 번째와 세 번째 시간 포인트에 대한 lysates에서 미디어를 수집하고 차가운 얼음에 배치합니다.원심 분리기 튜브는 7 분 동안 10, 000 배 G에서. 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 제거하십시오. 4%의 PFA 50 마이크로리터와 15마이크로리터의 페할로이드를 튜브에 넣고 혼합하여 각 펠릿을 중단합니다.어둠 속에서 튜브를 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 각 튜브에 FACS 버퍼 1밀리리터를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 원심분리기에서 7분 동안 10, 000배 G로 튜브를 회전시합니다.펠릿을 방해하지 않고 상류체를 제거합니다. 즉시 사용, 각 펠릿을 일시 중단 400 FAX 버퍼의 마이크로 리터. 이후 분석을 위해 저장하는 경우, 200 마이크로리터의 FAX 버퍼와 4%의 PFA의 200 마이크로리터를 튜브에 넣고 혼합하여 중단합니다.항생제 젠타미신과의 짧은 치료에서 감염 조건을 사용하여 비내화 Lm을 제거하고, 야생형 Lm의 제로포인트-1-5%는 배양 된 대식세포와 1점-5시간 의 공동 배양 후에 회수된다. 후속 공동 인큐베이션에서, 독점적으로 세포 내 증식을 나타내는 실행 가능한 Lm의 복구에 있는 4배 및 7점-5배 증가가 있었습니다. 비교 프로파일은 초기 감염 시 초반성 prfA를 소유하는 Lm 균주에 대해 관찰되었지만 3~6개의 HPI 사이에는 관찰되지 않았다.PrfA가 Lm 균주에서 삭제되었을 때, 장기간의 공동 배양 후 변형의 회복이 후속감소된다. 겐타미신이 6개의 HPI에서 우물에서 제거될 때, 세포외 Lm은 야생형 및 초유리성 prfA 균주 모두에 대해 1시간 후에 검출될 수 있지만, prfA를 가진 균주에 대해는 삭제되지 않습니다. 감염되지 않은 대식세포와 감염된 대식세포에 겹쳐지는 매체에는 광산염, 박테리아 크기의 미립자 물질이 포함되어 있습니다.그러나 감염된 대식세포에서 나온 매체만이 크기 게이팅 내에서 GFP 양성 신호를 소유했다. 감염된 대식세포로 는 phalloidin 양성 Lm의 외관에 있는 시간 의존적인 증가가 관찰되었습니다. 48웰 조직 배양 접시에서 대식세포를 도금할 때 세포없이 우물을 남겨 둡니다.이러한 세포 없는 대조유는 실험 신호가 숙주 세포의 존재에 의존하도록 병원균, 항생제 등의 첨가와 관련하여 세포 함유 우물과 정확히 동일하게 처리된다. 수치 1 및 3에서 나타난 실험과 유사하게 병원체 또는 숙주 인자 및 소분자는 병원균 세포 에 대한 영향에 대해 테스트할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...