Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Mus ble behandlet humant alle rette offentlige retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr for av National Institutes of Health og deres bruk ble godkjent for hele denne studien av University of Miami institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (protocol 16-053).
1. klargjør celler for infeksjon
<ol><li>Overføre musen macrophage som cellen linje rå 264.7 i DMEM vev kultur medier med 10% fosterets kalv serum (heretter referert til som DMEM/FCS) bruker en 125 mL kolbe og en vev ku...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

På grunn av sin raske og processive mobilnettet infeksjon program er Lm en ideell patogen å undersøke mobilnettet aktiviteter som påvirker infeksjon. En rekke vert faktorer har blitt identifisert som enten positivt eller negativt påvirker Lm , mobilnettet infeksjon,11,,12,,13,,14. To slike vert faktorer preget i vårt laboratorium, Perforin-2 og den Heme regulert Inhibito...

Infeksjon-baserte eksperimentelle modeller er iboende utfordrende på grunn av sin avhengighet av Start staten betingelsene for verten og patogen, ulike patogen infeksjon strategier og vanskelighetene med å tildele patogen - og vert-drevet prosesser basert på resultater. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) har blitt en ideell patogen å undersøke vert forsvar svar på grunn av sin genetiske og mikrobiologiske tractability sin raske og processive mobilnettet infeksjon strategi og den relativt klart forholdet mellom sin mobil - og organismic-nivå infeksjon fenotyper. Mobilnettet infeksjon av Lm går gjennom fire distinkte faser1: (i) mobilnettet invasjonen som konkluderer med Lm blir satt i en vacuole; (ii) Lm-oppløsningen av vacuole membranen og utgivelsen av Lm til stoffer; (iii) intracytosolic replikering; og (iv) fysiske penetrasjon av plasma membranen som resulterer i en infeksjon av direkte tilstøtende celler (for eksempel i en epithelial ark) eller i ensom celler, utgivelsen av Lm til ekstracellulære miljøet. Hver av disse fasene er markedsført av bestemte Lm-kodet faktorer (referert til som "virulens faktorer") som, når slettet, forårsake infeksjon defekter i både mobilnettet og dyr modeller. Denne generelle infeksjon strategien er uavhengig utviklet seg av en rekke den såkalte 'cytosolic' patogener2.
Colony-forming unit (CFU) analyser er viden ansatt å vurdere både i vitro (dvs. mobilnettet) så vel som i vivo (dvs. organismic) infeksjon resultater. I tillegg til deres høy følsomhet, spesielt for i vivo infeksjoner, gir CFU analyser en entydig avlesning patogen invasjon og intracellulær overlevelse/spredning. CFU analyser har vært mye brukt til å analysere både Lm og verten celle faktorer som påvirker infeksjon. Så informativ som disse tidligere studier har vært å analysere mobilnettet invasjon og intracytosolic replikering, CFU analyser ikke, til best av vår kunnskap, er brukt til å spore den fjerde fasen av Lm infeksjon: cellular flukt. Her beskriver vi relativt enkel hvordan mobil fluktmuligheter (heretter kalt "fremveksten") kan overvåkes CFU analysen (og flowcytometri) og viser eksempler på hvordan både patogen - og vert-kodet faktorer regulere denne fasen av Lm infeksjon syklus. Analyse av terminalen fasen av mobilnettet Lm infeksjon syklusen kan gjøre det mulig å identifisere flere patogen og verten celle infeksjon-spesifikke faktorer og aktiviteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Det er en rekke strategier bakteriell patogener ansette å overleve og sprer en gang innenfor den eukaryote cellen. Den såkalte 'cytosolic' patogen (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, stokk pseudomallei, Francisella tularensisog Rickettsia spp.) tilgang til infiserte cellen stoffer av fysisk og enzymatisk nedverdigende primære vacuolar membranen. En gang i stoffer disse patogener både sprer samt generere tilstrekkelig mekaniske krefter å trenge plasma membranen av verten cellen for å infisere nye celler. Her viser vi hvordan dette terminal trinnet av mobilnettet infeksjon syklusen av L. monocytogenes (Lm) kan kvantifiseres både colony-forming enhet analyser og flowcytometri og gi eksempler på hvordan både patogen - og vert-kodet faktorer innvirkning dette prosessen. Vi viser også en nær korrespondanse av Lm infeksjon dynamikken i kulturperler celler infisert i vitro og de av nedsatt celler avledet fra mus infisert i vivo. Disse funksjonen-baserte analyser er relativt enkel og kan lett skaleres for funn-basert høy gjennomstrømming skjermer for modulatorer eukaryote celle-funksjonen.

Vurdere rollen patogen og vert-kodet faktorer som påvirker mobilnettet infeksjon Bruker infeksjon forholdene beskrevet ovenfor, er 0,15% av input vill-type Lm gjenopprettet etter 1,5 t med co inkubering med kulturperler makrofager (figur 1A). I den påfølgende 1,5 t med co inkubering (3t innlegget infeksjon, hpi), var det en 4-fold økning i utvinningen av levedyktig Lm og 3-6 hpi var det en ekstra 7.5-...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Vi beskrive både i vitro og in vivo infeksjon analyser som kan brukes til å analysere de vert-koding faktorer.

Bruke en bakteriell patogen Probe for mobilnettet og Organismic-nivå vert svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Mikrobielle patogener som replikerer intracellulært må til slutt gå ut av den infiserte cellen. Som, sammenlignet med andre aspekter av vertspatogeninteraksjoner er relativt understudert. Her beskriver vi teknikker for å analysere patogen effluks.Vi viser hvordan relativt enkelt analyser kan brukes til å enten evaluere efflukseffektivitet eller karakterisere post-efflukspatogener De generelle teknikkene som er beskrevet her, er bredt anvendelige, selv om spesifikke patogene vertscellemodeller kan variere hos kinetikk, doser og muligens lesninger. Når det gjelder å sette opp ethvert eksperimentelt system, er det viktig at det etableres klare kontroller som vil sikre at ekte, biologiske prosesser observeres i eksperimentelle prøver eller kohorter. Å demonstrere prosedyren vil være Petoria Gayle, en utdannet student fra laboratoriet mitt.Til å begynne med infeksjonseksperimentet, bruk en pipette til å legge til 20 mikroliter av det nyoppgjorte Lm-inokulumet til brønner, med parabolen litt vippet og pipettespissen forsiktig plassert i det overvisende mediet. Unngå å berøre veggene i brønnen med pipettespissen. Pipette innholdet i hver brønn forsiktig for å sikre fullstendig blanding.Ikke rist eller vipp platen betydelig for å unngå å spre LM over veggene i brønnen. Returner cellekulturretten til 37 grader Celsius, fem prosent karbondioksidinkubator. Bruk betingede medier fra uinfiserte celler som fortynningsmiddel for å forberede en 10 mikrogram per milliliter gentamicinløsning.Ved 30 minutter etter infeksjon, legg forsiktig til 30 mikroliter gentamicinoppløsning i parabolen for å nå en endelig konsentrasjon av to-punkts-fem mikrogram per milliliter. Pipette forsiktig innholdet i brønnen for å blande og returnere cellekulturfatet til inkubatoren. For å høste, hell litt parabolen og bruk forsiktig en pipette for å fjerne hele mediet fra brønnen.Tilsett punkt-fem milliliter destillert, sterilt vann til brønnen. Etter 30 sekunder, overfør den resulterende vannlylat til en ett-punkts-fem milliliter mikrocentrifuge rør og virvel kraftig i 10 sekunder. Tilsett fire-punkts fem mikroliter og 50 mikroliter av vannlysatet til 450 mikroliter destillert, sterilt vann for å forberede tidoblet og hundregangers fortynninger.Kort virvel for å sikre grundig blanding. Tilsett 50 mikroliter av de opprinnelige tidoblet fortynnede og hundredelte fortynnede prøvene på lysogeniske kjøttkraftgarplater, og spred ved hjelp av en platespreder. For å analysere for nye LM, trekk ut 10 mikroliter av overleggsmediene fra parabolen og del det i to fem mikroliter aliquots og mikro sentrifugerør.Legg til fem mikroliter dmem / FCS til en aliquot og legg til fem mikroliter av DMEM / FCS som inneholder fem mikroliter per milliliter gentamicin til den andre aliquot som kontroll. Vent fem minutter ved romtemperatur. Tilsett 90 mikroliter destillert sterilt vann til hver aliquot og vortex de to kraftig i 10 sekunder.Tilsett deretter 50 mikroliter av prøven på LB agarplater og spres ved hjelp av en platespreder. Oppbevar platene i 37 grader celsius inkubator i to dager før nummerering lm kolonier. Ved hjelp av en automatisert celleteller, juster de forberedte, rå to-seks-fire-punkts-syv cellene til konsentrasjonen av en ganger 10 til den sjette celler per milliliter.Tilsett en milliliter av prøven til brønner av en seks-brønns vevskulturplate. Infisere cellene med en forberedt Lm inoculum, tilsvarende et mangfold av infeksjon på 50. Ved ett-punkt-fem timer etter infeksjon, i en ett-punkts-fem milliliter mikrocentrifuge rør fylt med 500 mikroliter på fire prosent PFA, samle medier fra det første settet med brønner og plassere røret på is.For å samle intracellulær Lm, tilsett en milliliter destillert, sterilt vann til hver brønn. Etter 60 sekunder overfører du det resulterende vannlylatet til et ett-punkts-fem milliliter mikrocentrifugerør med 500 mikroliter med fire prosent PFA. Vortex røret kraftig i 10 sekunder og plasser den på is.For gjenværende brønner, fjern media og erstatt med en milliliter DMEM / FCS med fem mikrogram per milliliter gentamicin for å drepe ekstracellulær Lm.Returner straks parabolen til inkubatoren. Etter 30 minutter, fjern media og skift ut med DMEM / FCS uten gentamicin. Etter ytterligere to og fire timer, samle media i lysates for andre og tredje gang peker inn i rørene og plassere dem på isen for å kjøle.Sentrifuge rør på 10,000 ganger G i syv minutter. Bruk en pipette til å fjerne supernatant uten å forstyrre pelleten. Legg til fargecocktail som inneholder 50 mikroliter med fire prosent PFA og 15 mikroliter falloidin i røret og bland for å suspendere hver pellet.Inkuber rør i mørket ved fire grader Celsius i 20 minutter. Etter inkubasjon, tilsett en milliliter FACS buffer til hvert rør og pipette opp og ned for å blande. Spinn rør i sentrifugen ved 10 000 ganger G i syv minutter.Fjern supernatant uten å forstyrre pellet. For umiddelbar bruk, suspendere hver pellet i 400 mikroliter faksbuffer. Hvis du lagrer for senere analyse, legger du til 200 mikroliter faksbuffer og 200 mikroliter på fire prosent PFA i røret og blander for å suspendere.Ved hjelp av infeksjonsforholdene i den korte behandlingen med antibiotikagenamicin for å eliminere ikke-internalisert Lm, gjenopprettes nullpunkt-en-fem prosent av villtypen Lm etter ett-punkt-fem timer med samtidig inkubasjon med kultiverte makrofager. I den påfølgende samtidige inkubasjonen var det en firedoblet og syv-punkts femdobling i utvinningen av levedyktig Lm, som utelukkende representerer intracellulær spredning. Sammenlignbar profil ble observert for Lm-stammen som hadde en hypervirulent prfA under første infeksjon, men ikke mellom tre og seks HPI.Når PRFA ble slettet fra Lm-stammen, er det en påfølgende reduksjon i utvinningen av belastningen etter langvarig samtidig inkubasjon. Når gentamicin fjernes fra brønnene ved seks HPI, kan ekstracellulær Lm oppdages en time senere for både villtype og hypervirulent prfA-stammer, men ikke for belastningen med PRFA slettet. Media overlegging både uinfiserte og infiserte makrofager inneholdt lyssplittende, bakteriestørrelse svevestøv.Imidlertid hadde bare medier fra infiserte makrofager GFP positive signaler innenfor størrelsen gating. En tidsavhengig økning i utseendet av falloidinpositive Lm ble observert med infiserte makrofager. Når du plating ut makrofagene i 48-brønns vev kultur parabolen, la noen brønner uten celler.Disse no-cell kontroll brønner blir deretter behandlet nøyaktig det samme som celleholdige brønner, i form av tillegg av patogen, antibiotika, etc. for å sikre at eksperimentelle signaler er avhengig av tilstedeværelsen av vertsceller. I likhet med forsøkene som vises i figur en og tre, kan patogene eller vertsfaktorer og eller små molekyler testes om deres innvirkning på patogen cellulær effluks.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Den<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mus Modell: Studerer patogen og Host Bidrag til infeksiøs kolitt

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilnærming til preger landskapet av Host-patogenfrie Protein-protein interaksjoner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic drepe analysen å vurdere immunologiske svar mot bakteriell patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

En presis patogen levering og gjenoppretting system for murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...