Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
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Os ratos foram tratados com humanidade em conformidade com todas as directrizes do governo apropriado para o cuidado e uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e seu uso foi aprovados para este estudo todo pelo cuidado Animal institucional Universidade de Miami e o Comitê de uso (protocolo 16-053).
1. preparar células para a infecção
<ol><li>Propagar o rato macrófago-como a linha celular 264.7 crus em meios de cultura de tecido DMEM suplementados com 10% de soro ...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

Devido a seu programa de infecção celular rápida e processive, Lm é um patógeno ideal para sondar celulares atividades que impactam a infecção. Foram identificada uma série de fatores do hospedeiro que positivamente ou negativamente afetar Lm infecção celular11,12,13,14. Dois desses hospedam fatores caracteriza-se em nosso laboratório, perforina-2 e o inibidor de He...

Infecção com base em modelos experimentais são inerentemente desafiadoras devido a sua dependência sobre as condições de estado inicial do hospedeiro e patógeno, as várias estratégias de infecção do patógeno e a dificuldade de atribuir o patógeno e hospedeiro-orientado a processos com base em resultados. A bactéria Listeria monocytogenes (Lm) tornou-se um patógeno ideal para sondar as respostas de defesa do hospedeiro por causa de sua rastreabilidade genética e microbiológica, sua estratégia de infecção celular rápida e processive e relativamente clara relação entre seus fenótipos de infecção celular e organísmica-nível. A infecção celular de Lm procede por quatro fases distintas1: (i) invasão celular que conclui com Lm sendo colocadas dentro de um vacúolo; (ii) Lm-dirigido a dissolução da membrana do vacúolo e libertação de Lm no citosol; (iii) intracytosolic replicação; e (iv) penetração física da membrana plasmática que resulta na infecção de células diretamente adjacentes (tais como uma folha epitelial) ou, em celas solitárias, lançamento do Lm para o meio extracelular. Cada uma destas fases são promovidos pelo específico Lm-codificado fatores (referidos como 'fatores de virulência') que, quando eliminado, causar defeitos de infecção em modelos celulares e animais. Esta estratégia de infecção geral tem sido evoluiu de modo independente por vários dos chamados patógenos 'citosólica'2.
Formadoras de Colônia (UFC) de unidade ensaios são amplamente empregados para avaliar ambos in vitro (ou seja, celulares), bem como in vivo (ou seja, organísmica) resultados de infecção. Além de sua alta sensibilidade, particularmente para infecções em vivo, CFU ensaios fornecem uma leitura ambígua para invasão do patógeno e sobrevivência/proliferação intracelular. CFU ensaios têm sido utilizados extensivamente para analisar os determinantes de célula Lm e o anfitrião que impactam a infecção. Tão informativa como estes estudos prévios foram analisar a invasão celular e replicação de intracytosolic, ensaios de UFC não, o melhor de nosso conhecimento, foram utilizados para acompanhar a quarta fase do processo de infecção de Lm : fuga de celular. Aqui, descrevemos relativamente simples meios de evacuação como celular (doravante referida como 'emergência') podem ser monitorados por meio de ensaio CFU (bem como por citometria de fluxo) e mostrar exemplos de como os dois fatores do patógeno e hospedeiro codificado - regulam esta fase da Lm ciclo de infecção. A análise da fase terminal do ciclo celular Lm infecção pode tornar possível identificar atividades e fatores de infecção específica de célula do hospedeiro e patógeno adicional.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Há uma variedade de estratégias de patógenos bacterianos empregam para sobreviver e proliferar uma vez dentro da célula eucariótica. Os chamados 'citosólico' patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) ter acesso para o citoplasma da célula infectada pelo fisicamente e enzimaticamente degradante a membrana vacuolar primária. Uma vez no citosol, estes patógenos proliferam tanto geram forças mecânicas suficientes para penetrar a membrana plasmática da célula hospedeira para infectar novas células. Aqui, nós mostramos como essa etapa terminal do ciclo celular de infecção de L. monocytogenes (Lm) pode ser quantificada por citometria de fluxo e ensaios de unidade formadoras e dar exemplos de como ambos impacto de fatores patógeno e hospedeiro codificado - isto processo. Também mostramos uma estreita correspondência de Lm dinâmica de infecção das células cultivadas infectados in vitro e os de células hepáticas, derivadas de ratos infectados in vivo. Estes ensaios baseados em função são relativamente simples e podem ser facilmente ampliados para telas de alta produtividade baseada na descoberta de moduladores da função da célula eucariótica.

Avaliar o papel do patógeno e hospedeiro-codificado fatores impactando infecção celular Usando as condições de infecção descritas acima, 0,15% da entrada do selvagem-tipo Lm é recuperado após 1,5 h de incubação co com macrófagos cultivados (Figura 1A). No subsequente 1,5 h de incubação co (3h pós infecção, hpi), houve um 4-fold aumento na recuperação de viável Lm e de 3 a 6 hpi, houve ...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Patógenos microbianos que se replicam intracelularmente devem eventualmente sair da célula infectada. Que, quando comparado com outros aspectos das interações de patógenos hospedeiros é relativamente subestudado. Aqui, descrevemos técnicas para analisar o efflux patógeno.Mostramos como ensaios relativamente simples podem ser usados para avaliar a eficiência efflux ou caracterizar patógenos pós-efflux As técnicas gerais descritas aqui são amplamente aplicáveis, embora modelos específicos de células hospedeiras de patógenos possam diferir em cinéticas, dosagens e possivelmente leituras. Como na criação de qualquer sistema experimental, é essencial que sejam estabelecidos controles claros que garantam que processos biológicos genuínos sejam observados em amostras experimentais ou coortes. Demonstrando o procedimento será Petoria Gayle, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para começar com o experimento de infecção, use uma pipeta para adicionar 20 microliters do inóculo Lm recém-preparado aos poços, com o prato ligeiramente inclinado e a ponta da pipeta cuidadosamente colocada na mídia sobrelada. Evite tocar nas paredes do poço com a ponta da pipeta. Pipeta suavemente o conteúdo de cada poço para garantir a mistura completa.Não agite ou incline significativamente a placa para evitar espalhar LM sobre as paredes do poço. Retorne o prato de cultura celular ao prato de 37 graus Celsius, 5% de incubadora de dióxido de carbono. Use mídia condicionada de células não infectadas como diluídas para preparar uma solução de 10 microgramas por mililitro de gentamicina.Aos 30 minutos pós-infecção, adicione cuidadosamente 30 microliters da solução de gentamicina no prato para alcançar uma concentração final de microgramas de dois pontos e cinco por mililitro. Pipeta suavemente o conteúdo do poço para misturar e devolver o prato de cultura celular para a incubadora. Para colher, incline ligeiramente o prato e use cuidadosamente uma pipeta para remover toda a mídia do poço.Adicione um ponto cinco mililitros de água destilada e estéril ao poço. Após 30 segundos, transfira o lise de água resultante para um tubo de microcentrífugo de um ponto e cinco mililitros e vórtice vigorosamente por 10 segundos. Adicione microlitres de quatro pontos e cinco e 50 microlitadores do liseu de água a 450 microliters de água destilada e estéril para preparar as diluições de dez vezes e cem vezes.Brevemente vórtice para garantir a mistura completa. Adicione 50 microliters das amostras diluídas e cem vezes diluídas em placas de ágar de caldo lysogeny e espalhe usando um espalhador de placas. Para avaliar o LM emergente, extraia 10 microlitadores da mídia sobreposta do prato e divida-a em duas alíquotas de cinco microlitrais e tubos de microcrédito.Adicione cinco microliters de DMEM/FCS a uma alíquota e adicione cinco microliters de DMEM/FCS contendo cinco microliters por gentamicina mililitro à segunda alíquota como controle. Espere cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione 90 microliters de água estéril destilada a cada alíquota e vórtice os dois vigorosamente por 10 segundos.Em seguida, adicione 50 microliters da amostra em placas de ágar LB e espalhe usando um espalhador de placas. Armazene as placas em incubadoras de 37 graus celsius por dois dias antes de enumerar colônias Lm. Usando um contador celular automatizado, ajuste as células preparadas, cruas de dois a quatro e sete pontos, para a concentração de uma vez 10 para a sexta célula-por-mililitro.Adicione um mililitro da amostra a poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Infecte as células com um Lm inóculo preparado, correspondendo a uma multiplicidade de infecção de 50. Em um ponto e cinco horas após a infecção, em um tubo de microcentrífuga de um ponto e cinco mililitros cheio de 500 microliters de 4% PFA, coletar mídia do primeiro conjunto de poços e colocar o tubo no gelo.Para coletar Lm intracelular, adicione um mililitro de água destilada e estéril a cada poço. Após 60 segundos, transfira o lysato de água resultante para um tubo de microcentrífuga de um ponto e cinco mililitros com 500 microliters de 4% de PFA. Vórtice o tubo vigorosamente por 10 segundos e colocá-lo no gelo.Para os poços remanescentes, remova a mídia e substitua por um mililitro de DMEM/FCS por cinco microgramas por mililitro gentamicin para matar lm extracelular.Devolva prontamente o prato à incubadora. Após 30 minutos, remova a mídia e substitua-a por DMEM/FCS sem gentamicina. Depois de mais duas e quatro horas, colete mídia em lysates pela segunda e terceira vez aponta para os tubos e coloque-os no gelo para esfriar.Tubos de centrífuga a 10.000 vezes G por sete minutos. Usando uma pipeta, remova o supernasce sem perturbar a pelota. Adicione coquetel de coloração contendo 50 microliters de 4% pfa e 15 microliters de falo no tubo e misture para suspender cada pelota.Incubar tubos no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão FACS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo para misturar. Gire tubos na centrífuga a 10.000 vezes G por sete minutos.Remova o supernatante sem perturbar a pelota. Para uso imediato, suspenda cada pelota em 400 microliters de buffer FAX. Se armazenar para análise posterior, adicione 200 microliters de buffer FAX e 200 microliters de 4% PFA no tubo e misture para suspender.Usando as condições de infecção no breve tratamento com o antibiótico gentamicina para eliminar lm não internalizado, zero-ponto-um-cinco por cento do tipo selvagem Lm é recuperado após um ponto-cinco horas de co-incubação com macrófagos cultivados. Na co-incubação subsequente, houve um aumento de quatro vezes e sete pontos na recuperação do LM viável, que representam exclusivamente a proliferação intracelular. Observou-se perfil comparável para a cepa Lm que possui um prfA hipervirulento durante a infecção inicial, mas não entre três e seis HPI.Quando a prfA foi excluída da cepa Lm, há uma redução subsequente na recuperação da cepa após co-incubação prolongada. Quando a gentamicina é removida dos poços a seis HPI, o LM extracelular pode ser detectado uma hora depois para as cepas prfA do tipo selvagem e hipervirulenta, mas não para a cepa com prfA excluído. A sobreposição de mídia tanto macrófagos não infectados quanto infectados continha material particulado do tamanho de uma bactéria.No entanto, apenas a mídia de macrófagos infectados possuía sinais positivos de GFP dentro do tamanho do gating. Observou-se aumento do tempo no aparecimento de mico-positivo de falo-positivo Lm com macrófagos infectados. Ao emplacar os macrófagos no prato de cultura tecidual de 48 poços, deixe alguns poços sem células.Esses poços de controle sem células são então tratados exatamente como os poços contendo células, em termos da adição do patógeno, antibióticos, etc. para garantir que os sinais experimentais dependem da presença de células hospedeiras. Semelhante aos experimentos mostrados nas figuras um e três, fatores patógenos ou hospedeiros e ou pequenas moléculas podem ser testadas quanto ao seu impacto no efflux celular patógeno.

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