Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Мышей обращались гуманно в соответствии с все соответствующие правительственные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных из национальных институтов здравоохранения и их использовании была утверждена для этого всего исследования Университета Майами инс...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

Из-за его быстрого и processive клеточных инфекции программа Lm является идеальным возбудителя зонда клеточной деятельности, влияющих инфекции. Были определены ряд принимающих факторов, положительно или отрицательно влияют на Lm сотовой инфекции11,12<...

Инфекции на основе экспериментальной модели изначально сложным вследствие их зависимости от начального состояния узла и возбудителя, различные стратегии возбудителя инфекции и трудности приписывая возбудителя и хост-процессов на основе результатов. Бактерией листерий (Lm) стал идеальным патогена на зонд узла обороны ответы из-за его генетических и микробиологических уступчивость, его стратегии быстрого и processive клеточных инфекции и относительно ясно связь между своей сотовой и организмический уровень инфекции фенотипов. Клеточных инфекции Lm проходит через четыре этапа1: (i) сотовых вторжения, которое заключает с Lm заключены в вакуоль; (ii) Lm-растворение мембраны вакуоль и выпуска Lm в цитозоль; (iii) intracytosolic репликации; и (iv) физического проникновения плазматической мембраны, что приводит либо инфекции непосредственно смежных ячеек (например, эпителиальные лист) или, в одиночных клетках, выпуск Lm в внеклеточной окружение. Каждый из этих этапов способствует конкретным Lm-кодировке факторов (упоминаемые как «факторы вирулентности»), при удалении, вызвать инфекции дефекты в клеточном и животных моделях. Эта стратегия общие инфекции независимо претерпела ряд так называемых «цитозольной» патогенов2.
Колония формирование подразделения (CFU) анализы широко используются для оценки как в лабораторных условиях (т.е., сотовой) также как в естественных условиях (т.е., гештальтпсихология) исходы инфекции. В дополнение к их высокая чувствительность, особенно для в-vivo инфекций CFU анализов обеспечивают недвусмысленный индикации возбудителя вторжение и внутриклеточных выживания/распространения. КОЕ анализы широко использовались для анализа Lm и принимающей ячейки определяющих влияние инфекции. Как информативным, как эти предыдущие исследования были анализировать сотовой вторжения и intracytosolic репликации, кое анализов не, в меру наших знаний, были использованы для отслеживания четвертый этап процесса инфекции Lm : сотовой побег. Здесь мы описываем относительно простые средства как сотовой побега (именуемый в дальнейшем «появление») могут контролироваться пробирного CFU (а также проточной цитометрии) и показать примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов регулировать этот этап лм цикл инфекции. Анализ терминала фазы клеточного цикла Lm инфекции может сделать возможным определить дополнительные возбудителя и принимающей ячейки инфекции специфические факторы и мероприятия.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Существует целый ряд стратегий, которые используют бактериальных патогенов выжить и размножаться раз внутри эукариотической клетки. Так называемые «цитозольной» патогенов (Listeria monocytogenes, шигеллам Флекснера, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisи риккетсии spp.) получить доступ к зараженной клетки цитозоле физически и ферментативно унижающего достоинство первичной вакуолярной мембраны. Однажды в цитозоле, этих патогенов как размножаться, так и создания достаточной механических сил, чтобы проникнуть плазматической мембраны клетки-хозяина, чтобы инфицировать новые клетки. Здесь мы покажем, как этот терминал шаг цикла сотовой инфекции моноцитогенес л (Lm) может быть определена количественно, образуя колонии подразделение анализов и проточной цитометрии и привести примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов воздействия, это процесс. Мы также показывают, тесная связь Lm инфекции динамики культивируемых клеток, инфицированных в пробирке и тех клеток печени, производные от мышей инфицированных в естественных условиях. Эти функции на основе анализов относительно просты и могут быть легко масштабируются для обнаружения на основе экранов высокой пропускной способностью для модуляторы функции эукариотических клеток.

Оценка роли возбудителя и хост кодировке факторов, влияющих на клеточном инфекции Используя описанные выше условия инфекции, 0,15% от входного одичал типа Lm восстанавливается после 1,5 h совместно инкубации с искусственного макрофагов (рис. 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Мы опишем, как анализы в vitro и in vivo инфекции, которые могут использоваться для анализа деятельности хост кодирования факторов.

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Микробные патогены, которые размножаются внутриклеточно, должны в конечном итоге выйти из инфицированной клетки. Что, по сравнению с другими аспектами взаимодействия патогенов-хозяина, относительно недостаточно изучено. Здесь мы описываем методы анализа патогенного эффлюкса.Мы показываем, как относительно просто анализы могут быть использованы либо для оценки эффективности эффлюкса или характеризуют пост-эффлюкс патогенов Общие методы, описанные здесь широко применимы, хотя конкретные модели клеток-хозяинов патогенов могут отличаться в кинетике, дозах и, возможно, считывателях. Как и при создании какой-либо экспериментальной системы, крайне важно установить четкий контроль, который обеспечит соблюдение подлинных биологических процессов в экспериментальных образцах или когортах. Демонстрацией процедуры будет Петория Гейл, аспирантка из моей лаборатории.Для начала инфекционного эксперимента используйте пипетку, чтобы добавить в колодцы 20 микролитров свежеприготовленного Lm inoculum, при этом блюдо слегка наклонено, а кончик пипетки аккуратно помещается в чрезмерное ось. Избегайте прикосновения к стенам колодец с наконечником пипетки. Аккуратно пипетка содержимое каждого хорошо, чтобы обеспечить полное смешивание.Не трясти или значительно наклонить пластину, чтобы избежать распространения LM над стенами хорошо. Верните блюдо клеточной культуры в 37 градусов по Цельсию, пять процентов инкубатора двуокиси углерода. Используйте условные средства массовой информации из неинфицированных клеток в качестве разбомбительного для подготовки 10 микрограмм на миллилитр раствора гентамицина.На 30 минут после заражения, осторожно добавить 30 микролитров раствора гентамицина в блюдо, чтобы достичь конечной концентрации двухточечий пять микрограмм на миллилитр. Аккуратно пипетка содержимое хорошо смешать и вернуть блюдо клеточной культуры в инкубатор. Чтобы собрать урожай, слегка наклоните блюдо и осторожно используйте пипетки, чтобы удалить весь меас из колодец.Добавьте в колодец пяти миллилитров дистиллированной стерильной воды. Через 30 секунд перенесите полученную воду лизат в микроцентрифугную трубку с одной точкой пять миллилитров и вихрь энергично в течение 10 секунд. Добавьте четырехтокаправленные пять микролитров и 50 микролитров воды к 450 микролитров дистиллированной стерильной воды для подготовки десятикратного и стократного разбавления.Кратко вихрь для обеспечения тщательного смешивания. Добавьте 50 микролитров оригинальных десятикратных разбавленных и стократных разбавленных образцов на лизогенный бульон агар пластины, и распределить с помощью пластины распределитель. Для анализа новых LM, извлечь 10 микролитров наложения средств массовой информации из блюда и разделить его на два пятиминерных aliquots и микро центрифуг трубки.Добавьте пять микролитров DMEM/FCS в одну алициту и добавьте пять микролитров DMEM/FCS, содержащих пять микролитров на миллилитр гентамицин, во вторую алициту в качестве контроля. Подождите пять минут при комнатной температуре. Добавьте 90 микролитров дистиллированной стерильной воды в каждую алициту и вихрь два энергично в течение 10 секунд.Затем добавьте 50 микролитров образца на пластины LB agar и распределите с помощью распределители пластин. Храните пластины в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение двух дней, прежде чем перечислять Lm колоний. Используя автоматизированный счетчик ячеек, отрегулируйте подготовленные, сырые две-шесть-четыре точки семь клеток к концентрации один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр.Добавьте один миллилитр образца в скважины из шести скважин ткани культуры пластины. Заразить клетки с подготовленным Lm inoculum, что соответствует множественности инфекции 50. В одной точке пять часов после заражения, в одной точке пять миллилитров микроцентрифуг трубки заполнены 500 микролитров четыре процента PFA, собирать средства массовой информации из первого набора скважин и место трубки на льду.Для сбора внутриклеточной Lm, добавить один миллилитр дистиллированной, стерильной воды в каждой хорошо. Через 60 секунд перенесите полученный лизат воды в одноточек пять миллилитров микроцентрифуг трубки с 500 микролитров четырехпроцентной ПФА. Вихрь трубки энергично в течение 10 секунд и поместить его на лед.Для остальных скважин удалите мультимедиа и замените на один миллилитр DMEM/FCS пятими микрограммами на миллилитр гентамицин, чтобы убить внеклеточный Lm.Promptly вернуть блюдо в инкубатор. Через 30 минут удалите мультимедиа и замените DMEM/FCS без гентамицина. Еще через два-четыре часа собирайте средства массовой информации в лисаты во второй и третий раз поставить точку в трубках и поместить их на лед, чтобы охладить.Центрифуговые трубки по 10 000 раз G в течение семи минут. Используя пипетку, удалите супернатант, не нарушая гранулы. Добавьте окрашивающий коктейль, содержащий 50 микролитров четырехпроцентного ПФА и 15 микролитров фаллоидин в трубку и смешайте, чтобы приостановить каждую гранулу.Инкубировать трубки в темноте при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут. После инкубации добавьте один миллилитр буфера FACS к каждой трубке и пипетке вверх и вниз, чтобы перемешать. Спиновые трубки в центрифуге по 10 000 раз G в течение семи минут.Удалите супернатант, не нарушая гранулы. Для немедленного использования приостанавливайте каждую гранулу в 400 микролитров буфера FAX. При хранении для более тщательного анализа добавьте 200 микролитров буфера FAX и 200 микролитров по четыре процента PFA в трубку и смешайте, чтобы приостановить.Использование инфекционных условий в кратком лечении антибиотиком гентамицина для устранения невоинализированных Lm, нулевой точки один-пять процентов дикого типа Lm восстанавливается после одной точки пять часов совместного инкубации с культурными макрофагами. В ходе последующей совместной инкубации произошло четырехкратное и пятиохократное увеличение восстановления жизнеспособного ЛМ, которые представляют собой исключительно внутриклеточное распространение. Сопоставимый профиль наблюдался для штамма Lm, обладая гипервирулянтной prfA во время первоначальной инфекции, но не между тремя и шестью HPI.Когда prfA был удален из штамма Lm, есть последующее снижение восстановления штамма после длительного совместного инкубации. Когда гентамицин удаляется из скважин в шесть HPI, внеклеточный Lm может быть обнаружен через час для диких типа и гипервирулянтных штаммов prfA, но не для штамма с prfA удалены. Средства массовой информации, накладыв как неинфицированные, так и инфицированные макрофаги, содержали светоразбрасывные твердые частицы размером с бактерию.Однако только средства массовой информации из зараженных макрофагов обладали положительными сигналами GFP в пределах размера gating. С инфицированными макрофагами наблюдалось во времени увеличение появления фаллоиден-положительного Lm. При обливки макрофагов в 48-хорошо ткани культуры блюдо, оставить некоторые скважины без клеток.Эти неклеточные контрольные скважины затем обрабатываются точно так же, как клеточные скважины, с точки зрения добавления патогена, антибиотиков и т.д., чтобы гарантировать, что экспериментальные сигналы зависят от присутствия клеток-хозяй. Подобно экспериментам, показанным на цифрах один и три, патогенные или принимающие факторы и или небольшие молекулы могут быть проверены на их влияние на патогенный клеточный эффлюкс.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Вторжение клеток человека от бактериальных патогенов

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: изучение патогенности и Хост Взносы в инфекционным колитом

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном<em&gt; листерий</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Точная система доставки патогенов и восстановления для мориновых моделей вторичной бактериальной пневмонии

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...