Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
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Ratones fueron tratados humanamente conforme a todas las directrices gubernamentales apropiadas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y su uso fue aprobados para este estudio todo en el cuidado de los animales institucional Universidad de Miami y el Comité uso (protocolo 16-053).
1. preparar las células para la infección
<ol><li>Propagar la línea macrófago-como célula de ratón RAW 264.7 en medios de cultivo tisular DMEM suplementados co...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

Debido a su programa de infección celular rápida y procesual, Lm es un patógeno ideal para actividades celulares que afectan a la infección. Se han identificado una serie de factores del huésped que afectan ya sea positiva o negativamente a Lm infección celular11,12,13,14. Estos dos host factores caracterizados en nuestro laboratorio, Perforin-2 y el hemo regulados inhib...

Modelos experimentales de infección son inherentemente difíciles debido a su dependencia de las condiciones iniciales del estado de la hostia, patógeno, las diversas estrategias de infección del patógeno y la dificultad de atribuir los procesos impulsados por el anfitrión y el patógeno basado en los resultados. La bacteria Listeria monocytogenes (Lm) se ha convertido en un patógeno ideal para sondear respuestas de defensa del anfitrión debido a su maleabilidad genética y microbiológica, su estrategia de infección celular rápida y procesual y el relativamente claro relación entre sus fenotipos de infección del nivel celular y organísmica. La infección celular de Lm procede a través de cuatro fases1: (i) invasión celular que concluye con Lm encasillarse dentro de una vacuola; (ii) Lm-dirigido de la disolución de la membrana de la vacuola y lanzamiento de Lm en el citosol; (iii) intracitosólico replicación; y la penetración física (iv) de la membrana plasmática que resulta en cualquiera de los dos la infección de células directamente adyacentes (tales como una hoja epitelial) o en células solitarias, lanzamiento de Lm en el medio extracelular. Cada una de estas fases son promovidos por específicos Lm-codifican factores (denominados 'factores de virulencia') que, cuando borra, causar infección defectos en modelos celulares y animales. Esta estrategia de infección general se ha desarrollado independientemente por un número de los llamados patógenos 'citosólica'2.
Formadoras de colonias (UFC) de unidad ensayos se emplean extensamente para evaluar tanto in vitro (es decir, celular), así como in vivo (es decir, organísmica) los resultados de la infección. Además de su alta sensibilidad, particularmente para infecciones en vivo, UFC ensayos proporcionan una lectura inequívoca para la invasión de patógenos y supervivencia/proliferación intracelular. Ensayos de UFC se han utilizado para analizar los determinantes de célula Lm y host que afectan a la infección. Tan informativo como han sido estos estudios previos analizar la invasión celular y replicación intracitosólico, ensayos de UFC no, a lo mejor de nuestro conocimiento, se han utilizado para seguimiento de la cuarta fase del proceso de infección de Lm : escape celular. Aquí, describimos relativamente simple vía de escape como celular (en lo sucesivo, 'aparición') puede ser controlado por análisis de UFC (así como por el flujo cytometry) y mostrar ejemplos de cómo ambos factores codificados de patógeno y huésped regulan esta fase de la Lm ciclo de infección. El análisis de la fase terminal del ciclo celular de infección de Lm puede posibilitar identificar patógeno adicional y anfitrión célula específica de infección factores y actividades.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Hay una variedad de estrategias de patógenos bacterianos que se emplean para sobrevivir y proliferar una vez dentro de la célula eucariota. El supuesto 'citosólicas' patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, pseudomallei de Burkholderia, Francisella tularensisy Rickettsia spp.) tengan acceso al citosol de la célula infectada por físicamente y enzimático degradando la membrana primaria de vacuolares. Una vez en el citosol, estos patógenos tanto proliferan, así como generan fuerzas mecánicas suficientes para penetrar en la membrana plasmática de la célula huésped para poder infectar nuevas células. A continuación, os mostramos cómo esta etapa terminal del ciclo celular de infección de L. monocytogenes (Lm) puede ser cuantificada por ensayos de unidad formadora de colonias y citometría de flujo y dar ejemplos de cómo ambos efectos de factores codificados de patógeno y huésped esto proceso. También mostramos una correspondencia estrecha de Lm dinámica de infección de cultivos de células infectadas in vitro y los de las células hepáticas derivadas de ratones infectaron in vivo. Estos ensayos de función son relativamente simples y pueden fácilmente ampliarse para pantallas de alto rendimiento basado en el descubrimiento de moduladores de la función de la célula eucariota.

Evaluación del papel de patógeno y codificada en host factores que afectan la infección celular Usando las condiciones de infección descritas, 0.15% de la entrada de tipo salvaje Lm se recupera después de 1,5 h de incubación conjunta con macrófagos cultivados (figura 1A). En el subsecuente de 1,5 h de incubación Co (3 h post infección, hpi), hubo un aumento de 4 veces en la recuperación de viable Lm<...

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Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.

Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Los patógenos microbianos que se replican intracelularmente deben salir eventualmente de la célula infectada. Que, en comparación con otros aspectos de las interacciones de patógenos del huésped es relativamente poco estudiado. Aquí, describimos técnicas para analizar el eflujo de patógenos.Mostramos cómo se pueden utilizar ensayos relativamente sencillas para evaluar la eficiencia del eflujo o caracterizar patógenos post-eflujo Las técnicas generales descritas aquí son ampliamente aplicables, aunque los modelos específicos de células host de patógenos pueden diferir en cinética, dosis y posiblemente lecturas. Al igual que en la creación de cualquier sistema experimental, es esencial que se establezcan controles claros que garanticen que se observen procesos biológicos genuinos en muestras o cohortes experimentales. Demostrando el procedimiento estará Petoria Gayle, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.Para comenzar con el experimento de infección, utilice una pipeta para añadir 20 microlitros del inóculo Lm recién preparado a los pozos, con el plato ligeramente inclinado y la punta de la pipeta cuidadosamente colocada en el medio superponiendo. Evite tocar las paredes del pozo con la punta de la pipeta. Pipetear suavemente el contenido de cada pozo para asegurar una mezcla completa.No agite ni incline significativamente la placa para evitar la propagación de LM sobre las paredes del pozo. Devuelva el plato de cultivo celular a la incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius, cinco por ciento. Utilice medios condicionados de células no infectadas como diluyente para preparar una solución de gentamicina de 10 microgramos por mililitro.A los 30 minutos después de la infección, agregue cuidadosamente 30 microlitros de la solución de gentamicina en el plato para alcanzar una concentración final de dos puntos a cinco microgramos por mililitro. Pipetear suavemente el contenido del pozo para mezclar y devolver el plato de cultivo celular a la incubadora. Para cosechar, incline ligeramente el plato y utilice cuidadosamente una pipeta para retirar todo el medio del pozo.Agregue el punto cinco mililitros de agua destilada y estéril al pozo. Después de 30 segundos, transfiera el agua resultante al lito de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de un punto y cinco mililitros y vórtice vigorosamente durante 10 segundos. Agregue microlitros de cuatro puntos a cinco y 50 microlitros del suave de agua a 450 microlitros de agua destilada y estéril para preparar las diluciones de diez y cien veces.Brevemente vórtice para asegurar una mezcla completa. Añadir 50 microlitros de las muestras originales rídlicas diluidas y cien veces diluidas en placas de agar de caldo de suave contenido, y esparcir con un esparcidor de placas. Para ensayar el LM emergente, extraiga 10 microlitros de los medios superpuestos del plato y divídelo en dos alícuotas de cinco microlitros y micro centrífugas.Agregue cinco microlitros de DMEM/FCS a una alícuota y agregue cinco microlitros de DMEM/FCS que contengan cinco microlitros por mililitro gentamicina a la segunda alícuota como control. Espere cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir 90 microlitros de agua estéril destilada a cada alícuota y vórtice los dos vigorosamente durante 10 segundos.A continuación, añada 50 microlitros de la muestra en placas de agar LB y extienda con un esparcidor de placas. Almacene las placas en una incubadora de 37 grados centígrados durante dos días antes de enumerar las colonias lm. Usando un contador de células automatizado, ajuste las células preparadas, crudas de dos,seis,cuatro puntos y siete a la concentración de una por 10 a la sexta célula por mililitro.Agregue un mililitro de la muestra a los pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos. Infectar las células con un inóculo Lm preparado, correspondiente a una multiplicidad de infección de 50. En un punto a cinco horas después de la infección, en un tubo de microcentrífuga de un punto a cinco mililitros lleno de 500 microlitros de cuatro por ciento de PFA, recoger los medios del primer conjunto de pozos y colocar el tubo en hielo.Para recoger Lm intracelular, agregue un mililitro de agua destilada y estéril a cada pozo. Después de 60 segundos, transfiera el élizado de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de un punto y cinco mililitros con 500 microlitros de PFA de cuatro por ciento. Vórtice el tubo vigorosamente durante 10 segundos y colóquelo sobre hielo.Para los pozos restantes, retire los medios y sustitúyalos con un mililitro de DMEM/FCS con cinco microgramos por mililitro de gentamicina para matar el lm extracelular.Devuelva rápidamente el plato a la incubadora. Después de 30 minutos, retire los medios y sustitúyalo por DMEM/FCS sin gentamicina. Después de otras dos y cuatro horas, recoger los medios de comunicación en lysates por segunda y tercera vez puntos en los tubos y colocarlos en hielo para enfriar.Tubos centrífugos a 10.000 veces G durante siete minutos. Con una pipeta, retire el sobrenadante sin alterar el pellet. Añadir el cóctel de tinción que contiene 50 microlitros de cuatro por ciento de PFA y 15 microlitros de faloide en el tubo y mezclar para suspender cada pellet.Incubar tubos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón FACS a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Gire los tubos en la centrífuga a 10.000 veces G durante siete minutos.Retire el sobrenadante sin alterar el pellet. Para uso inmediato, suspenda cada pellet en 400 microlitros de tampón FAX. Si se almacenan para su posterior análisis, agregue 200 microlitros de tampón FAX y 200 microlitros de cuatro por ciento de PFA en el tubo y mezcle para suspender.Utilizando las condiciones de infección en el breve tratamiento con el antibiótico gentamicina para eliminar lm no internalizado, cero punto uno-cinco por ciento del tipo silvestre Lm se recupera después de un punto-cinco horas de coincimenculación con macrófagos cultivados. En la posterior incubación, hubo un aumento de cuatro y siete puntos por cinco en la recuperación de Lm viable, que representan exclusivamente la proliferación intracelular. Se observó un perfil comparable para la cepa Lm que poseía una prfA hipervirulenta durante la infección inicial, pero no entre tres y seis HPI.Cuando el prfA se eliminó de la cepa Lm, hay una reducción posterior en la recuperación de la cepa después de una co-incubación prolongada. Cuando la gentamicina se retira de los pozos a seis HPI, lm extracelular se puede detectar una hora más tarde para cepas de prfA de tipo salvaje e hipervirulante, pero no para la cepa con prfA eliminado. Los medios que se superponen tanto los macrófagos no infectados como los infectados contenían partículas de dispersión de luz y de forma de bacteria.Sin embargo, sólo los medios de los macrófagos infectados poseían señales positivas de GFP dentro del tamaño de la gama. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la apariencia de falhalloidina positiva Lm con macrófagos infectados. Al enchapar los macrófagos en el plato de cultivo de tejido de 48 pozos, deje algunos pozos sin células.Estos pozos de control sin células se tratan exactamente igual que los pozos que contienen células, en términos de la adición del patógeno, antibióticos, etc. para garantizar que las señales experimentales dependen de la presencia de células huésped. Similar a los experimentos mostrados en las figuras uno y tres, los factores patógenos o host y o moléculas pequeñas pueden ser probados en cuanto a su impacto en el eflujo celular patógeno.

Research

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