Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Möss behandlades humant i enlighet med alla lämpliga regeringens riktlinjer för vård och använda av försöksdjur av National Institutes of Health och deras användning var godkänd för hela studien av University of Miami institutionella djur vård och användning kommittén (protokoll 16-053).
1. förbereda celler för infektion
<ol><li>Propagera mus makrofag-liknande cellinje RAW 264,7 i DMEM vävnadsodling media kompletteras med 10% fetalt kalvserum (hädanefter benämnd DMEM/FCS) a...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

På grund av dess snabba och processive cellulära infektion program är Lm en idealisk patogen sond cellulära aktiviteter som påverkar infektion. Ett antal värd faktorer har identifierats som antingen positivt eller negativt påverkar Lm cellulära infektion11,12,13,14. Två sådana värd faktorer kännetecknas i vårt laboratorium, Perforin-2 och den reglerade Heme-hämma...

Infektion-baserade experimentella modeller är till sin natur utmanande på grund av deras beroende av start staten villkoren för värd och patogen, olika patogen infektion strategier och svårigheten att tillskriva patogen - och host-driven processer baserat på resultat. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) har blivit en idealisk patogen sond värd försvar Svaren på grund av dess genetiska och mikrobiologiska tractability, snabb och processive cellulära infektion strategin och den relativt klara förhållandet mellan dess cell - och organismnivå-nivå infektion fenotyper. Cellulära infektionen av Lm fortskrider genom fyra distinkta faser1: (i) cellulär invasion som avslutas med Lm inneslutas inom en vakuol; (ii) Lm-regisserad upplösningen av vakuol membranet och utsättning av Lm i cytosolen; (iii) intracytosolic replikering. och (iv) fysiska genomträngningen av plasmamembranet som resulterar i antingen infektionen av direkt angränsande celler (t.ex. i en epitelial ark) eller i ensliga celler, utsättning av Lm i den extracellulära miljön. Var och en av dessa faser främjas av specifika Lm-kodade faktorer (benämnd 'virulensfaktorer') som, när bort, orsaka infektion defekter i både cellulära och djur modeller. Allmän infektion strategin har utvecklats självständigt av ett antal så kallade 'cytosoliska' patogener2.
Kolonibildande enhet (CFU) analyser används allmänt att utvärdera både in vitro-(dvs. cellulära) såväl som i vivo (dvs organismnivå) infektion resultat. Förutom deras hög känslighet, särskilt för Invivo infektioner, föreskriva CFU analyser en otvetydig avläsning patogen invasionen och intracellulär överlevnad/spridning. CFU analyser har använts i stor utsträckning att analysera både Lm och mottagande cell bestämningsfaktorer som påverkar infektion. Så informativ som dessa tidigare studier har varit att analysera cellulära invasionen och intracytosolic replikering, CFU analyser har inte, till bäst av vår kunskap, använts för att spåra den fjärde fasen av Lm infektionsprocessen: cellulär fly. Här beskriver vi relativt enkelt hur cellulära utrymningsvägar (hädanefter benämnd 'uppkomst') kan övervakas av CFU assay (liksom av flödescytometri) och Visa exempel på hur både patogen - och host-kodad faktorer reglera denna fas av Lm infektion cykel. Analysen av den terminala fasen av cellulära Lm infektion cykeln kan göra det möjligt att identifiera ytterligare patogen och värd cell infektion-specifika faktorer och aktiviteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Det finns en mängd strategier bakteriella patogener anställa att överleva och föröka sig en gång i eukaryota cellen. De så kallade 'cytosoliska' patogenerna (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisoch Rickettsia spp.) få tillgång till den infekterade cellen cytosolen av fysiskt och enzymatiskt förnedrande primära vacuolar membranet. En gång i cytosolen, dessa patogener föröka såväl som generera tillräckliga mekaniska krafter att penetrera plasmamembranet av värdcellen för att infektera nya celler. Här visar vi hur denna terminal steg av cellulära infektion cykeln av L. monocytogenes (Lm) kan kvantifieras genom både kolonibildande enhet analyser och flödescytometri och ge exempel på hur både patogen - och host-kodad faktorer påverkar detta processen. Vi visar också en nära korrespondens av Lm infektion dynamiken i odlade celler infekterade in vitro- och de av nedsatt celler från möss infekterade Invivo. Dessa funktionsbaserade testmetoder är relativt enkel och kan lätt skalas upp för discovery-baserade hög genomströmning skärmar för modulatorer av eukaryota cellens funktion.

Bedömningen av patogen och värd-kodade faktorer som påverkar cellulära infektion roll 0,15% av ingående vildtyp Lm använder infektion förhållandena som beskrivs ovan, och återvinns efter 1,5 h samtidig inkubering med odlade makrofager (figur 1A). I den efterföljande 1,5 h samtidig inkubering (3 h post infektion, hpi), fanns en 4-faldig ökning av återvinning av livskraftiga Lm och från 3 till ...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Vi beskriver både in vitro- och in vivo infektion analyser som kan användas för att analysera verksamheten i värd-encoding faktorer.

Med en bakterie patogen att sonden för cellulär och organismnivå-nivå värd Svaren

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Mikrobiella Patogener som replikerar intracellulärt måste så småningom avsluta den infekterade cellen. Vilket, jämfört med andra aspekter av värd patogen interaktioner är relativt understudied. Här beskriver vi tekniker för att analysera patogen efflux.Vi visar hur relativt enkelt assays kan användas för att antingen utvärdera efflux effektivitet eller karakterisera post-efflux patogener De allmänna tekniker som beskrivs här är i stort sett tillämpliga även om specifika patogener värd cell modeller kan skilja sig i kinetik, doser och eventuellt avläsningar. Liksom vid inrättandet av alla försökssystem är det viktigt att tydliga kontroller upprättas som kommer att säkerställa att äkta, biologiska processer observeras i experimentella prover eller kohorter. Demonstrera förfarandet kommer att Petoria Gayle, en doktorand från mitt laboratorium.Till att börja med infektionsexperimentet, använd en pipetter för att lägga till 20 mikroliter av den nyberedda Lm-inokulat till brunnar, med skålen något lutad och pipettspetsen noggrant placerad i överlydningsmedia. Undvik att vidröra brunnens väggar med pipettspetsen. Försiktigt pipettera innehållet i varje brunn för att säkerställa fullständig blandning.Skaka inte eller luta inte plattan nämns nämns för att undvika att LM sprids över brunnens väggar. Återgå cellodling skålen till 37 grader Celsius, fem procent koldioxid inkubator. Använd betingade medier från icke-infekterade celler som spädningsvätska för att förbereda en 10 mikrogram per milliliter gentamicinlösning.Vid 30 minuter efter infektion, tillsätt försiktigt 30 mikroliter av gentamicin lösningen i skålen för att nå en slutlig koncentration av två-punkt-fem mikrogram per milliliter. Försiktigt pipettera innehållet i brunnen för att blanda och returnera cellodlingsskålen till inkubatorn. För att skörda, luta något skålen och försiktigt använda en pipetten för att ta bort hela media från brunnen.Tillsätt punkt-fem milliliter destillerat, sterilt vatten till brunnen. Efter 30 sekunder, överföra den resulterande vatten lysate till en en-punkt-fem milliliter microcentrfuge rör och virvel kraftigt i 10 sekunder. Tillsätt fyra-punkt-fem mikroliter och 50 mikroliter av vattnet lysate till 450 mikroliter av destillerat, sterilt vatten för att förbereda tiofaldiga och hundrafalt utspädningar.Kort virvel för att säkerställa grundlig blandning. Tillsätt 50 mikroliter av de ursprungliga tiofaldiga utspädda och hundrafaldiga utspädda proverna på lysogeny buljong agarplattor, och sprids med hjälp av en tallriksspridare. Till analys för framväxande LM, extrahera 10 mikroliter av överlagring media från skålen och dela upp den i två fem-microliter alikvoter och mikro centrifugrör.Lägg till femmikroliter av DMEM/FCS till en alikvot och lägg till femmikroliter av DMEM/FCS innehållande femmikroliter per milliliter gentamicin till den andra alikvoten som kontroll. Vänta fem minuter i rumstemperatur. Tillsätt 90 mikroliter av destillerat sterilt vatten till varje alikvot och vortexa de två kraftigt i 10 sekunder.Tillsätt sedan 50 mikroliter av provet på LB-agarplattor och sprids med hjälp av en tallriksspridare. Förvara plattorna i 37 grader celsius inkubator i två dagar innan lmkolonier räknas upp. Justera den beredda, råa två-sex-fyra-fyra-sju celler till koncentrationen av en gång 10 till den sjätte cellen per milliliter.Tillsätt en milliliter av provet till brunnar av en sex-väl vävnad kulturplatta. Infektera cellerna med en förberedd Lm inoculum, motsvarande en multiplikitet av infektion av 50. Vid en punkt-fem timmar efter infektion, i en en-punkt-fem milliliter mikrocentrifugrör fylld med 500 mikroliter av fyra procent PFA, samla media från den första uppsättningen av brunnar och placera röret på is.För att samla intracellulär Lm, tillsätt en milliliter av destillerat, sterilt vatten till varje brunn. Efter 60 sekunder överför du den resulterande vattenta till ett enpunkts-fem milliliter mikrocentrifugrör med 500 mikroliter av fyra procent PFA. Vortexa röret kraftigt i 10 sekunder och placera den på is.För återstående brunnar, ta bort media och ersätta med en milliliter av DMEM / FCS med fem-mikrogram per milliliter gentamicin att döda extracellulära Lm.Prompt returnera skålen till inkubatorn. Efter 30 minuter, ta bort media och ersätta med DMEM / FCS utan gentamicin. Efter ytterligare två och fyra timmar, samla media i lysates för andra och tredje gången pekar in i rören och placera dem på is för att kyla.Centrifugrör vid 10, 000 gånger G i sju minuter. Ta bort supernatanten med hjälp av en pipett utan att störa pelleten. Lägg färgning cocktail som innehåller 50 mikroliter av fyra procent PFA och 15 mikroliter av phalloidin i röret och blanda för att avbryta varje pellet.Inkubera rör i mörker vid fyra grader Celsius i 20 minuter. Efter inkubation, tillsätt en milliliter FACS buffert till varje rör och pipetten upp och ner för att blanda. Spinnrör i centrifugen vid 10, 000 gånger G i sju minuter.Ta bort supernatant utan att störa pelleten. För omedelbar användning, dra in varje pellet i 400 mikroliter AV FAX-buffert. Om lagring för senare analys, tillsätt 200 mikroliter av FAX buffert och 200 mikroliter av fyra procent PFA i röret och blanda för att avbryta.Med hjälp av infektionstillstånden i den korta behandlingen med antibiotika gentamicin att eliminera icke-internaliserade Lm, noll-punkt-en-fem procent av vilda-typ Lm återvinns efter en-punkt-fem timmar av co-inkubation med odlade makrofager. I den efterföljande co-inkubationen fanns en fyrfaldig och sju-punkt-femfaldig ökning av återvinning av livskraftiga Lm, som uteslutande representerar intracellulära spridning. Jämförbar profil observerades för Lm stammen som har en hypervirulent prfA under första infektion men inte mellan tre och sex HPI.När prfA ströks från Lm-stammen, finns det en efterföljande minskning av återhämtningen av stammen efter långvarig co-inkubation. När gentamicin tas bort från brunnarna vid sex HPI, extracellulära Lm kan upptäckas en timme senare för både vild-typ och hypervirulenta prfA stammar, men inte för stammen med prfA utgå. Media överlagra både oinfekterade och infekterade makrofager innehöll ljus-spridning, bakterie-storlek partiklar.Men endast media från infekterade makrofager besatt GFP positiva signaler inom storleken gating. En tidsberoende ökning av utseendet på phalloidin-positiva Lm observerades med infekterade makrofager. När plätering ut makrofager i 48-väl vävnad kultur skålen, lämna några brunnar utan celler.Dessa no-cell kontroll brunnar behandlas sedan exakt samma som de cell-innehållande brunnar, i form av tillsats av patogenen, antibiotika, etc. för att säkerställa att experimentella signaler är beroende av förekomsten av värdceller. I likhet med de experiment som visas i figur ett och tre, patogen eller värdfaktorer och eller små molekyler kan testas om deras inverkan på patogen cellulära efflux.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Den<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mus Modell: Studera patogen och värd Bidrag till infektiös kolit

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

En exakt patogen leverans och återvinnings system för murina modeller av sekundär bakteriell pneumoni

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...