Name: using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Fareler insanca bakım için tüm uygun hükümet kılavuzlarınıza uygun olarak tedavi edildi ve kullanmak, laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve bunların kullanımı için tüm bu çalışma Miami Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı tarafından kabul edildi ve kullanım Komitesi (protokol 16-053).
1. enfeksiyon için hücreleri hazırlanması
<ol><li>Fare makrofaj gibi hücre kültürünü ham 264.7 DMEM doku kültürü medya % 10 fetal buzağı serum (bundan böyle ...

<ol>
	<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li><li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA.">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li><li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver.">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression.">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li><li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes.">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).</li><li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection.">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li><li>Bl&#233;riot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection.">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut,+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche.">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li><li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection.">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li><li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells.">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li><li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+(HRI)+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens.">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754 (2013).</li><li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eIF2&#945;+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking.">The eIF2&#945; Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).</li><li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells.">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).</li><li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis.">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).</li></ol>

Onun hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu nedeniyle, Lm enfeksiyon etkisi hücresel aktiviteler soruşturma için ideal bir patojen bir programdır. Ana faktörlerin bir Lm hücresel enfeksiyon11,12,13,14olumlu veya olumsuz yönde etkileyen tespit edilmiştir. İki tür ev sahipliği bizim laboratuvar Perforin-2 ve Heme düzenlenir inhibitörü ile karakterize faktö...

Enfeksiyon tabanlı deneysel modeller bağımlılığını başlangıç durumu koşullar ev sahibi ve patojen, çeşitli patojen bulaşma stratejileri ve patojen ve ana bilgisayar kullanan işlemler atfederek zorluğu nedeniyle doğal olarak zor olan bağlı olarak sonuçlar. Listeria Monositogenez (Lm) bakteri konak savunma yanıt-e doğru onun genetik ve mikrobiyolojik tractability, hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu stratejisini ve nispeten açık nedeniyle soruşturma için ideal bir patojen haline gelmiştir onun cep-organismic düzeyi ve enfeksiyon fenotipleri arasındaki ilişki. Lm hücresel enfeksiyon dört ayrı aşama1ile devam eder: (i) içinde bir çarpıtma; kapalı Lm ile adl hücresel Invasion (II) Lm-yönetmen çarpıtması membran dağılması ve Lm yayın içine sitozol; (III) intracytosolic yineleme; ve her iki bitişik hücreleri (olduğu gibi bir epitel sayfası gibi) enfeksiyon veya soliter hücrelerdeki sonuçları plazma zarı Lm sürümü ekstraselüler ortamın içine (IV) fiziksel nüfuz. Her bu aşamalardan belirli Lmtarafından terfi-kodlanmış faktörler ('virülans faktörleri' anılacaktır), silindiğinde, hücresel ve hayvan modellerinde enfeksiyon kusurları neden. Bu genel enfeksiyon strateji sözde 'sitozolik' patojenler2bir dizi tarafından bağımsız olarak gelişmiştir.
Koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri yaygın olarak tüp bebek her ikisi de değerlendirmek için istihdam (yani, hücresel) olarak içinde vivo de (örneğin, organismic) enfeksiyon sonuçları. Ek olarak içinde vivo enfeksiyonlar, özellikle için onların yüksek hassasiyet patojen işgali ve hücre içi hayatta kalma/yayılması için net bir okuma CFU deneyleri sağlar. CFU deneyleri kapsamlı enfeksiyon etkisi Lm ve konak hücre belirleyicileri analiz etmek için kullanılmaktadır. Bu önceki çalışmalarda hücresel istilası ve intracytosolic çoğaltma çözümlemek için olduğu gibi bilgilendirici, CFU deneyleri bilgimizi, en iyi şekilde Lm enfeksiyon işleminin dördüncü aşamasını izlemek için kullanılmayan,: hücresel kaçış. Burada, biz (bundan böyle 'olarak ortaya çıkması' denir) nasıl hücresel kaçmanın bir yolu CFU tahlil (yanı sıra Akış Sitometresi) izlenebilir ve Lm bu aşaması nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler örnekleri gösteri düzenleyen nispeten basit tarif enfeksiyon döngüsü. Hücresel Lm enfeksiyon döngüsü terminal aşamasının analiz ek patojen ve konak hücre enfeksiyon özgü faktörler ve aktiviteleri tanımlama mümkün yapabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="776">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>110493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10199-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM media&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Gibco&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS - Heat Inactivated&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:128px;">Grow Cells MS</td>
			<td style="width:119px;">MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fischer</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6800 Spectral Analyzer</td>
			<td style="width:128px;">Sony</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe 28G 1/2&#34; 1cc</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 48 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPP Tissue Culture 6 Well Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MIDSCI</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:128px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antigen</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F4/80</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live/Dead</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHC II</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NK 1.1</td>
			<td style="width:128px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a bacterial pathogen to probe for cellular and organismic-level host responses

Hayatta kalmak için ve bir kez ökaryotik hücre içinde prolifere bakteriyel patojenler istihdam stratejileri çeşitli vardır. Sözde 'sitozolik' patojenler (Listeria Monositogenez, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, FRANCISELLA tularensisve Rickettsia'nin spp.) tarafından enfekte hücre sitozol erişim fiziksel ve enzimatik birincil vacuolar membran aşağılayıcı. Bir kez sitozol Bu patojenler hem çoğalırlar yanı sıra yeni hücre bulaştırmak için ana hücresinin plazma zarı nüfuz için yeterli mekanik Kuvvetleri oluşturmak. İşte, L. Monositogenez (Lm) hücresel enfeksiyon döngüsünün terminal bu adımı koloni oluşturan birim testleri ve Akış Sitometresi tarafından sayısal ve nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler etkisi örnekleri bu vermek nasıl göstermektedir işlem. Ayrıca yakın bir ilişkiyi Lm enfeksiyon dinamikler kültürlü hücre tüp bebek bulaşmış ve bu fareler türetilmiş karaciğer hücrelerinin enfekte içinde vivo gösteriyoruz. Bu işlev tabanlı deneyleri oldukça basit ve kolayca keşif dayalı yüksek üretilen iş ekranlar için modülatörler ökaryotik hücre işlevinin için ölçeklendirilebilir.

Patojen ve hücresel enfeksiyon etkileyen ev sahibi olarak kodlanmış faktörlerin rolü değerlendirilmesi Yukarıda açıklanan enfeksiyon koşulları kullanarak, giriş vahşi tipi Lm yüzde 0.15, kültürlü makrofajlar (şekil 1A) ile ortak kuluçka 1,5 saat sonra kurtarılır. Sonraki 1,5 saat, co kuluçka (3 h sonrası enfeksiyon, HPI) kurtarma uygun Lm 4-fold bir artış oldu ve 3 6 HPI için uyg...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses at JoVE.com

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Hücre içi çoğalan mikrobiyal patojenler eninde sonunda enfekte hücreden çıkmalıdır. Hangi, konak patojen etkileşimleri diğer yönleri ile karşılaştırıldığında nispeten az çalışılmıştır. Burada patojen efflux'ü analiz etme tekniklerini tanımlıyoruz.Biz nispeten basit tahliller ya efflux verimliliği değerlendirmek veya post-efflux patojenleri karakterize etmek için kullanılabilir nasıl göstermek Burada açıklanan genel teknikler genel olarak uygulanabilir olsa da belirli patojen konak hücre modelleri kinetik farklı olabilir, dozajlar ve muhtemelen okuma-outs. Herhangi bir deneysel sistemin kurulmasında olduğu gibi, deneysel numunelerde veya kohortlarda gerçek, biyolojik süreçlerin gözlemlemesini sağlayacak net kontrollerin oluşturulması esastır. Prosedürü gösteren Petoria Gayle, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Enfeksiyon deneyi ile başlamak için, çanak biraz eğik ve pipet ucu dikkatle üstteki ortama yerleştirilir, kuyulara taze hazırlanmış Lm inoculum 20 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Pipet ucu ile kuyunun duvarlarına dokunmaktan kaçının. Yavaşça tam karıştırma sağlamak için her kuyunun içeriğini pipet.LM'nin kuyunun duvarlarına yayılmasını önlemek için plakayı sallamayın veya önemli ölçüde eğmayın. Hücre kültürünü 37 santigrat dereceye, %5 karbondioksit kuvöze getirin. Mililitre gentamisin çözeltisi başına 10 mikrogram hazırlamak için dilüent olarak enfekte olmayan hücrelerden klimalı ortam kullanın.30 dakika sonra enfeksiyon, dikkatle mililitre başına iki nokta-beş mikrogram son konsantrasyonulaşmak için çanak içine gentamisin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin. Yavaşça kuyunun içeriğini karıştırmak ve kuvöze hücre kültürü çanak dönmek için pipet. Hasat için, biraz çanak eğmek ve dikkatle kuyudan tüm medya kaldırmak için bir pipet kullanın.Kuyuya 5 mililitre distile, steril su ekleyin. 30 saniye sonra, elde edilen suyu 10 saniye boyunca bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüp ve girdap kuvvetle aktarın. Dört nokta beş mikrolitre ve 50 mikrolitre su damıtılmış, steril su 450 mikrolitre on kat ve yüz kat seyreltme hazırlamak için lysate ekleyin.Kısa bir süre girdap iyice karıştırma sağlamak için. Lysogeny suyu agar plakaları üzerine orijinal on kat seyreltilmiş ve yüz kat seyreltilmiş örnekleri 50 mikrolitre ekleyin ve bir tabak yayıcı kullanılarak yayıldı. Ortaya çıkan LM için teşp etmek için, çanak bölen medya 10 mikrolitre ayıklayın ve iki beş mikrolitre aliquots ve mikro santrifüj tüpler bölün.Bir aliquot'a beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin ve kontrol olarak ikinci aliquot'a mililitre başına beş mikrolitre dmem/FCS içeren beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika bekleyin. Her aliquot ve girdap 10 saniye boyunca şiddetle iki distile steril su 90 mikrolitre ekleyin.Sonra LB agar plakaları üzerinde örnek 50 mikrolitre ekleyin ve bir plaka dağıtıcı kullanarak yayıldı. Lm kolonilerini sayısallandırmadan önce plakaları 37 santigrat derecede iki gün saklayın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hazırlanan, ham iki-altı-dört noktalı yedi hücreyi mililitre başına altıncı hücreye bir kere 10'luk konsantrasyona ayarlayın.Altı kuyulu doku kültürü plakası kuyularına bir mililitre numune ekleyin. 50 enfeksiyon çokluğu karşılık gelen, hazırlanmış bir Lm inoculum ile hücreleri enfekte. Enfeksiyon sonrası bir noktadabeş saat, bir nokta-beş mililitre likit mikrosantrifüj tüp yüzde dört PFA 500 mikrolitre ile dolu, kuyuların ilk kümesinden medya toplamak ve buz üzerinde tüp yerleştirin.Hücre içi Lm toplamak için, her kuyuya bir mililitre distile, steril su ekleyin. 60 saniye sonra, elde edilen suyu bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 500 mikrolitre likit dört%PFA ile. Tüpü 10 saniye boyunca şiddetle girve buza yerleştirin.Kalan kuyular için, medya kaldırmak ve mililitre başına beş mikrogram mililitre gentamicin ile dmem / FCS bir mililitre ile değiştirin mililitre lm.Promptly kuvöz için çanak dönmek öldürmek için. 30 dakika sonra, ortamı çıkarın ve gentamisin olmadan DMEM/FCS ile değiştirin. Başka bir iki ve dört saat sonra, tüpler içine ikinci ve üçüncü kez puan için lysates medya toplamak ve soğuması için buz üzerine yerleştirin.Santrifüj tüpleri 10, 000 kez G yedi dakika. Pipet kullanarak, pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın. Tüp içine yüzde dört PFA ve 15 mikrolitre phalloidin 50 mikrolitre içeren boyama kokteyli ekleyin ve her pelet askıya almak için karıştırın.Tüpleri karanlıkta 20 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her tüp ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için FACS tampon bir mililitre ekleyin. Yedi dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj de spin tüpler.Peletrahatsız etmeden supernatant çıkarın. Hemen kullanım için, FAKS tampon 400 mikrolitre her pelet askıya alın. Daha sonra analiz için depolama, 200 faks tampon ve tüp içine yüzde dört PFA 200 mikrolitre ekleyin ve askıya almak için karıştırın.Antibiyotik gentamisin ile kısa tedavide enfeksiyon koşulları kullanılarak içselleştirilmeyen Lm ortadan kaldırmak için, yabani tip Lm sıfır nokta-bir-beş yüzde kültürlü makrofajlar ile co-inkübatasyon bir nokta beş saat sonra kurtarılır. Sonraki eş-kuluçka, sadece hücre içi proliferasyonu temsil canlı Lm kurtarma dört kat ve yedi nokta beş kat artış oldu. İlk enfeksiyon sırasında hipervirulent prfA'ya sahip lm suşu için karşılaştırılabilir profil gözlendi, ancak üç ile altı HPI arasında değildi.PrfA Lm suşundan silindiğinde, uzun süreli eş kuluçkadan sonra gerilmede bir azalma meydana gelir. Gentamisin altı HPI'deki kuyulardan çıkarıldığında, hücre dışı Lm bir saat sonra hem yabani tip hem de hipervirulent prfA suşları için tespit edilebilir, ancak prfA ile yapılan zorlanma için saptanabilir. Hem enfekte olmayan hem de enfekte olmuş makrofajların örtünmesi, ışık saçılımı, bakteri büyüklüğünde partikül madde içeriyordu.Ancak, sadece enfekte makrofajlardan medya boyutu gating içinde GFP pozitif sinyalleri sahip. Enfekte makrofajlarda phalloidin pozitif Lm görünümünde zamana bağlı bir artış gözlendi. 48-iyi doku kültürü çanak makrofajlar dışarı kaplama zaman, hücre olmadan bazı kuyular bırakın.Bu hücre dışı kontrol kuyuları daha sonra, deneysel sinyallerin konak hücrelerinin varlığına bağlı olduğundan emin olmak için patojen, antibiyotikler vb. eklenmesi açısından hücre içeren kuyularla tamamen aynı şekilde tedavi edilir. Birinci ve üçüncü şekillerde gösterilen deneylere benzer şekilde, patojen veya konak faktörleri ve veya küçük moleküller patojen hücresel efflux üzerindeki etkileri açısından test edilebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...