Name: a spheroid killing assay by car t cells
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Norwegischen Forschungsrat unter Stipendien #244388, #254817 und #284983 unterstützt; der norwegische Krebsgesellschaft (#6829007); Der norwegische Gesundheitsregion Süd-Ost unter Grant #17/00264-6 und #2016006.

1. Generation der Sphäroide von Colorectal Krebs-Zell-Linie
<ol><li>Waschen HCT-116 (stabil auszudrücken, Differenzierung-19-Cluster (CD19) und grüne Fluoreszenz Protein (GFP) ausgestrahlt) Zelle Monolagen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 5 mL für ein 25 cm2 oder 10 mL für ein 75 cm2 Fläschchen). Hinzufügen von Trypsin (0,5 mL für ein 25 cm2 oder 1 mL für ein 75 cm2 Fläschchen) und Zellen bei 37 ° C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie Abl...

<ol>
	<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19.">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells.">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).</li><li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration.">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li><li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern.">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li><li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+on+anticancer+drug+response.">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li><li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-Formation+(Colonosphere)+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer.">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li><li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metastatic+Microenvironment:+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells.">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li><li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma.">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li><li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children.">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li><li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).</li><li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5.">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li></ol>

Die Verwendung von Sphäroide als ein innovatives Tool, um zukünftige Krebsbehandlung zu überprüfen ist ein Feld des wachsenden Interesses in den letzten Jahren geworden. Sphäroide stellen eine Zwischenstufe zwischen klassischen 2D in-vitro-Analyse und in-vivo Bewertung dar. Die Methode weiter hält eine Menge Versprechen bezüglich ihrer Wirksamkeit in Bezug auf Tumor imitiert Mikro-Umgebung sowie Profilierung7gen. Das Protokoll in dieser Publikation vorgestellt wurde von Saheen Et A...

Adoptiveltern Zelltransfer (ACT) repräsentiert die nächste Generation-Krebs-Behandlung. Es stützt sich auf die Injektion von Effektorzellen (T - und NK-Zellen) in einem Patienten. Diese Zellen können genetisch mit einem Rezeptor geändert werden, die zu ihrem Ziel, den Tumor zu führen und zu zerstören. Vor kurzem wurde dieser Ansatz gezeigt, möglich sein, wenn ein gegen den B-Zell-Marker CD19 Chimeric Antigen Rezeptor (Auto) in die Patienten T-Zellen zu töten, seine/ihre Krebs-1eingeführt wurde. Bei Auto, welches eine künstliche Rezeptor, das Design besteht aus spezifischen Antikörperfragmente der Antigen-bindende Domäne auf eine Entität benannten einzelne Kette Variable Fragment (ScFv), reduziert auf die T-Zelle Signalisierung Domänen verknüpft. Zwar gibt es mehrere Entwürfe, die am häufigsten verwendeten Versionen bezeichnet als zweite Generation Auto-Designs, der CD3z für die TCR Signalisierung und einer co-stimulatory Domäne bestehen (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) 1 , 2. Feld Immuntherapie geleitet die meisten ihre Aufmerksamkeit auf diese neue Form des Gesetzes, wenn CD19 CAR-T-Zellen wirksam zahlreiche Patienten mit B-Zell-Tumoren3,4 behandelt. Nach diesem Erfolg versuchten Forscher ähnliche Entwürfe zu nutzen, indem Sie auf andere Epitope bei soliden Tumoren mit begrenztem Erfolg. Der Mangel an spezifischen Tumorantigenen und den härteren Tumor Mikroumgebungen gerendert CAR T Zellen leider weniger effektiv gegen solide Tumore5.
Setzen derzeit, die am häufigsten verwendeten in Vitro Validierungsstrategien auf zweidimensionale (2D) Systeme, die nur ein Fragment der bereits genannten soliden Tumoren Herausforderungen anzugehen. Klassisch, beinhalten 2D in-vitro- Systeme eine Mischung aus Auto-T-Zellen und Ziel Krebszelllinien als Monolagen zur Beurteilung der Funktionalität und Spezifität dieser Effektor-Zellen. Obwohl diese Strategien wichtige und entscheidende Teile des Studiums sind, sie nicht die komplexe Morphologie und dreidimensionale (3D) Struktur der Krebs Zellen6berücksichtigen. Krebszellen in 3D Systeme, genannt Sphäroide, kultiviert erwerben neue phänotypische Merkmale durch Veränderungen im gen Ausdruck Profil7, in dem die Anerkennung durch die umgeleiteten Effektorzellen beeinflussen könnten. Birgersdotter und Kollegen gezeigt, dass eine Hodgkin Lymphom (HL) Zell-Linie, wenn nur in einem 3D Culture Modell gewachsen ein Genexpressionsprofil erwirbt, die primären Tumor Proben8ähnlich ist. Daher culture Sphäroide oder ähnliche 3D Methoden Angebot relevanter in Vitro Modellen im Gegensatz zu standard-2D-Systeme. Solche Systeme sind auch ähnlich wie in vivo-Studien, die als der letzte Schritt im Prozess Validierung eines bestimmten Autos gesehen werden. Wenn man bedenkt, dass 2D Systeme versagen, die Morphologie des Krebs-Cluster zu imitieren, Sphäroide bieten ähnliche Formationen zur Beurteilung der Funktionalität des CAR-T-Zellen vor dem in-vivo-Modelle. In einer Studie, Pickl Et Al. festgestellt, dass ein Sphäroid Modell des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (HER2) Krebszellen überexprimiert ähnliche Signalisierung Profile zur in-vivo Modelle9demonstriert. Dies unterstützt weiter die Sphäroide relevant und Nähe zu in Vivo Beurteilung der Auto-T-Zellen bieten. Darüber hinaus Auto T-Zell-Validierung gegen Sphäroide könnte helfen, ihre Wirksamkeit mehr kritisch zu beurteilen und verhindern, dass einige der Designs bewegt, in vivo Studien vorzeitig10; so, zur ethisch betreffenden Forschung durch weniger Tiere zu opfern. Darüber hinaus sind Protokolle mit Sphäroide nicht teurer als klassische 2D Systeme und viel schneller im Vergleich zu klassischen in Vivo Studien. Zusammen genommen, kann man voraussagen, dass die Einbeziehung der Sphäroid Studien gängige Praxis bald, in vitro und in vivo Studien zu verknüpfen.
Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung der Sphäroide aus der Dickdarm-Krebs-Zell-Linie HCT-116. Diese Zelllinie wurde geändert, um das menschliche CD19-Molekül empfindlich gegen CD19 Auto T-Zellen zu rendern und eine klare Einschätzung der Tötung mit einer klinisch validierte Auto-Konstrukt zum Ausdruck bringen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Lot Number: RNBG7037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm&#178; growth area flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430639</td>
			<td>Lot Number: 2218002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm&#178; growth area flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2705</td>
			<td>Lot Number: 3718006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SIGM-ALDRICH</td>
			<td>T3924-100ml</td>
			<td>Lot Number: SLBTO777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml</td>
			<td>Life Technology (Gibco)</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>Lot Number: 1926384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Lot Number: 08Q3066K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Lot Number: 1904924A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Lot Number: 1886513</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, round bottom</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-1797</td>
			<td>Lot Number: 33117036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11132D</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td>
			<td>BioNordika</td>
			<td>BE02-060Q</td>
			<td>Lot Number: 8MB036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>A2596102</td>
			<td>Lot Number: 1939319</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2 Proleukin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Lot Number: 505938M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>4641</td>
			<td>Lot Number: 17A1025-122117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-672</td>
			<td>Lot Number: 89094-672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-1867</td>
			<td>Lot Number: 19317044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD19-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Lot Number: 4016990 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-066-072</td>
			<td>Lot Number: 129474: 
			RRID: AB_2338583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554061</td>
			<td>Lot Number: 5191579: 
			RRID: AB_10053328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT 116 Colorectal Carcinoma Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a spheroid killing assay by car t cells

Immuntherapie hat ein wachsendes Interesse an den Kampf gegen den Krebs sonst unbehandelbaren entwickelt. Unter allen immuntherapeutischen Methoden umgeleitet chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zellen die spektakulärsten Ergebnisse, insbesondere mit pädiatrischen B-akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL). Klassische Validierungsmethoden Auto T-Zellen verlassen sich auf die Verwendung von Spezifität und Funktionalität Assays der Auto-T-Zellen gegen die Ziel-Zellen in Suspension und Xenograft-Modelle. Leider, in-vitro-Beobachtungen sind oft Ergebnisse in Vivo entkoppelt und einiges an Aufwand und Tiere könnte erspart werden, indem man einen weiteren Schritt: die Verwendung von 3D Culture. Die Produktion der Sphäroide aus potenziellen Zielzellen, die 3D-Struktur der Tumorzellen zu imitieren, wenn sie in das Tiermodell aufgeprägt sind stellt eine ideale Alternative dar. Hier berichten wir über eine erschwingliche, zuverlässige und einfache Methode, um Sphäroide aus einem ausgestrahlt kolorektalen Zelllinie als ein Validierungstool für Adoptiv-Therapie (hier am Beispiel CD19 Auto T-Zellen) produzieren. Diese Methode ist gekoppelt mit eine erweiterte live-imaging-System, das Sphäroid Wachstum verfolgen kann, Effektor Zellen Zytotoxizität und Tumor Zellapoptose.

Wie in Abbildung 1ersichtlich ist, ist es durch Durchflusszytometrie Ausdruck von CD19 Auto auf T-Zellen (Abbildung 1A) und das Niveau der CD19 auf Tumorzelllinien HCT116 (Abbildung 1 b) zu überprüfen, das entscheidend. Abbildung 2 veranschaulicht das Ergebnis einer typischen Sphäroid-Experiments. Das automatisierte bildgebenden Gerät nimmt Bilder in vier verschieden...

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A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immuntherapie über die Beurteilung der Immunzellzytotoxizität gegen 3D-Strukturtumorzellen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfach ist und fortschrittliche Bildgebungstechnologie und einen empfindlichen immunologischen Test kombiniert. Beginnen Sie mit dem Waschen der darmen Krebszelllinie von Interesse mit fünf Milliliter PBS und entfernen Sie die Zellen aus dem Kolbenboden mit 0,5 Milliliter Trypsin für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Bestätigung der Ablösung unter dem Mikroskop neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym mit 10 Millilitern des kompletten Mediums und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter frisches komplettes Medium für das Zählen aus und setzen Sie die Zellen bei einer 1,5-mal 10-bis-dritten Zelle pro Milliliter-Konzentration wieder aus. Dann säen Sie 200 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen der 96-well runden Bodenplatte und legen Sie die Platte in einem automatisierten Bildgebungsgerät in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit.Melden Sie sich bei der Erfassungssoftware des Geräts an und wählen Sie Schedule to Acquire, Launch Add Vessel, Scan on Schedule und Create Vessel New aus. Wählen Sie als Nächstes den Scantyp Spheroid aus und wählen Sie die entsprechenden Hellenfeld- und Fluoreszenzkanäle aus. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 10-fache ein und wählen Sie das Plattenmodell und seine Position in der Schublade des Bildgeräts aus.Wählen Sie die Position der zu bebildernden Bohrungen aus, und geben Sie die Beschreibung des Experiments ein, einschließlich name, Zelltyp und Anzahl der Zellen. Wählen Sie für die Analyseeinrichtung die Option Analyse bis später verzögern aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitachse, und wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus, und legen Sie Scans alle bis vier Stunden und insgesamt bis 24 Stunden hinzu. Stellen Sie dann die Startzeit mindestens eine Stunde nach der Inkubation im automatisierten Bildgebungsgerät ein.Um den Sphäroid-Wachstumsfortschritt zu überprüfen, melden Sie sich alle zwei Tage bei der Bildverarbeitungssoftware an und wählen Sie Aktuelle Scans anzeigen aus. Doppelklicken Sie auf das Experiment von Interesse und wählen Sie Brightfield im Bildkanal-Bedienfeld aus. Verwenden Sie dann das Werkzeug Bild-Features messen, um den Durchmesser der Sphäroide zu messen, und fügen Sie 50 Mikroliter des gesamten Mediums pro Brunnen an Tag vier hinzu, um alle mittleren Verdunstungseffekte zu begrenzen.Wenn die Sphäroide die entsprechende experimentelle Größe erreichen, winkeln Sie die Platte sorgfältig an und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 150 Mikroliter komplettes Medium aus jedem Brunnen sanft zu entfernen, ohne die Sphäroide zu stören. Als nächstes ersetzen Sie das ausrangierte Medium durch 50 Mikroliter einer einbis 200 Lösung von Annexin V Red und legen Sie die Platte für 15 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator. Zentrifuge transduzierte CAR CD19 T-Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und setzen das Pellet in zwei Millilitern des kompletten Mediums wieder auf.Nach dem Zählen die Zellen auf zwei mal 10 bis fünf Liter pro Milliliter vollständiger mittlerer Konzentration verdünnen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter CAR CD19 T-Zellen zu jedem sphäroidhaltigen Brunnen hinzu und geben Sie die Platte an das automatisierte Bildgebungsgerät zurück. Wählen Sie in der Erfassungssoftware "Zu erwerben planen" aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Scan-Timeline.Wählen Sie Zeitleiste bearbeiten aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Scangruppe, um sie zu löschen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf die Zeitleiste und wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus und legen Sie Scans alle auf 1 1/2 Stunden und für insgesamt bis zu 24 Stunden fest. Stellen Sie dann die Bildstartzeit auf mindestens eine Stunde nach Beginn der Inkubation im automatisierten Bildverarbeitungsgerät ein und wählen Sie Schedule Scans speichern aus.Für die automatisierte Bildanalyse wählen Sie in der Scansoftware Aktuelle Scans anzeigen und Analyse starten aus. Wählen Sie Neue Analysedefinition und Analysetyp Spheroid erstellen aus, und legen Sie die zu analysierenden Bildkanäle fest. Wählen Sie mindestens 10 repräsentative Bilder aus, und zeigen Sie eine Vorschau des standardmäßigen Analyseverfahrens für den gesamten Bildstapel an.Ändern Sie die Parameter für die Hellfeldmaske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen. Ändern Sie die Parameter für die grüne Maske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen. Ändern Sie die Parameter für die rote Maske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen.Achten Sie darauf, das beste Signal über Rauschen und Empfindlichkeit über Spezifitätsverhältnisse zu erreichen, wobei Sie bedenken, dass Sie nicht in der Lage sein werden, eine Reihe von Parametern zu finden, die es ermöglichen, jedes Ereignis zu jedem Zeitpunkt zu erfassen. Starten Sie dann den Analyzer. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die Messung des Interesses, und wählen Sie die analysierte Datei und die Option Diagrammmetriken aus.Wählen Sie die gewünschten Metriken, den Scan und den Brunnen aus. Klicken Sie auf Daten exportieren, um die ausgewählten Metriken in verschiedenen Dateiformaten zu extrahieren. Um die Bilder zu extrahieren, wählen Sie dann die analysierte Datei aus und wählen Sie Bilder und Filme exportieren aus.CD19 CAR-Expression auf transduzierten T-Zellen und CD19-Expression auf transduzierten Darmkrebszellen können durch Durchflusszytometrie bestätigt werden. Hier kann das Ergebnis eines typischen Sphäroidexperiments beobachtet werden. Im Gegensatz zu Mock-T-Zellen sind CD19 CAR T-Zellen in der Lage, die von Darmkrebszellabgeleiteten Sphäroide gezielt abzutöten, was die Anzahl der lebenden Tumorzellen stark verringert.Die Verfolgung der Entwicklung der gesamten grünen und roten Signale innerhalb der Sphäroidgrenzen im Laufe der Zeit zeigt, dass kurz nach cd19 CAR T Zellinjektion, die Größe der Sphäroide schrumpft schnell, wie die Apoptose-Signal schnell erhöht. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Toxizitätstests, Zellmigrationstests oder Sphäroidstrukturmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Arzneimittelscreening, zur T-Zell-Motilität bzw. zur Sphäroidbildung zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Forschung

Krebsforschung

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...