Name: a spheroid killing assay by car t cells
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00
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이 작품에서 보조금 #244388, #254817 그리고 #284983; 노르웨이 연구 위원회에 의해 지원 되었다 노르웨이 암 협회 (#6829007); 노르웨이 건강 지역 남쪽 동쪽 그랜트 #17/00264-6와 #2016006.

1. 대 장 암 세포 선에서 Spheroids의 생성
<ol><li>씻어 HCT 116 (클러스터 차별화 19 (CD19) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 불리고 안정적) 셀 monolayers 인산 염과 식 염 수 (PBS, 25 cm2 또는 75 c m2 플라스 크에 10 mL 5 mL) 버퍼링. 트립 신 (0.5 mL 25 c m2 에 대 한 또는 75 c m2 플라스 크 1 mL)을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.</li>
	<li>현미경으로 세포 분리를 확인 하 ?...

<ol>
	<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19.">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells.">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).</li><li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration.">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li><li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern.">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li><li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+on+anticancer+drug+response.">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li><li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-Formation+(Colonosphere)+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer.">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li><li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metastatic+Microenvironment:+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells.">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li><li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma.">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li><li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children.">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li><li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).</li><li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5.">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li></ol>

미래의 암 치료의 유효성을 검사 하는 혁신적인 도구 spheroids 사용 하 여 지난 몇 년 동안에서 성장 관심 분야 되고있다. Spheroids 클래식 2D 생체 외 분석과 생체 조건 평가 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 추가 방법은 종양 미세 환경 유전자 프로 파일링7뿐만 아니라 흉내 낸 측면에서 그들의 힘에 관한 약속을 많이 보유 하고있다. 이 책에서 제시 하는 프로토콜은 Saheen에서 적응<em...

입양 세포 이동 (ACT)는 다음 세대 암 치료를 나타냅니다. 그것은 환자에 효과 기 세포 (T-또는 NK-세포)의 주입에 사용합니다. 이 세포는 유전자 그들 그들의 목표는 종양을 안내 하 고 그것을 파괴 하는 수용 체와 함께 수정할 수 있습니다. 최근이 방법은 공상 항 원 수용 체 (차) B-세포 마커 CD19에 대 한 감독을 죽 일 자신의 암1환자 T 세포에 도입 되었다 때 가능한 것으로 표시 했다. 인공 수용 체 자동차의 경우 디자인 구성 특정 항 체 파편의 바인딩 도메인은 엔터티 지정 된 단일 체인 변수 조각 (scFv), 감소 하는 항 T-세포 신호 도메인에 연결. 여러 디자인을 확인 하 고는, 가장 일반적으로 사용 되는 버전 2 세대의 자동차 디자인으로 이루어져 TCR 신호에 대 한 CD3z 및 co-stimulatory 도메인 참조 (CD28, 4-1BB, OX40, 등.) 1 , 2. immunotherapy 필드 CD19 자동차-T 세포 efficaciously B 세포 악성 종양3,4수많은 환자를 치료 법의 새로운 형태에 그것의 주의의 대부분을 감독. 이 성공 연구원은 제한 된 성공 단단한 종양에 대 한 다른 epitopes를 대상으로 비슷한 디자인을 악용 하려고 합니다. 불행 하 게도, 종양 관련 항 원 및 자동차 T 렌더링 엄격한 종양 microenvironments의 부족 단단한 종양5쪽으로 더 적은 효과적인 세포.
현재, 가장 일반적으로 사용 된 생체 외에서 유효성 검사 전략만 이미 언급 한 고체 종양도 전에 조각 하는 2 차원 (2D) 시스템에 의존 합니다. 고전적인, 2D 생체 외에서 시스템 기능 및 이러한 효과 기 세포의 특이성을 평가 하기 위해 monolayers로 차 T 세포와 대상 암 세포 라인의 혼합물을 포함 한다. 이러한 전략은 연구의 중요 하 고 중요 한 부분, 하지만 그들은 복용 하지 마십시오 고려 사항으로 복잡 한 형태와 암 세포6의 3 차원 (3D) 구조. 3D 시스템, spheroids로 배양 암 세포 유전자 식 프로필7, 리디렉션된 effector 세포에 의해 인식에 영향을 줄 수 있는 변화를 통해 새로운 phenotypic 특성을 획득 합니다. Birgersdotter와 동료 Hodgkin 림프 종 (HL) 셀 라인 3D 문화 모델에만 성장 하는 때 유전자 식 프로필 기본 종양 샘플8유사한 취득 하는 것을 설명 했다. 따라서, spheroids 또는 유사한 3D 방법론 제공 표준 2D 시스템 반대로 체 외 모델에 더 많은 관련 문화. 이러한 체계는 또한 유사한 vivo에서 연구는 특정된 자동차의 유효성 검사 과정에서 마지막 단계로 볼 수 있습니다. 2D 시스템 암 클러스터의 형태를 모방 하지 고려 spheroids 제공 하기 전에 차 T 세포의 기능을 평가 하기 위해 비슷한 형성 vivo에서 모델. 한 연구, Pickl 외. 인간 표 피 성장 인자 수용 체 (HER2) 암 세포 overexpressing의 회전 타원 체 모델 vivo에서 모델9유사한 신호 프로필 증명 확인. 이 더 더 적절 하 고 주변에-에서 비보의 평가 차 T 세포를 제공 하는 spheroids을 지원 합니다. 또한, 자동차 T-셀 유효성 검사 spheroids에 대 한 그들의 효능을 좀 더 비판적으로 평가 하 고 vivo에서 연구 중간 이동에서 일부 디자인을 방지 도움이 될 수도10; 따라서, 적은 동물을 희생 하 여 윤리적으로 관련된 연구에 기여. 또한, spheroids를 사용 하 여 프로토콜 되지 않는 더 비싼 클래식 2D 시스템 보다 훨씬 더 빨리 클래식 vivo에서 학문에 비해. 함께 촬영 한 회전 타원 체 연구의 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 연결 하는 표준 연습을 곧 될 것입니다 예측할 수 있습니다.
여기, 우리는 결 장 암 세포 선 HCT 116에서에서 spheroids의 준비를 제시. 이 셀 라인 CD19 자동차 T 세포에 민감한 렌더링 임상 검증된 차 구문을 사용 하 여 살인의 명확한 평가 제공 하 고 인간의 CD19 분자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Lot Number: RNBG7037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm&#178; growth area flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430639</td>
			<td>Lot Number: 2218002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm&#178; growth area flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2705</td>
			<td>Lot Number: 3718006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SIGM-ALDRICH</td>
			<td>T3924-100ml</td>
			<td>Lot Number: SLBTO777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml</td>
			<td>Life Technology (Gibco)</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>Lot Number: 1926384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Lot Number: 08Q3066K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Lot Number: 1904924A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Lot Number: 1886513</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, round bottom</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-1797</td>
			<td>Lot Number: 33117036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11132D</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td>
			<td>BioNordika</td>
			<td>BE02-060Q</td>
			<td>Lot Number: 8MB036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>A2596102</td>
			<td>Lot Number: 1939319</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2 Proleukin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Lot Number: 505938M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>4641</td>
			<td>Lot Number: 17A1025-122117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-672</td>
			<td>Lot Number: 89094-672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-1867</td>
			<td>Lot Number: 19317044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD19-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555413</td>
			<td>Lot Number: 4016990 
			RRID: AB_395813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-066-072</td>
			<td>Lot Number: 129474: 
			RRID: AB_2338583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554061</td>
			<td>Lot Number: 5191579: 
			RRID: AB_10053328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT 116 Colorectal Carcinoma Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a spheroid killing assay by car t cells

Immunotherapy는 다르게 untreatable 암와의 싸움에서 성장 관심 분야를 되었다. 모든 immunotherapeutic 방법 중 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 특히 소아 B 급성 림프 구성 백혈병 (B-모두)와 함께 가장 아름 다운 결과 얻은 리디렉션됩니다. 클래식 유효성 검사 메서드가 자동차 T 세포의 특이성의 사용 정지에서 및이 종이 식 모델에서 대상 셀에 대 한 자동차 T 세포의 기능 분석에 의존합니다. 불행 하 게도, 생체 외에서 관측은 종종 vivo에서 얻은 결과에서 분리 하 고 다른 단계를 추가 하 여 많은 노력 및 동물을 아끼지 수: 3D 문화를 사용 하 여. 그들은 동물 모델에 engrafted는 때 종양 세포의 3 차원 구조를 모방 하는 잠재적인 대상 셀에서 spheroids의 생산 이상적인 대안을 나타냅니다. 여기, 우리는 (여기 CD19 자동차 T 세포에 의해 exemplified) 입양 세포 치료에 대 한 유효성 검사 도구로 불리고 장 셀 라인에서 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 쉬운 방법 보고. 이 메서드는 회전 타원 체 성장 따를 수 있는 고급 라이브 이미징 시스템으로 결합, 이펙터 세포 세포 독성 그리고 종양 세포 apoptosis.

그림 1에서 볼 수 있듯이 그것은 cytometry에 의해 T 세포 (그림 1A)에 CD19 자동차의 표현과 HCT116 종양 세포 라인 (그림 1B)에 CD19의 레벨의 수준을 확인 중요 합니다. 그림 2 는 전형적인 회전 타원 체 실험 결과 예로 보여주. 자동화 된 이미징 장치는 4 개의 다른 채널에서 사진을 찍는: 밝?...

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A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

이 방법은 3D 구조 종양 세포에 대한 면역 세포 세포 독성의 평가에 대한 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 간단하고 고급 이미징 기술과 민감한 면역 학적 분석법을 결합한다는 것입니다. PBS의 5 밀리리터로 관심있는 대장암 세포 라인을 세척하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 트립신의 0.5 밀리리터로 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다.현미경으로 분리를 확인한 후, 완전한 배지의 10 밀리리터로 세포 해리 효소를 중화시키고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 밀리리터 농도당 세 번째 세포에 1.5배 10회에서 세포를 재보일시 하여 셀을 계산하고 재중단하기 위해 5밀리리터의 신선한 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 세포를 96웰 원형 바닥 플레이트의 각 우물로 시드하고 5%CO2 및 95%의 습도를 가진 37도 섭씨 인큐베이터 내부에 자동 이미징 장치에 플레이트를 배치합니다.장치의 인수 소프트웨어에 로그인하고 획득 할 일정을 선택, 선박 추가 를 시작, 일정에 스캔하고, 선박 새 만들기. 다음으로, 스캔 유형 Spheroid를 선택하고 관심의 적절한 밝은 필드 및 형광 채널을 선택합니다. 배율을 10배로 설정하고 이미징 장치 서랍 내에서 플레이트 모델 과 그 위치를 선택한다.이미지화할 우물의 위치를 선택하고 이름, 셀 유형 및 셀 수를 포함하는 실험의 설명을 입력합니다. 분석 설정의 경우 나중에 분석 연기를 선택하고 타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 을 선택하고 스캔 추가를 4시간 마다 설정하고 총 24시간 동안 검색 추가를 설정합니다. 그런 다음 자동 이미징 장치에서 인큐베이션 후 적어도 1시간으로 시작 시간을 설정합니다.스페로이드 성장 진행 상황을 확인하려면 2일마다 이미징 소프트웨어에 로그인하여 최근 스캔 보기를 선택합니다. 관심 있는 실험을 두 번 클릭하고 이미지 채널 패널에서 브라이트필드를 선택합니다. 그런 다음 측정 이미지 특징 도구를 사용하여 스페로이드의 직경을 측정하고, 4일째에 50마이크로리터의 완전한 배지를 추가하여 중간 증발 효과를 제한합니다.스페로이드가 적절한 실험 크기에 도달하면 플레이트를 조심스럽게 각도로 조정하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 스페로이드를 방해하지 않고 각 우물에서 150 마이크로리터의 완전한 매체를 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 버려진 배지를 1~200개의 부속서 V 레드용액의 50마이크로리터로 교체하고 15분 동안 세포 배양 배양배기에 플레이트를 배치한다. 원심분리기는 15밀리리터 원판 튜브에서 CAR CD19 T 세포를 변형시키고 완전한 배지의 2밀리리터로 펠릿을 재해석하였다.계산 후, 완전한 중간 농도의 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 2 회 10으로 세포를 희석. 그런 다음 CAR CD19 T 셀 100마이크로리터를 각 스페로이드 함유에 잘 추가하고 플레이트를 자동화된 이미징 장치로 되돌려 놓습니다. 획득 소프트웨어에서 획득 일정을 선택하고 스캔 타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.타임라인 편집을 선택하고 스캔 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 삭제합니다. 타임라인을 다시 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 집합을 선택하고 스캔 추가를 1 1/2시간, 총 24시간 동안 설정합니다. 그런 다음 이미징 시작 시간을 자동화된 이미징 장치에서 인큐베이션이 시작된 후 최소 1시간으로 설정하고 일정 스캔 저장을 선택합니다.자동화된 이미지 분석을 위해 스캔 소프트웨어에서 최근 검사 보기 및 시작 분석을 선택합니다. 새 분석 정의 및 분석 유형 Spheroid 만들기를 선택하고 분석할 이미지 채널을 설정합니다. 최소 10개의 대표 이미지를 선택하고 전체 이미지 스택에서 기본 분석 절차를 미리 봅타입니다.밝은 필드 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다. 녹색 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다. 빨간색 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다.특이성 비율에 비해 노이즈와 감도에 대한 최상의 신호를 달성하기 위해 주의해야 하며, 매 지점에서 모든 이벤트를 캡처할 수 있는 매개 변수 집합을 찾을 수 없습니다. 그런 다음 분석기를 시작합니다. 분석이 완료되면 관심 측정을 추출하고 분석된 파일 및 그래프 메트릭 옵션을 선택합니다.관심 있는 메트릭, 스캔 및 우물을 선택합니다. 데이터 내보내기를 클릭하여 선택한 메트릭을 여러 파일 형식으로 추출합니다. 그런 다음 이미지를 추출하려면 분석된 파일을 선택하고 이미지 및 영화 내보내기를 선택합니다.CD19 CAR 발현은 트랜스포메이트 된 대장암세포에 대한 트랜스포메이트 T 세포 및 CD19 발현을 유동 세포측정에 의해 확인할 수 있다. 여기서, 전형적인 스페로이드 실험의 결과를 관찰할 수 있다. 모의 T 세포와 달리, CD19 CAR T 세포는 특히 대장암 세포 세포 세포 유래 스페로이드를 죽일 수 있으며, 살아있는 종양 세포의 수를 크게 감소시다.시간이 지남에 따라 스페로이드 경계 내에서 전체 녹색 및 빨간색 신호의 진화를 추적하면 CD19 CAR T 세포 주입 직후, 세포 사멸 신호가 빠르게 증가함에 따라 스페로이드의 크기가 빠르게 축소된다는 것을 알 수 있습니다. 이 절차에 따라 독성 애세, 세포 이동 액세 또는 스페로이드 구조 측정과 같은 다른 방법은 약물 스크리닝, T 세포 운동성 또는 스페로이드 형성에 대한 추가 질문에 각각 답하기 위해 수행될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

연구

암 연구학

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...