Name: diagnosis of hirschsprung's disease by immunostaining rectal suction biopsies for calretinin, s100 protein and protein gene product 9.5
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00
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Die Autoren danken Weibing Tang für seine große Hilfe bei der Bereitstellung des Drehortes. Dieser Artikel wird von der Public Welfare Research unterstützt, und Sonderfonds wurden von der National Health and Family Planning of China (Grant No.201402007) erhalten.

Dieses Protokoll wurde vom Research Ethics Board des Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology genehmigt.
1. Rectal Suction Biopsie
<ol><li>Führen Sie die rektale Saugbiopsie durch einen gut ausgebildeten Kinderchirurgen und einen Assistenten mit einem Rbi2-Saugbiopsiesystem durch, nachdem Sie vom Vormund eine informierte Einwilligung erhalten haben.<ol>
<li>RSB bei Patienten durchführen, die folgende Indikationen haben: Unfähigkeit, Mekonium bei Säuglingen zu passi...

<ol>
	<li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung's+disease:+A+bridge+for+science+and+surgery.">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung's+disease:+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies.">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li><li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+We+Stop+Looking?+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease.">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li><li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin+immunohistochemistry:+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease.">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li><li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung's+disease.">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li><li>Monforte-Mu&#241;oz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis:+a+&amp;#34;positive&amp;#34;+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung's+disease.">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &amp;#34;positive&amp;#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li><li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung&#39;s+disease+using+antibodies+to+MAP2,+calretinin,+GLUT1+and+S100.">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung&#39;s disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li><li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease.">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).</li><li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis.">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).</li></ol>

Hier beschrieben wir ein Verfahren mit drei verschiedenen immunhistochemischen Antikörpern, um RBS-Abschnitte für die Diagnose von HD zu verfärben. Die Empfindlichkeit unseres Diagnoseprotokolls betrug 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), und die Spezifität lag bei 100% (95% CI, 0,97-1,00).
Die kritischsten Schritte des Protokolls sind die RSB-und Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Größe der Biopsie bestimmt die Genauigkeit der Färbung. Eine kleine Biopsie liefert nicht genügend Gewebe, um eine ...

Hirschsprungs Erkrankung (HD) ist eine häufige angeborene Darmdarmstörung, die durch einen Mangel an Ganglienzellen in verschiedenen Segmenten des distalenDarms 1 gekennzeichnet ist. Das menschliche, enterische Nervensystem entsteht, wenn die Invasion der embryonalen Zellen abgeschlossen ist. Wenn es eine Störung des Prozesses gibt und die Invasion nicht abgeschlossen ist, wird der Distanzdarm des Neugeborenen aganglionisch2. Dieser potenziell tödliche Zustand wird Hirschsprungs Krankheit genannt. Verbreitung, Beweglichkeit und Darmwachstum sind die drei Hauptbestandteile einer erfolgreichen Kolonisierung.
Die traditionelle Hämatoxylin und Eosin (H & E) kann eine begrenzte submukosmale Biopsie nicht so zufriedenstellend erreichen wie die H-& E-Färbung eines aus der Operation gewonnenen Volldickengewebes. Darüber hinaus ist die Acetylcholinesterase (AChE) Färbung des rektalen Sauggewebes theoretisch eine Herausforderung, da die Empfindlichkeit von 91% nicht ausreichend ist, unddie komplexe Verarbeitung der gefrorenen Abschnitte3,4. Mehrere andere immunhistochemische Marker von Ganglienzellen und Nervenfasern, die in formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Proben verfärbt werden können, werden nach und nach zur Mainstream-HD-Diagnostik. Calretinin ist ein Vitamin D-abhängiges Kalziumbindenprotein, das sich nicht im myenterischen und submukosmischen Plexus von HD-betroffenenSegmenten 5 ausdrückt. S100-Protein wird in Zellen ausgedrückt, die aus dem neuronalen Kamm abgeleitet werden, wie Nervenfasern und Gliazellen, die im Submukosmonalgewebe der HD-betroffenenSegmente 6 oft neuronale Hypertrophie aufweisen. Protein-Gen-Produkt 9.5 (PGP9.5) verfärbt zuverlässig Nervenfasern und Ganglienzellen; Die PGP9.5-Färbung dient als Ergänzung zur Kalretinin-Färbung, insbesondere bei isolierter Hypoganglionose. Doppelfärbung mit S100 und PGP9.5 kann die Falsch-Negativrate senken und die Empfindlichkeit erhöhen. Als Voraussetzung ist, dass die aktuelle Studie eine ausreichende Spezifität und hohe Empfindlichkeit dieser neuartigen Diagnostik gewährleisten soll. Unser neuartiges Protokoll verwendete alle drei Marker für die Diskriminierung von aganglionischen Darm und hypertrophen Nervenfasern. Eine prospektive Studie mit 318 Kindern wurde von unserem Labor durchgeführt und zuvor ohne ein detailliertes Protokoll7veröffentlicht. Das detaillierte Protokoll und die Vorsichtsmaßnahmen werden in diesem Artikel diskutiert. Alle Neugeborenen, die seit der Geburt an einem schweren Defekationsproblem litten, oder Kinder mit chronischer Verstopfung, die andere Volkskrankheiten ausgrenzend ausgrenzten, sind potenzielle Kandidaten für die rektale Saugbiopsie (RSB). Unser neuartiges Protokoll eignet sich zur Färbung nicht nur von RSBs, sondern auch zur Färbung von Biopsien oder chirurgischen Proben, um eine endgültige Diagnose zu stellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>calretinin antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>MAB-0716 170416405c</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-100 antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>Kit-0007</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGP9.5 antibody</td>
			<td>Shanghai long island antibody Co. Ltd</td>
			<td>R-0457-03</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhancer reagent</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>KIT-9902-A 170416405a</td>
			<td>antibody: secondary antibody A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>KIT-9902-B</td>
			<td>antibody: secondary antibody B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit (containing reagent A B and C)</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>DAB-0031</td>
			<td>staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat incubator</td>
			<td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rbi2 suction rectal biopsy system</td>
			<td>Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia</td>
			<td>CP1200 HP1000 SS1000</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>leica RM2016</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid sodium citrate buffer(100X)</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>MVS-0101</td>
			<td>antigen retrieval buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pathological tissue dehydrator</td>
			<td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td>
			<td>JT-12F</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagnosis of hirschsprung's disease by immunostaining rectal suction biopsies for calretinin, s100 protein and protein gene product 9.5

Hirschsprungs Krankheit (HD) ist eine angeborene Darmerkrankung, die sich klinisch als Unfähigkeit manifestiert, Mekonium bei Säuglingen oder als langfristige Verstopfung bei Kindern zu passieren. Die Rectal-Saugbiopsie (RSB) zur Bestimmung des Fehlens von Ganglienzellen und der neuronalen Hypertrophie ist derzeit der genaueste Test für die Diagnose von HD. Der traditionellen Hämatoxlin-Eosin-Färbung fehlt es an Sensibilität und Spezifität. Die Acetylcholinesterase-Färbung kann aufgrund ihres komplexen Prozesses nicht weit verbreitet sein. Unser neuartiges Protokoll der Immunfärbung für Kalretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), das wir an RSBs durchgeführt haben, weist hohe Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten von 96,49% (95% Vertrauensintervall, 0,88-0,99) und 100% (95% Zuversicht auf Intervall, 0,97-1.00), bzw. Die HD-betroffenen Segmente treten oft als das Fehlen des Ausdrucks von Calretin, S100-Protein und PGP9.5 auf, die Marker der neuronalen Hypertrophie im submukosmischen Gewebe sind. Dieses Protokoll beschreibt den detaillierten Arbeitsprozess dieser neuen Diagnosemethode.

Insgesamt waren 318 Patienten in unsere Studie aufgenommen worden. Alle Patienten unterliefen RSB, und das Gewebe wurde für Calretinin, S100 und PGP9.5 gefärbt. Die Diagnose, die auf unserem neuartigen Protokoll basiert, war HD in 97 Fällen, Nicht-HD in 213 Fällen und Verdacht HD in 8 Fällen. Unter den 132 chirurgischen Patienten wurden 99 Patienten nach der Operation durch Immunfärbung von Volldickenproben mit HD diagnostiziert. Die Färbung der S100 und PGP9.5 zeigte, dass 92% bzw...

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Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Immunfärbung von rektalen Absaugbiopsien für Calretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5. Diese neuartige Adjuvan-Diagnostik für Hirschsprungs Krankheit hat bevorzugt Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten.

Diagnose der Hirschsprung-Krankheit durch die Immunofelflecken-Rectal Suction Biopsien für Calretinin, S100 Protein und Protein Gene Produkt 9.5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Diese Methode kann helfen, Fragen bei der Diagnose der Hirschsprung-Krankheit zu beantworten. Die Methode und Funktionen dieser Technik, wenn Sie Protokoll folgen, weist eine hohe Empfindlichkeit und die Spezifitätsraten, die gleichzeitig prozessieren. Demonstriert wird das Verfahren von Mijing Fang, einem Techniker aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Fixierung der rektalen Saugbiopsien in fünfmal dem Volumen des Gewebes in 4%Paraformaldehyd für sechs Stunden bei Raumtemperatur. Dehydrieren Sie das fixierte Gewebe 11 Stunden lang in einem pathologischen Gewebedehydrator und betten Sie das verarbeitete rektale Saugbiopsiegewebe in Paraffinblöcke ein. Schneiden Sie die Blöcke auf einem Mikrotom, bis eine vollständige Schnittebene des Gewebes exponiert ist.Verwenden Sie dann das Mikrotome, um einen 0,4 Mikrometer Abschnitt des eingebetteten Gewebes zu erhalten. Platzieren Sie 45 bis 50 Grad Celsius Wasser, damit sich die Abschnitte in einen flachen Plan ausbreiten können. Die abgeflachten Abschnitte auf Glasrutschen übertragen und drei bis fünf Stunden in einem 60 Grad Celsius Ofen backen.Platzieren Sie die deparaffinisierten Dias in zwei 15-minütige Xylolwechsel, gefolgt von ihrer Hydratation in sequenziellen fünfminütigen Ethanol-Eintauchen. Dann spülen Sie die Dias in Umkehrosmose gereinigtes Wasser für weitere fünf Minuten. Für die Antigen-Retrieval, legen Sie die Dias in einem Coplin Färbung Glas der Retrieval-Lösung und legen Sie das Glas in ein vorgeheiztes Bad mit kochendem Wasser.Nach 20 Minuten das Glas ca. 10 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen lassen und die Dias vorsichtig mit PBS abspülen. Verwenden Sie dann einen hydrophoben Marker, um jeden Gewebeabschnitt einzukreisen und die Dias in eine nasse Box zu legen. Um Peroxidate zu blockieren, fügen Sie zwei oder drei Tropfen 3% Wasserstoffperoxidlösung auf jedes Gewebe und legen Sie die Dias bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.Am Ende der Inkubation spülen Sie die Dias mit drei fünfminütigen PBS-Washes, gefolgt von einer Blockierung mit 5% Rinderserumalbumin für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes entsorgen Sie das überschüssige Rinderserumalbumin und beschriften Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern des primären Interessierenden Antikörpers bei 4 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen spülen Sie die Dias mit drei dreiminütigen Wähbern in PBS und fügen Sie 50 Mikroliter Polymerenhancer zu jedem Dia hinzu.Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius die Dias dreimal in PBS waschen und 50 Mikroliter Sekundärantikörper B zu jedem Gewebeabschnitt hinzufügen. Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius die Abschnitte mit drei fünfminütigen Währen in PBS abspülen und jedem Dia einen Tropfen frisch zubereitete DAB-Arbeitslösung hinzufügen. Wenn der entsprechende Grad der braunen Färbung durch Lichtmikroskopie erkannt wird, spülen Sie die Dias in PBS für fünf Minuten und gegen flecken die Kerne mit einem Tropfen Hämatoxylin für eine Minute.Entfernen Sie den überschüssigen Fleck unter einem Rinnsal von Wasser für etwa 30 bis 40 Sekunden, gefolgt von einer 25 bis 30 Sekunden Waschen in frischen PBS. Differenzieren Sie die Gewebe in 1%Salzsäure-Ethanol für 10 Sekunden, gefolgt von einer einminütigen PBS-Wäsche. Dehydrieren Sie die Dias mit fünfminütigen Eintauchen in die umgekehrte Reihenfolge der Hydratation und setzen Sie die Dias zwei fünfminütigen Xylolwechseln aus.Montieren Sie dann den Deckelschlupf mit ultrasauberer Montage und lassen Sie die Dias vor ihrer Visualisierung auf einem Lichtmikroskop trocknen. In dieser repräsentativen Studie mit 318 rektalen Sektionsbiopsiepatienten wurden 99 Patienten zunächst durch rektale Sektionsbiopsie diagnostiziert. Viele Ganglienzellen, die Calretinin exprimieren, wurden in normalen Gewebebiopsien beobachtet.In keinem Bereich des Gewebes aus den Hirschsprung-Krankheitssegmenten wurden jedoch Ganglienzellen nachgewiesen. S-100 und PGP9.5 Immunostainierung zeigte hypertrophierte Nervenstämme in der Submukose des erkrankten Gewebes mit nur körniger Färbung einiger kleiner Nervenzweige, die im normalerweise innervierten Darm beobachtet wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, auf Details wie größe der rektalen Saugbiopsien und Dicke der Abschnitte zu achten.Nach der Defragmentierung wird diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Kinderchirurgie ebnen, um eine Diagnose der Hirschsprung-Krankheit zu unterstützen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

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Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

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Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

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Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

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