Name: diagnosis of hirschsprung's disease by immunostaining rectal suction biopsies for calretinin, s100 protein and protein gene product 9.5
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00
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Gli autori ringraziano weibing Tang per il suo grande aiuto nel fornire il laboratorio di riprese. Questo articolo è supportato dalla ricerca sul benessere pubblico, e sono stati ricevuti fondi speciali dalla pianificazione nazionale della salute e della famiglia della Cina (Grant No. 201402007).

Questo protocollo è stato approvato dal Consiglio etico di ricerca dell'ospedale dell'Unione di Huazhong Università della scienza e della tecnologia.
1. biopsia di aspirazione rettale
<ol><li>Eseguire la biopsia di aspirazione rettale da un chirurgo pediatrico ben addestrato e un assistente utilizzando un sistema di biopsia rettale di aspirazione Rbi2 dopo aver ottenuto il consenso informato dal tutore.<ol>
<li>Eseguire RSB su pazienti che hanno le seguenti indicazioni: incapacità di pass...

<ol>
	<li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung's+disease:+A+bridge+for+science+and+surgery.">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung's+disease:+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies.">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li><li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease.">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).</li><li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+histochemistry+(AChE)+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease.">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).</li><li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung's+disease:+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis.">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li><li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung&#39;s+disease+using+antibodies+to+MAP2,+calretinin,+GLUT1+and+S100.">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung&#39;s disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li><li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung'+disease.">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).</li><li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease.">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology &amp; Nutrition. 60 (5), 598 (2015).</li><li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease.">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li><li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung's+disease.">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li><li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+We+Stop+Looking?+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease.">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li><li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin+immunohistochemistry:+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease.">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li><li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung's+disease.">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li><li>Monforte-Mu&#241;oz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. 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R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease.">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).</li><li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis.">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).</li></ol>

Qui abbiamo descritto una procedura che utilizza tre diversi anticorpi immunoistochimici per macchiare le sezioni RBS per la diagnosi di MH. La sensibilità del nostro protocollo diagnostico era 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), e la specificità era 100% (95% CI, 0,97-1.00).
Le fasi più critiche del protocollo sono RSB e reazione di antigene-anticorpo. La dimensione della biopsia determina l'accuratezza della colorazione. Una piccola biopsia non fornirà abbastanza tessuto per fare una diagnosi pr...

La malattia di Hirschsprung (HD) è un disturbo intestinale congenito comune caratterizzato da una mancanza di cellule di ganglio in diversi segmenti del tratto intestinale distale1. Il sistema nervoso enterico umano si forma quando l'invasione delle cellule neurali embrionali è completata. Se c'è un disturbo del processo e l'invasione non riesce a completare, l'intestino distale del neonato diventa aganglionic2. Questa condizione potenzialmente fatale è chiamata malattia di Hirschsprung. La proliferazione, la motilità e la crescita intestinale sono i tre componenti principali della colonizzazione di successo.
La colorazione tradizionale di ematossilina e eosina (H & E) di una biopsia submucosa limitata non può raggiungere risultati soddisfacenti come la colorazione H & E di un tessuto a spessore pieno ottenuto dalla chirurgia. Inoltre, la colorazione dell'acetilcolinesterasi (dolore) del tessuto di aspirazione rettale è teoricamente impegnativa a causa della sua inadeguata sensibilità, che è 91%, e l'elaborazione complessa delle sezioni congelate3,4. Molti altri marcatori immunoistochimici di cellule gangliari e fibre nervose che possono essere macchiati in campioni fissati in formalina e in paraffina stanno gradualmente diventando la diagnostica HD mainstream. La calretinina è una proteina di legame di calcio dipendente dalla vitamina D che non è espressa nel plesso mienterico e submucoso dei segmenti affetti da MH5. La proteina S100 è espressa in cellule derivate dalla cresta neurale, come le fibre nervose e le cellule gliali, che spesso presentano ipertrofia neurale nel tessuto submucoso dei segmenti affetti da MH6. Il gene proteico prodotto 9,5 (PGP 9.5) macchia in modo affidabile le fibre nervose e le cellule del ganglio; La colorazione di PGP 9.5 agisce come complemento alla colorazione del calretinina, specialmente nei casi di ipoanglionosi isolata. La doppia colorazione con S100 e PGP 9.5 può diminuire il tasso di falsi negativi e aumentare la sensibilità. Come prerequisito, lo studio attuale mira a garantire un'adeguata specificità e un'elevata sensibilità di questo nuovo metodo diagnostico. Il nostro nuovo protocollo ha utilizzato tutti e tre i marcatori per la discriminazione dell'intestino aganglionico e delle fibre nervose ipertrofici. Uno studio prospettico di 318 bambini è stato eseguito dal nostro laboratorio e pubblicato in precedenza senza un protocollo dettagliato7. Il protocollo dettagliato e le precauzioni sono discussi in questo articolo. Tutti i neonati che hanno sofferto di un grave problema di defecazione dalla nascita o da bambini affetti da stitichezza cronica, escluse altre malattie comuni, sono potenziali candidati per la biopsia di aspirazione rettale (RSB). Il nostro nuovo protocollo è adatto per la colorazione non solo di RSBs, ma anche di biopsie a pieno spessore o di campioni chirurgici per effettuare una diagnosi finale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>calretinin antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>MAB-0716 170416405c</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-100 antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>Kit-0007</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGP9.5 antibody</td>
			<td>Shanghai long island antibody Co. Ltd</td>
			<td>R-0457-03</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhancer reagent</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>KIT-9902-A 170416405a</td>
			<td>antibody: secondary antibody A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>KIT-9902-B</td>
			<td>antibody: secondary antibody B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit (containing reagent A B and C)</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>DAB-0031</td>
			<td>staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat incubator</td>
			<td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rbi2 suction rectal biopsy system</td>
			<td>Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia</td>
			<td>CP1200 HP1000 SS1000</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>leica RM2016</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid sodium citrate buffer(100X)</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>MVS-0101</td>
			<td>antigen retrieval buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pathological tissue dehydrator</td>
			<td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td>
			<td>JT-12F</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagnosis of hirschsprung's disease by immunostaining rectal suction biopsies for calretinin, s100 protein and protein gene product 9.5

La malattia di Hirschsprung (HD) è una malattia intestinale congenita che si manifesta clinicamente come incapacità di passare il meconio nei neonati o come stipsi a lungo termine nei bambini. La biopsia di aspirazione rettale (RSB) per determinare l'assenza di cellule di ganglio e ipertrofia neurale è il test più accurato per la diagnosi di MH al momento. Colorazione ematossilina-eosina tradizionale manca di sensibilità e specificità. La colorazione dell'acetilcolinesterasi non può essere ampiamente utilizzata a causa del suo complesso processo. Il nostro nuovo protocollo di immunocolorazione per calretinina, proteina S100 e proteina genica prodotto 9,5 (PGP 9.5), che abbiamo condotto su rsbs, presenta elevati tassi di sensibilità e specificità di 96,49% (intervallo di confidenza 95%, 0,88-0,99) e 100% (95% di confidenza intervallo di frequenza, 0,97-1,00), rispettivamente. I segmenti affetti da MH spesso presentano l'assenza dell'espressione di calretinina, proteina S100 e PGP 9.5, che sono marcatori di ipertrofia neurale nel tessuto sottomucoso. Questo protocollo descrive il processo operativo dettagliato di questo nuovo metodo diagnostico.

In totale, 318 pazienti sono stati arruolati nel nostro studio. Tutti i pazienti erano sottoposti a RSB e i tessuti erano macchiati per calretinina, S100 e PGP 9.5. La diagnosi basata sul nostro nuovo protocollo è stata la MH in 97 casi, non HD in 213 casi, e sospetta MH in 8 casi. Tra i 132 pazienti chirurgici, 99 pazienti sono stati diagnosticati con MH mediante immunocolorazione di campioni a pieno spessore dopo l'intervento chirurgico. La colorazione S100 e PGP 9.5 ha mostrato che il...

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Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

Questo protocollo descrive il processo di immunocolorazione delle biopsie di aspirazione rettale per la calretinina, la proteina S100 e il gene proteico prodotto 9,5. Questo nuovo metodo diagnostico adiuvante per la malattia di Hirschsprung ha un tasso di sensibilità e specificità preferibile.

Diagnosi di malattia di Hirschsprung da immunostaining biopsie di aspirazione rettale per calretinina, S100 proteina e proteina gene prodotto 9,5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande nella diagnosi della malattia di Hirschsprung. Il metodo e le funzioni di questa tecnica, se si segue il protocollo, mostrano un'elevata sensibilità e i tassi di specificità che elaborano contemporaneamente. A dimostrare la procedura sarà Mijing Fang, un tecnico del mio laboratorio.Iniziare fissando le biopsie di aspirazione rettale in cinque volte il volume del tessuto in paraformaldeide al 4% per sei ore a temperatura ambiente. Disidratare i tessuti fissi in un disidratatore patologico del tessuto per 11 ore e incorporare i tessuti di biopsia di aspirazione rettale trasformati in blocchi di paraffina. Tagliare i blocchi su un microtomo fino a quando non viene esposto un piano di sezione completo del tessuto.Quindi utilizzare il microtomo per ottenere una sezione di 0,4 micrometri del tessuto incorporato. Posizionare in acqua da 45 a 50 gradi Celsius per consentire alle sezioni di diffondersi in un piano piatto. Trasferire le sezioni appiattite su vetrini e cuocerle in forno a 60 gradi Celsius per tre o cinque ore.Posizionare le diapositive deparaffinizzate in due cambi di 15 minuti di xilene seguiti dalla loro idratazione in immersioni sequenziali di etanolo di cinque minuti. Quindi sciacquare gli scivoli in acqua purificata dall'osmosi inversa per altri cinque minuti. Per il recupero dell'antigene, posizionare gli scivoli in un barattolo di soluzione di recupero coplin e posizionare il barattolo in un bagno preriscaldato di acqua bollente.Dopo 20 minuti, lasciare raffreddare il barattolo a temperatura ambiente per circa 10 minuti e sciacquare delicatamente gli scivoli con PBS. Quindi utilizzare un marcatore idrofobico per circondare ogni sezione di tessuto e posizionare le diapositive in una scatola bagnata. Per bloccare eventuali perossidati, aggiungere due o tre gocce di soluzione di perossido di idrogeno al 3% su ogni tessuto e posizionare le diapositive a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Al termine dell'incubazione, sciacquare le diapositive con tre lavaggi PBS di cinque minuti seguiti da blocco con albumina siere bovina al 5% per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, scartare l'albumina del siero bovino in eccesso ed etichettare le cellule con 50 microlitri dell'anticorpo primario di interesse a 4 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, sciacquare le diapositive con tre lavaggi di tre minuti in PBS e aggiungere 50 microlitri di esaltatore polimerico ad ogni diapositiva.Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius, lavare le diapositive tre volte in PBS e aggiungere 50 microlitri di anticorpo secondario B a ogni sezione tissutale. Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, sciacquare le sezioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS e aggiungere una goccia di soluzione di lavoro DAB preparata al momento ad ogni diapositiva. Quando il livello appropriato di colorazione marrone viene rilevato mediante microscopia leggera, sciacquare le diapositive in PBS per cinque minuti e contromaminare i nuclei con una goccia di ematossilina per un minuto.Rimuovere la macchia in eccesso sotto un rivolo d'acqua per circa 30-40 secondi seguita da un lavaggio da 25 a 30 secondi in PBS fresco. Differenziare i tessuti in etanolo all'1% di acido cloridrico per 10 secondi seguito da un lavaggio PBS di un minuto. Disidratare le diapositive con immersioni di cinque minuti nell'ordine inverso di idratazione ed esporre le diapositive a due cambi di cinque minuti di xilene.Quindi montare lo slittamento del coperchio utilizzando un montaggio ultra-pulito e lasciare asciugare le diapositive prima della visualizzazione su un microscopio leggero. In questo studio rappresentativo su 318 pazienti con biopsia a sezione rettale, 99 pazienti sono stati inizialmente diagnosticati dalla biopsia della sezione rettale. Molte cellule gangliari che esprimono calretinina sono state osservate in normali biopsie tissutali.Tuttavia, non sono state rilevate cellule gangliari in nessuna area del tessuto dai segmenti della malattia di Hirschsprung. L'immunostaining S-100 e PGP9.5 ha rivelato tronchi nervosi ipertrofi nella sottomucosa del tessuto danneggiato con solo colorazione granulare di alcuni piccoli ramoscelli nervosi osservati nell'intestino normalmente innervato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione a dettagli come le dimensioni delle biopsie di aspirazione rettale e lo spessore delle sezioni.Dopo essere stata deframmentata, questa tecnica aprirà la strada alle ricerche nel campo della chirurgia pediatrica per sostenere una diagnosi della malattia di Hirschsprung.

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