Name: diagnosis of hirschsprung's disease by immunostaining rectal suction biopsies for calretinin, s100 protein and protein gene product 9.5
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00
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著者は、撮影室を提供することに彼の大きな助けを Weibing タンに感謝します。この記事は公的福祉研究によって支えられており、中国の国民健康・家族計画 (グラント 201402007) から特別資金が寄せられました。

このプロトコルは、科学技術の Huazhong 大学のユニオン病院の研究倫理委員会によって承認されました。
1. 直腸の吸引のバイオプシー
<ol><li>十分に訓練された小児科の外科医によって直腸の吸引のバイオプシーを行い、保護者からのインフォームドコンセントを得た後 Rbi2 吸引の直腸のバイオプシーシステムを使用する助手。<ol>
<li>以下の適応症を有する患者に RSB を行...

<ol>
	<li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung's+disease:+A+bridge+for+science+and+surgery.">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung's+disease:+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies.">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li><li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease.">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).</li><li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+histochemistry+(AChE)+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease.">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).</li><li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung's+disease:+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis.">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li><li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung&#39;s+disease+using+antibodies+to+MAP2,+calretinin,+GLUT1+and+S100.">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung&#39;s disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li><li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung'+disease.">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).</li><li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease.">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology &amp; Nutrition. 60 (5), 598 (2015).</li><li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease.">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li><li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung's+disease.">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li><li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+We+Stop+Looking?+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease.">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li><li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin+immunohistochemistry:+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease.">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li><li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung's+disease.">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li><li>Monforte-Mu&#241;oz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis:+a+&amp;#34;positive&amp;#34;+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung's+disease.">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &amp;#34;positive&amp;#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li><li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung&#39;s+disease+using+antibodies+to+MAP2,+calretinin,+GLUT1+and+S100.">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung&#39;s disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li><li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease.">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).</li><li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis.">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).</li></ol>

ここでは、HD の診断のために RBS セクションを染色する3つの異なる免疫組織化抗体を用いた手順について説明した。診断プロトコールの感度は 96.49% (95% CI, 0.88-0.99) であり, 特異性は 100% であった (95% CI, 0.97-1.00)。
プロトコルの最も重要なステップは、RSB および抗原抗体反応である。生検のサイズは、染色の精度を決定する。小さな生検は、正確な診断を下すために十分?...

ヒルシュスプルング病 (HD) は、遠位腸管1の異なるセグメントにおける神経節細胞の欠乏によって特徴付けられる一般的な先天性腸疾患である。ヒトの腸神経系は、胚性神経細胞の浸潤が完了したときに形成される。プロセスの乱れがあり、侵襲が完了しなかった場合、新生児の遠位腸管は aganglionic2になる。この潜在的に致命的な状態はヒルシュスプルング病と呼ばれます。増殖、運動性、および腸の成長は、コロニー形成の成功の3つの主要な要素である。
限定された粘膜下生検の伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン (H & E) 染色は、手術から得られる全厚組織の H & E 染色としての結果に満足できるものとして達成することができない。さらに、直腸の吸引のティッシュのアセチルコリンエステラーゼ (痛み) の染色は 91%、および凍結セクション3,4の複雑な処理である不十分な感受性が原因で理論的に挑戦的である。ホルマリン固定およびパラフィン包埋標本で染色されることができる神経節細胞および脳繊維の他のいくつかの免疫組織化学的マーカーは、徐々に主流の HD 診断になってきている。Calretinin は、HD 罹患セグメント5の myenteric および粘膜下叢において発現されていないビタミン D 依存性カルシウム結合性タンパク質である。S100 タンパク質は、神経線維およびグリア細胞などの神経堤に由来する細胞において発現され、これは、しばしば、HD 罹患セグメント6の粘膜下組織における神経肥大を示す。タンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) は、神経線維および神経節細胞を確実に染色する。PGP 9.5 染色は、特に孤立した hypoganglionosis の場合、calretinin 染色の補足として機能します。S100 および PGP 9.5 との二重染色は、偽陰性率を減少させ、感度を高めることができます。前提条件として、現在の研究は、この新規診断方法の十分な特異性および高感度を確保することを目的とする。私たちの新しいプロトコルは、aganglionic 腸と肥厚性神経線維の識別のために3つのマーカーすべてを使用しました。318子供の将来の研究は、私たちの研究室によって行われ、以前に詳細なプロトコル7なしで公開しました。詳細なプロトコルと注意事項については、この記事で説明します。出生後に重度の排便問題を患った新生児、または他の一般的な疾患を除く慢性便秘の小児は、直腸吸引生検 (RSB) の候補となる可能性がある。私達の新しい議定書は RSBs だけでなく、最終的な診断を作るために完全な厚さのバイオプシーまたは外科標本を染色のために適している。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>calretinin antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>MAB-0716 170416405c</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-100 antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>Kit-0007</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGP9.5 antibody</td>
			<td>Shanghai long island antibody Co. Ltd</td>
			<td>R-0457-03</td>
			<td>antibody: primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhancer reagent</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>KIT-9902-A 170416405a</td>
			<td>antibody: secondary antibody A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>KIT-9902-B</td>
			<td>antibody: secondary antibody B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit (containing reagent A B and C)</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>DAB-0031</td>
			<td>staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat incubator</td>
			<td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rbi2 suction rectal biopsy system</td>
			<td>Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia</td>
			<td>CP1200 HP1000 SS1000</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>leica RM2016</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid sodium citrate buffer(100X)</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>MVS-0101</td>
			<td>antigen retrieval buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pathological tissue dehydrator</td>
			<td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td>
			<td>JT-12F</td>
			<td>instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagnosis of hirschsprung's disease by immunostaining rectal suction biopsies for calretinin, s100 protein and protein gene product 9.5

ヒルシュスプルング病 (HD) は、乳児の胎便を通過することができない、または小児の長期便秘として臨床的に明らかにされている先天性腸疾患である。神経節細胞および神経肥大の不在を決定する直腸の吸引のバイオプシー (RSB) は現時点で HD の診断のための最も正確なテストである。従来のヘマトキシリン・エオシン染色は感受性および特異性に欠ける。アセチルコリンエステラーゼ染色は、その複雑なプロセスのために広く使用することはできません.我々が RSBs で行った calretinin、S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) のための免疫染色の新規プロトコルは、96.49% (95% 信頼区間、0.88-0.99) の高感度および特異性率を示し、100% (95% 信頼間隔は 0.97 ~ 1.00) です。HD に影響を受けるセグメントは、calretinin、S100 タンパク質、および粘膜下組織の神経肥大のマーカーである PGP 9.5 の発現が存在しないとしてしばしば存在する。このプロトコルは、この新しい診断方法の詳細な動作プロセスについて説明します。

合計で、318人の患者が我々の研究に登録された。全ての患者は RSB を経験し、組織は calretinin、S100、および PGP 9.5 のために染色された。私たちの斬新なプロトコルに基づく診断は、97ケースで HD、非 HD は213のケースで、HD は8ケースで疑われました。手術後の132人の外科患者のうち、99人の患者は、外科手術後に全厚の標本を免疫染色することで HD と診断された。S100 ?...

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Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

このプロトコルは、calretinin、S100 タンパク質、およびタンパク質遺伝子産物9.5 に対する免疫染色の直腸吸引生検のプロセスを記載している。ヒルシュスプルング病のためのこの新しいアジュバント診断法は、好ましい感受性および特異性率を有する。

Calretinin の免疫染色を行う直腸吸引生検によるヒルシュスプルング病の診断, S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物9.5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

この方法は、ヒルシュスプルング病の診断における質問に答えるのに役立ちます。この手法の方法と機能は、プロトコルに従えば、高い感度と同時に処理する特異度率を示します。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるMijing Fangです。直腸吸引生検を室温で6時間4%パラホルムアルデヒドで組織の体積の5倍に固定します。11時間、病理学的組織脱水機で固定組織を脱水し、パラフィンブロックに処理された直腸吸引生検組織を埋め込む。組織の完全な断面が露出するまでミクロトーム上のブロックをトリミングします。その後、ミクロトームを使用して、埋め込まれた組織の0.4マイクロメートルの切片を得る。45〜50度の摂氏水に入れ、セクションを平らな計画に広げます。平らにしたセクションをガラススライドに移し、60度の摂氏オーブンで3〜5時間焼きます。脱パラフィンスライドを2つの15分間のキシレンの変化に入れ、続いてその水和を5分間のエタノール浸漬で入れる。その後、さらに5分間逆浸透精製水でスライドをすすきます。抗原を取り出す場合は、コプリン染色用の回収液の瓶にスライドを入れ、熱湯の予熱浴に瓶を入れます。20分後、瓶を室温まで約10分間冷やし、PBSでスライドをそっと洗いすします。その後、疎水性マーカーを使用して各組織セクションを囲み、スライドを濡れた箱に入れます。ペルオキシデートをブロックするには、各組織に3%過酸化水素溶液を2〜3滴加え、スライドを摂氏37度で20分間置きます。インキュベーションの最後に、3つの5分間のPBSのスケでスライドをすすぐ後、5%のウシ血清アルブミンを摂氏37度で20分間ブロックします。次に、余分なウシ血清アルブミンを捨て、一晩摂氏4度で目的の一次抗体の50マイクロリットルで細胞にラベルを付けます。翌朝、PBSで3分間の3分間のスケでスライドをすすい、各スライドに50マイクロリットルのポリマーエンハンサーを加えます。摂氏37度で20分後、スライドをPBSで3回洗浄し、各組織セクションに50マイクロリットルの二次抗体Bを加える。30分摂氏37度で、PBSで3回の5分間のスケでセクションをすすい、各スライドに準備したDAB作業ソリューションを一滴追加します。適切なレベルの褐色染色が光顕微鏡で検出された場合、PBSでスライドを5分間リンスし、ヘマトキシリンを1滴ずつ副染色します。水のトリクルの下で余分な汚れを約30〜40秒間取り除き、その後新鮮なPBSで25〜30秒の洗浄を行います。1%塩酸エタノールで組織を10秒間分化し、その後1分間のPBS洗浄を行います。水分補給の逆の順序で5分間の浸漬でスライドを脱水し、2つの5分間の変更キシレンにスライドを露出させます。次に、超クリーンな取り付けを使用してカバースリップを取り付け、スライドが光顕微鏡で視覚化される前に乾燥させます。318人の直腸セクション生検患者の本代表的な研究では、99人の患者が最初に直腸部生検によって診断された。カレチニンを発現する多くのガングリオン細胞が正常組織生検で観察された。しかし、ヒルシュスプルング病のセグメントから組織のどの領域にも神経節細胞は検出されなかった。S-100およびPGP9.5免疫染色は、通常の内インナート腸で観察されたいくつかの小さな神経小枝の粒状染色のみを伴う疾患組織の粘膜下の肥大性神経幹を明らかにした。この手順を試みる間、直腸吸引生検のサイズやセクションの厚さなどの細部に注意を払うことを忘れないでください。それが最適化された後、この技術は、ヒルシュスプルング病の診断をサポートするために小児外科の分野での研究のための道を開きます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid &#946;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

神経科学

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

免疫沈降およびアシル-ビオチン所（阿部）による培養海馬神経細胞におけるタンパク質パルミトイル化の検出

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

の検出<em&gt;その場で</emで&gt;タンパク質 - タンパク質複合体<em&gt;ショウジョウバエ</em近接ライゲーションアッセイの使用&gt;幼虫神経筋接合部

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

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神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

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Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

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