Bu videoda, küresel düzeyde bir antikor repertifini görselleştirmek ve analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu bireylerde tüm B hücre repertisi ve bağışıklık stimülasyonu yanıt olarak dinamik değişiklikleri tanımlamak mümkündür. Bu yöntem, ortaya çıkan viral enfeksiyonların hastalarından alınan patolojik örnekleri analiz etmek ve enfeksiyonun patogenezine dair eşi görülmemiş bir içgörüyle verileri elde etmek için uygulanabilir.
Uygulama için en heyecan verici alanlardan biri aşı kontrolüdür. Aşı etkinliği, aşı uygulanan bireylerde küresel antikor repertifinin dinamikleri analiz edilerek değerlendirilebilir. Antikor gen amplifikasyonunun verimliliği başlangıç malzemelerinin türlerine bağlı olduğundan, bireyin bu yöntemde yeni olduğu PCR koşullarını optimize etmesi gerekebilir.
Fla-cher immünglobulin amplicons belirlenmesi için. Bu eylemleri görsel olarak göstermek önemlidir. Prosedürü gösteren bayan Sayuri Yamaguchi ve Bay Hanbing Xue, benim laboratuvarımdan bir teknisyen ve yüksek lisans öğrencisi olacak.
Bu prosedüre başlamak için, sekiz haftalık C57 siyah altı faredoku incelemek ve dağınık hücreleri elde etmek için PBS iki mililitre ile paslanmaz çelik örgü geçmek. Hücre süspansiyonuna iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpü ve santrifüjiçin 600 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika aktarın. Supernatant atın ve pelet için ACK lysing tampon 800 mikrolitre ekleyin.
Dokudaki kırmızı kan hücrelerini lyse için iki dakika buz üzerinde kuluçka. Daha sonra, her yıkama için pbs üç mililitre kullanarak doku hücrelerini üç kez yıkayın. Santrifüj tekrar 600 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için.
Supernatant atın ve iyice pelet ve girdap fenol / guanidin izotiyoyanat reaktif 800 mikrolitre ekleyin. 25 derecede beş dakika kuluçkaya yat. Sonra, kloroform 200 mikrolitre ekleyin ve 15 saniye boyunca elle çalkalayın.
25 derecede iki dakika kuluçkaya yat. 12, 000 kez g ve 25 santigrat derecede fazları ayırmak için santrifüj. Üst sulu fazı taze bir tüpe aktarın.
% 70 etanol bir hacim ekleyin. Girdap kısaca ve silika spin sütununa bu karışımı uygulayın. 30 ila 100 mikrolitre su ile RNA'yı eute.
Bundan sonra, ilk RNA konsantrasyonu quantitate için bir florometre kullanın. Saflaştırılmış RNA'yı eksi 80 derecede saklayın. İlk olarak, üreticinin talimatlarına göre 5'RACE CDS astar ve SMART-PCR oligonükleotid kullanarak toplam RNA şablonunun iki ila 10 mikrogram ilk iplikçik cDNA sentezleyin.
Fare immünglobulin için, PCR yüksek sadakat DNA polimeraz ile cDNA yükseltmek, evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astarkullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi. İnsan immünglobulin için, etiket dizileri ile evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astarkullanarak ilk PCR gerçekleştirin. Dizin dizilimi astarlarını kullanarak ikinci PCR'ye göre her örnek için dizin dizilerini ekleyin.
Daha sonra, %2 agarose jel üzerinde PCR ürünlerinden herhangi birini elektrofore edin. UV transilluminator'daki DNA bantlarını görselleştirin ve 600 ile 800 baz çifti arasındaki geniş bandı içeren jel dilimini çıkarın. Jel dilimi 10 miligram başına membran bağlayıcı çözelti 10 mikrolitre ekleyin.
Jel dilimleri tamamen eriyene kadar 50 ila 65 santigrat derecede karıştırın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra jel çözeltisini silika membran spin sütununa aktarın. Kolonu bir kez yıkama tamponu ile yıkayın ve 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile DNA'yı aşındırın.
Bir florometre kullanarak, saflaştırılmış amplikonrları ölçün ve her immünglobulin sınıfındaki amplikonları NGS dizilimi için eşit miktarlarda bir araya koyun. Bundan sonra, kütüphanelerin boyutunu ve konsantrasyonlarını belirlemek için DNA boyutlandırma çipi ile mikrokapiller bazlı elektroforez kullanın. Kütüphaneleri eksi 20 derecede saklayın.
İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi sıralama çalışmasının örnek bir elektronik tablosu oluşturun. Ardından, bir reaktif kartuşunu ve kitaplıkları eritin. Sodyum hidroksit 0.2 normal bir çözüm yapmak ve istenilen azı konsantrasyonları elde etmek için kütüphaneler seyreltmek.
Daha sonra, akış hücresini durulayın ve kurulayın ve reaktif kartuşu kuyusuna seyreltilmiş ve denatüre kütüphane çözeltisinin 600 mikrolitresini ekleyin ve sıralama çalışmasını başlatın. Bir bütün olarak bir mürin antikor repertuarı bir bakış açısı hücre veya dalak gibi dokulardan elde edilebilir, kemik iliği, lenf düğümü, veya kan. IgM, IgG1, IgG2c ve naif bir fare dalak gelen immünglobulin hafif zincir repertuarlarının temsilsonuçları burada gösterilmiştir.
V(D)J 3D V(D)J çizimi ile yeniden düzenlenmesinde, her topun boyutu göreli okuma sayısını temsil eder. Başka bir deyişle, tüm B hücrelerindeki antikor mRNA'larının sayısını temsil eder. 3D mesh 110 immünglobulin ağır zincir V genleri oluşur, 12 immünglobulin ağır zincir D genleri, ve dört immünglobulin ağır zincir J genleri, kromozom kendi sırasını yansıtacak şekilde hizalanmış.
2D VJ arsa IGL repertisi VJ yeniden düzenleme profilini gösterir. Her çubuğun uzunluğu, göreli okuma sayısını temsil eder. X ekseni temsil 101 immünglobulin ışık zinciri V-kappa genleri, ve üç immünglobulin ışık zinciri V-lambda genleri, ve Y-ekseni dört immünglobulin ışık zinciri J-kappa genleri temsil eder, ve üç immünglobulin ışık zinciri J-lambda genleri.
Bir bütün olarak bir insan antikor repertuarı bir bakış periferik kan mononükleer hücreleri veya patolojik dokular da dahil olmak üzere çeşitli dokulardan analiz edilebilir. IgM, total IgG, total IgA, IgD, IgE ve IgL repertoirelerinin normal periferik kan mononükleer hücrelerinden elde edilen temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Murine modelinde olduğu gibi, V(D)J yeniden düzenlemesinin repertoire profili, her topun boyutunun göreceli okuma sayısını temsil ettiği 3D V(D)J çiziminde gösterilir.
3D mesh 56 immünglobulin ağır zincir V genleri oluşur, 27 immünglobulin ağır zincir D genleri, ve altı immünglobulin ağır zincir J genleri, kromozom üzerinde görünür sırasına göre hizalanmış. IgL reperton'daki VJ yeniden düzenleme profili, her çubuğun uzunluğunun okumaların göreli sayısını temsil ettiği 2D VJ çiziminde gösterilmiştir. X ekseni 41 immünglobulin ışık zinciri V-kappa genlerini, 32 immünglobulin ışık zinciri V-lambda genini, Y ekseni ise beş immünglobulin ışık zinciri J-kappa genini ve beş immünglobulin ışık zinciri J-lambda genini temsil eder.
Bu protokolün çalışma materyalinde, patolojik örneklerin akış sitometrisine ve hatta kriyokesilerine göre az sayıda sıralanmış hücre kullanılabilir. Ancak, PCR koşullarının dikkatli optimizasyonu gerekli olacaktır. Bu protokolün çıktı bilgileri çok büyük olduğu için, biyoinformatik okuryazarlığı antikor ağının yapısını bulmaya yardımcı olacaktır.
Bu bağışıklık sisteminin derin anlaşılmasına daha önce hiç öncülük eder.
