Name: isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

وأيد هذا العمل بمعونة عن Scientific Research (C) (منح رقم: 25461644) والعلماء الشباب (ب) (منح أرقام: 15 ك 19614، 26860845، 17 ك 16298) من كاكينهي JSPS.

استخدام العينات البشرية لهذه الدراسة كانت أقرتها اللجنة الأخلاقية من "كوبي خريج كلية الطب بجامعة" (الموافقة رقم 1370 و 1694) وتجري وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
1-العزلة وثقافة UC-MSCs
ملاحظة: جامعة كاليفورنيا-MSCs قد تم عزل بنجاح، مثقف، والموسعة (أكثر من ال?...

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues.">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells:+Revisiting+History,+Concepts,+and+Assays.">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li><li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Mesenchymal&amp;#34;+stem+cells.">34;Mesenchymal&amp;#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li><li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferative+and+multilineage+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+umbilical+cord+and+bone+marrow.">Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow.</a> Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).</li><li>Manochantr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+amnion,+placenta,+Wharton's+jelly+and+umbilical+cord.">Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord.</a> Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).</li><li>Arutyunyan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+Cord+as+Prospective+Source+for+Mesenchymal+Stem+Cell-Based+Therapy.">Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy.</a> Stem Cells International. 6901286, (2016).</li><li>Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Wharton's+Jelly:+The+Rich,+but+Enigmatic,+Source+of+Mesenchymal+Stromal+Cells.">Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li><li>Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant.">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation.">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751 (2017).</li><li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord.">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li><li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate.">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method.">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li><li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods.">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li><li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+isolation+protocols+highlights+intrinsic+variability+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+cells.">Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells.</a> Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow.">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li><li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults.">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li><li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells:+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation.">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li></ol>

ويمكن أن تكون معزولة من مجموعة متنوعة من الأنسجة MSCs السكان غير متجانسة من الخلايا التي تفعل إكسبرس ليس كل العلامات المظهرية نفس. هنا، نحن المبينة بروتوكول أن أدلة جمع والتشريح من جامعة كاليفورنيا من الرضع الخدج والمدة ويمكن عزلة وثقافة UC-MSCs. وفي أعقاب هذا البروتوكول، نحن بنجاح معزولة UC-MSCs ...

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي أصلاً معزولة وتتميز من نخاع العظم (بي أم)1،2 ولكن يمكن أيضا الحصول على مجموعة متنوعة من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان وملحقات الجنين 3-MSCs هي المعترف بها كمحتوى خلية غير متجانسة التي يمكن أن تنتشر وتفرق في adipocytes وأوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، MSCs تمتلك القدرة على الهجرة إلى مواقع الإصابة وقمعها وتعدل الاستجابات المناعية، وإعادة تشكيلها، وإصلاح الضرر. حاليا، MSCs من مصادر مختلفة وقد اجتذبت اهتمام متزايد كمصدر للخلايا العلاج ضد عدد من الأمراض المستعصية، بما في ذلك الاختلاس – مقابل – المضيف المرض واحتشاء عضلة القلب، واحتشاء دماغي4،5 .
على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر تميز جيدا من MSCs، اختزاع تطلع BM أخلاقيا يحد من إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، MSCs الأجنة التي تم الحصول عليها من الملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، ويكون الحبل السري (UC) المزايا بما في ذلك الشواغل الأخلاقية أقل فيما يتعلق بانتشار أخذ العينات وقوية وتمايز القدرات6 , 7-بين الجنين الملاحق التي عادة ما يتم إهمالها كالنفايات الطبية، UCB وتفرد تعتبر جهازا للجنين، في حين تعتبر المشيمة فيتوماتيرنال. وبالإضافة إلى ذلك، تحتاج المشيمة و UCB أخذ عينات منها وجمعها في هذه اللحظة الدقيقة من تسليم الأطفال حديثي الولادة، بينما المشيمة وتفرد يمكن جمعها ومعالجتها بعد الولادة حديثي الولادة. تبعاً لذلك، تفرد مصدرا واعداً من لجنة السلامة البحرية لخلية العلاج8،9.
تفرد الإنسان يبدأ تطوير مع التوسع التدريجي في تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، ويمكن أن تكون معزولة خلال كامل فترة الوليد تسليم10. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، ونحن استخدام MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع في مختلف الإعمار الحملية11،12. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية عزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1455px;" width="1455">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">50mL plastic tube</td>
			<td style="width:336px;">AS One Coporation, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Violamo 1-3500-22</td>
			<td style="width:312px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">12-well plate</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3815-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">60mm dish</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (100 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Alpha MEM</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">135-15175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Reduced serum medium</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td>
			<td style="width:379px;">OPTI-MEM Gibco 31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Antibiotic-antimycotic</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Gibco 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PBS</td>
			<td style="width:336px;">Takara BIO, Shiga,Japan</td>
			<td style="width:379px;">T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Purified enzyme blends</td>
			<td style="width:336px;">Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:379px;">Liberase DH Research Grade 05401054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347497</td>
			<td>Lot: 3220644, RRID: AB_400312</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD19</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">340364</td>
			<td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD34</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555822</td>
			<td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD45</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555483</td>
			<td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">550257</td>
			<td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD90</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555596</td>
			<td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD105</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">560839</td>
			<td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347367</td>
			<td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG1 k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555749</td>
			<td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2a k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555574</td>
			<td>Lot: 3035934, RRID: AB_395953</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2b k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555743</td>
			<td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Viability dye</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">Fixable Viability Stain 450 562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:336px;">Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Block Ace UKB80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSAria&#160; III Cell Sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM software</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Adipogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Osteogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chondrogenic differentiation medium&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:336px;">Polyscience, Warrigton, PA</td>
			<td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Arizarin Red S</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Toluidine Blue</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">198161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Microscope</td>
			<td style="width:336px;">Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants

إمكانيات علاجية كبيرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وجذب اهتمام متزايد في مجال الطب الحيوي. MSCs هي أصلاً معزولة تتسم من نخاع العظم (بي أم)، ثم اكتسبت من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان والملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، والحبل السري (UC). MSCs عدد سكان خلية غير متجانسة مع القدرة على (1) التمسك بالبلاستيك في ظروف الثقافة القياسية، علامة (2) سطح التعبير عن CD73+/CD90+/CD105+/CD45/CD34––/CD14/CD19– تعمل/HLA-DR– –، والتمايز تريلينيجي (3) في adipocytes، أوستيوسيتيس، وتشوندروسيتيس، التي حددها "المجتمع الدولي" حاليا للعلاج الخلوي (إيست). على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر استخداماً من MSCs، طبيعة الغازية تطلع BM أخلاقيا يحد إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، الجنين MSCs التي تم الحصول عليها من جامعة كاليفورنيا بمزايا مثل انتشار قوي وقدرة التمايز. هناك لا قلق أخلاقية لأخذ العينات من جامعة كاليفورنيا، كما أنها تعتبر عادة النفايات الطبية. تفرد الإنسان يبدأ مع استمرار نمو تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل ويبقى المتزايد حتى وصلت إلى 50-60 سم في الطول، وأنها يمكن أن تكون معزولة أثناء فترة أسرة الوليد تسليم. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، وقد استخدمنا MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع وألقى في الإعمار الحملية المختلفة. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

الإجراءات التي من جمع UC ماجستير الثقافة يرد في الشكل 1. ويمكن جمع UC لحوالي 5-10 سم في الطول من جميع الأطفال حديثي الولادة بالعملية القيصرية. UC يبدأ وضع في 4-8 أسابيع الحمل، وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، كما هو مبين في الشكل 2. هناك اثنين من الش...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

عزل ووصف البشرية المستمدة من الحبل السري الخلايا الجذعية الوسيطة من الخدج والرضع الناضجين

الحبل السري البشري (UC) يمكن الحصول عليها خلال فترة ما حول الولادة نتيجة للأجل قبل الأوان، ومن بوستتيرم التسليم. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مداولات UCMSC ، مثل أفضل مصدر لـ USMSC للعلاج الخلوي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من العزلة المستمرة والانتشار القوي لـ UCMSC من الرضع قبل الأوان ومدى المواليد. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو علاج الأمراض المستعصية.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في مداولات UCMSC، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على مصادر أخرى MSC، مثل الأنسجة الدهنية، synovium، والجلد، لب الأسنان، وهلم جرا. عموما، سوف الفرد الجديد لهذه الطريقة النضال لأن هناك الكثير من الاختلاف في خطوات تشريح السرة وعزل الخلايا الجذعية mesenchymal. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية لأن هذه الخطوات يصعب تعلمها لأن هناك عدة نقاط عرضة للتجاهل.للبدء في تشريح الحبل السري ، قم أولاً بإعداد صينية معدنية ، ومقص معقمة ، وملقط ، وعشرة ماصة ملليلتر ، وماصات 25 ملليلتر ، وأطباقين لثقافة الأنسجة من 60 ملليمترًا. الاحماء برنامج تلفزيوني يمزج انزيم تنقية، 500 ملليلتر من متوسطة المصل منخفضة والثقافة المتوسطة، لدرجة حرارة الغرفة. إزالة الحبل السري المعزول سابقا من أنبوب 50 ملليلتر في ميم ألفا، ووضعها في علبة بلاستيكية.وزن الحبل السري، ومن ثم استخدام مقص معقمة لتشريح خمسة غرامات من الحبل. لتعقيم الحبل السري، استخدم ماصة المليلتر عشرة لصب عشرة ملليلترات من الإيثانول 70 في المئة أكثر من ذلك. ثم غسل الحبل مرتين عن طريق إضافة عشرة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع ماصة 10 ملليلتر.وضع الحبل السري غسلها في معقمة 60 ملليمتر طبق زراعة الأنسجة وإضافة عشرة ملليلتر انخفاض مصل المتوسطة و0.5 ملليلتر يمزج انزيم النقي. استخدام مقص معقمة ملقط لقطع الحبل إلى قطعتين إلى ثلاثة ملليمترات. ضع الطبق في حاضنة لثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة في المائة واحتضانه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.ثم قطع القطع هضم جزئيا إلى قطع أصغر، واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة حتى يصبح متجانسة لزجة. وأخيرا، تأكد من أن تتدفق متجانسة بسهولة من خلال ماصة 25 ملليلتر. أولاً قم بإعداد أربعة أنابيب بلاستيكية 50 ملليلتر في زجاجة 500 ملليلتر من وسيط الثقافة.استخدام ماصة 25 ملليلتر لتقسيم التجانس الحبل السري إلى اثنين, 50 أنابيب بلاستيكية ملليلتر مع ما يقرب من 7.5 ملليلتر في كل أنبوب. ثم إضافة 20 ملليلتر من المتوسطة الثقافة في كل أنبوب ومزيج جيد. جمع كل متجانس مع ماصة 25 ملليلتر وتصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وضعت على رأس أنبوب جمع 50 ملليلتر جديدة.الطرد المركزي أنبوبين مع filtrates في 1000g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الانتهاء من الطرد المركزي، وpirate بعناية طاردة وتجاهل ذلك. إضافة خمسة ملليلتر من الثقافة المتوسطة لكل أنبوب، وإعادة تعليق الكريات الخلية.نقل تعليق الخلية إلى لوحة جديدة 60 ملليمتر والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. لثقافة UCMSC، تدفئة برنامج تلفزيوني، التربسين EDTA، والثقافة المتوسطة، لدرجة حرارة الغرفة. عندما يتم إرفاق الخلايا إلى لوحة، وإزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام وخلايا الدم الحمراء.أضف الثقافة المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. استبدال المتوسطة مرتين في الأسبوع، وثقافة الخلايا حتى تصل إلى 90 إلى 100 في المئة التقاء. ثم غسل الخلايا مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، إضافة 0.5 ملليلتر من التربسين EDTA، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى عشر دقائق.عندما تصبح الخلايا مدورة ومنفصلة، أضف تسعة ملليلترات من الوسط الثقافي، واخلط جيداً لإلغاء تنشيط التربسين. إضافة تعليق الخلية في لوحة جديدة 100 ملليمتر. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 90 إلى 100 في المئة التقاء.كرر التربسينية وتقسيمها إلى لوحتين جديدتين، حتى المقطع العاشر. وقد استخدم تعبير علامة سطحية لـ UCMSC كمعيار لتوصيفها. عندما تحضن مع الأجسام المضادة المناسبة وتحليلها عن طريق تدفق الخلايا، تم العثور عليها إيجابية لعلامات التوقيع MSC، ولكن سلبية لجملة أحادية، سلبية للخلايا الجذعية الدموية وخلية ephithelial، سلبية للخلية B، سلبية لعلامات الكريات البيض عموم، والسلبية لعلامات معقدة الهسطية الرئيسية.لتقييم قدرة تمايز الخط الثالوي لـ USCMSC من الخدج والرضّع، تم حث الخلايا على التفريق إلى الخلايا الشحمية، والخلايا العظمية، والزخردات. UCMSC في النجاح في تمييز الأنواع الثلاثة من الخلايا المتوسطية تؤكد قدرتها على التمايز. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن هناك أربع خطوات حاسمة.قطع الحبل إلى قطعتين إلى ثلاثة سنتيمترات، وقطع إلى قطع أصغر، والتأكد من أن تتدفق متجانسة بسهولة من خلال ماصة 25 ملليلتر، وتصفية التجانس من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

عزل الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية وزراعتها على المسامية مصفوفة العظام

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

عزل وتوصيف الخلايا اللحمية الوسيطة القلب من عينات مرضى اعتلال عضلة القلب أرهيثموجينيك بيوبتيك اندوميوكارديال

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...