Name: isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per Scientific Research (C) (concessione numero: 25461644) e giovani scienziati (B) (concedere numeri: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) di JSPS KAKENHI.

L'uso di campioni umani per questo studio è stato approvato dal comitato etico della Kobe University Graduate School of Medicine (approvazione n ° 1370 e 1694) e condotto in conformità con gli orientamenti approvati.
1. isolamento e coltura di UC-MSCs
Nota: UC-MSCs sono state correttamente isolate, coltivate, ed espansa (più di numero di passaggio 4) da più di 200 UCs sottoposto al presente protocollo. Tra più di 200 UCs, 100% hanno dimostrato i...

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	<li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues.">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li><li>Caplan, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells:+Revisiting+History,+Concepts,+and+Assays.">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li><li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Mesenchymal&amp;#34;+stem+cells.">34;Mesenchymal&amp;#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li><li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. 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M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant.">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation.">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751 (2017).</li><li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord.">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li><li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate.">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method.">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li><li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods.">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li><li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. 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The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow.">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li><li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults.">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li><li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells:+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation.">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li></ol>

MSCs può essere isolato da una varietà di tessuti e sono una popolazione eterogenea di cellule che fare express non tutti gli stessi marcatori fenotipici. Qui, abbiamo delineato un protocollo che guida la raccolta e la dissezione di UC dai neonati pretermine e a termine e consente l'isolamento e la coltura di UC-MSCs. A seguito di questo protocollo, abbiamo isolato correttamente UC-MSCs che soddisfano i criteri ISCT19 da OSSC trasportato a 19-40 settimane di gestazione e ha dimostrato che rappre...

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono originariamente isolate e caratterizzata dal midollo osseo (BM)1,2 , ma può essere ottenute anche da una vasta gamma di tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali 3. MSCs sono riconosciuti come una popolazione cellulare eterogenea che può proliferare e differenziarsi in condrociti, osteociti e adipociti. Inoltre, MSCs possiedono la capacità di migrare verso luoghi della ferita, sopprimere e modulare le risposte immunitarie e ritoccare e riparare le lesioni. Attualmente, MSCs da diverse fonti hanno attirato l'interesse crescente come una fonte per la terapia cellulare contro un certo numero di malattie intrattabili, compreso la malattia dell'innesto - contro - ospite, infarto miocardico e infarto cerebrale4,5 .
Sebbene BM è la fonte più ben caratterizzata di MSCs, l'invasività di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l'età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB), e del cordone ombelicale (UC) hanno vantaggi tra cui meno etiche preoccupazioni per quanto riguarda il campionamento e robusta la proliferazione e differenziazione capacità6 , 7. tra annessi fetali che solitamente vengono scartati come rifiuti sanitari, UCB e UC sono considerati un organo fetale, mentre la placenta è considerata di fetomaternal. Inoltre, placenta e UCB devono essere provati e raccolti nel momento esatto di consegna neonato, considerando che la placenta e UC possono essere raccolti ed elaborati dopo la consegna del neonato. Di conseguenza, UC è una promettente fonte MSC per terapia cellulare8,9.
UC umano inizia a sviluppare con la progressiva espansione della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione, continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza e possono essere isolati durante tutto il periodo di consegna neonato10. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, usiamo UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale11,12. In questo protocollo, descriviamo come isolare e caratterizzare UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1455px;" width="1455">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">50mL plastic tube</td>
			<td style="width:336px;">AS One Coporation, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Violamo 1-3500-22</td>
			<td style="width:312px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">12-well plate</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3815-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">60mm dish</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (100 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Alpha MEM</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">135-15175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Reduced serum medium</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td>
			<td style="width:379px;">OPTI-MEM Gibco 31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Antibiotic-antimycotic</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Gibco 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PBS</td>
			<td style="width:336px;">Takara BIO, Shiga,Japan</td>
			<td style="width:379px;">T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Purified enzyme blends</td>
			<td style="width:336px;">Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:379px;">Liberase DH Research Grade 05401054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347497</td>
			<td>Lot: 3220644, RRID: AB_400312</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD19</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">340364</td>
			<td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD34</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555822</td>
			<td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD45</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555483</td>
			<td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">550257</td>
			<td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD90</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555596</td>
			<td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD105</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">560839</td>
			<td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347367</td>
			<td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG1 k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555749</td>
			<td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2a k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555574</td>
			<td>Lot: 3035934, RRID: AB_395953</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2b k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555743</td>
			<td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Viability dye</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">Fixable Viability Stain 450 562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:336px;">Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Block Ace UKB80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSAria&#160; III Cell Sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM software</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Adipogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Osteogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chondrogenic differentiation medium&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:336px;">Polyscience, Warrigton, PA</td>
			<td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Arizarin Red S</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Toluidine Blue</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">198161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Microscope</td>
			<td style="width:336px;">Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno un notevole potenziale terapeutico e attrarre l'interesse crescente in campo biomedico. MSCs sono originariamente isolato e caratterizzato dal midollo osseo (BM), poi acquisita da tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB) e del cordone ombelicale (UC). MSCs sono una popolazione eterogenea delle cellule con la capacità per (1) l'adesione alla plastica in condizioni di coltura standard, espressione di marcatori (2) superficie di CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenotipi /HLA-DR– –e (3) trilineage differenziazione in adipociti, osteociti e condrociti, come attualmente definiti dalla società internazionale per la terapia cellulare (ISCT). Sebbene BM è la fonte più ampiamente usata di MSCs, la natura invasiva di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l'età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da UC hanno vantaggi come la capacità di differenziazione e proliferazione vigorosa. Non c'è nessuna preoccupazione etica per il campionamento di UC, come è in genere considerato come rifiuti sanitari. UC umano inizia a sviluppare con la continua crescita della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a raggiungere 50-60 cm di lunghezza, e può essere isolato durante il periodo di consegna tutto neonato. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, abbiamo usato UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Le procedure da collezione UC alla cultura MSC sono riassunti nella Figura 1. UC di circa 5-10 cm di lunghezza possono essere raccolti da tutti i neonati trasportati dalla sezione cesarean. UC inizia a svilupparsi a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza, come mostrato nella Figura 2. Ci sono due arterie (A), una vena (V), cavo fodera (CL) e gelatina di Wharton (WJ) nel UC, come raffigurato...

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Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

Cordone ombelicale umano (UC) possono essere ottenuti durante il periodo perinatale a seguito di termine prematuro e postterm consegna. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-derivati di cellule staminali mesenchimali (MSCs-UC) da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella deliberazione dell'UCMSC, come la migliore fonte di USMSC per la terapia cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un isolamento costante e una vigorosa proliferazione dell'UCMSC dai neonati pre-termine e a termine. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia delle malattie intrattabili.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla deliberazione dell'UCMSC, può essere applicato anche ad altre fonti MSC, come tessuto adiposo, sinovio, pelle, polpa dentale e così via. Generalmente, un individuo nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché ci sono così tante variazioni nei passaggi della dissezione ombelicale e dell'isolamento delle cellule staminali mesenchimali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto questi passaggi sono difficili da apprendere perché ci sono diversi punti inclini a essere trascurati.Per iniziare a sezionare il cordone ombelicale, preparare prima un vassoio metallico, forbici sterilizzate e forcep, pipette da dieci millilitri, pipette da 25 millilitri e due piatti di coltura tissutale da 60 millimetri. Riscaldare le miscele enzimatica purificata PBS, un 500 millilitro di mezzo siero ridotto e mezzo di coltura, a temperatura ambiente. Rimuovere il cordone ombelicale precedentemente isolato da un tubo da 50 millilitri in alpha MEM e posizionarlo nel vassoio di plastica.Pesare il cordone ombelicale e quindi utilizzare forbici sterilizzate per sezionare cinque grammi del cavo. Per sterilizzare il cordone ombelicale, utilizzare una pipetta da dieci millilitri per versare dieci millilitri di 70% di etanolo su di esso. Quindi lavare il cavo due volte aggiungendo dieci millilitri di PBS con pipetta da dieci millilitri.Posizionare il cordone ombelicale lavato nel piatto sterilizzato di coltura tissutale da 60 millimetri e aggiungere dieci millilitri ridotti mezzo siebro e miscele enzimatiche purificate da 0,5 millilitri. Utilizzare forbici sterilizzate e forcette per tagliare il cavo in pezzi da due a tre millimetri. Mettere il piatto in un incubatore di anidride carbonica al cinque per cento e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi tagliare i pezzi parzialmente digeriti in pezzi più piccoli e incubarli a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del cinque per cento fino a quando l'omogeneato diventa viscoso. Infine, assicurarsi che l'omogeneato fluisca facilmente attraverso una pipetta da 25 millilitri. Preparare prima quattro tubi di plastica da 50 millilitri in una bottiglia da 500 millilitri di terreno di coltura.Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per dividere l'omogeneo del cordone ombelicale in due tubi di plastica da 50 millilitri con circa 7,5 millilitri in ogni tubo. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo di coltura in ogni tubo e mescolare bene. Raccogliere ogni omogeneato con pipetta da 25 millilitri e filtrare attraverso un colino a celle da 100 micrometri posizionato sopra un nuovo tubo di raccolta da 50 millilitri.Centrifugare due tubi con filtrati a 1000g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver terminato la centrifugazione, aspirare attentamente il supernatante e scartarlo. Aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura a ciascun tubo e sospendere di nuovo i pellet cellulari.Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra e coltura di 60 millimetri a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Per coltura dell'UCMSC, riscaldare il PBS, l'EDTA della tripina e il mezzo di coltura, a temperatura ambiente. Quando le cellule sono attaccate alla piastra, rimuovere il mezzo e lavare due volte con cinque millilitri di PBS per rimuovere detriti e globuli rossi.Aggiungere il mezzo di coltura e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Sostituire il mezzo due volte a settimana e colturare le celle fino a raggiungere la confluenza dal 90 al 100%. Quindi lavare le cellule due volte con cinque millilitri di PBS, aggiungere 0,5 millilitri di tripside EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per cinque o dieci minuti.Quando le celle vengono arrotondate e staccate, aggiungere nove millilitri di mezzo di coltura e mescolare bene per inattivare la tripina. Aggiungere la sospensione cellulare in una nuova piastra da 100 millimetri. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% fino a raggiungere la confluenza dal 90 al 100%.Ripetere la tripinazione e dividersi in due nuove piastre, fino al decimo passaggio. L'espressione marcatore di superficie degli UCMSC è stata usata come criterio per la loro caratterizzazione. Quando incubati con anticorpi appropriati e analizzati dalla citometria del flusso, sono stati trovati positivi per i marcatori distintivi di MSC, ma negativi per il macrofago monocitario, negativi per le cellule staminali ematapoietiche e la cellula ephiteliale, negativi per la cellula B, negativi per i leucociti pan e negativi per marcatori complessi di istocompatibilità maggiore.Per valutare la capacità di differenziazione trilineare degli USCMSC dai neonati pretermine e a termine, le cellule sono state indotte a differenziarsi in adipociti, osteociti e condrociti. L'UCMSC si è differenziato con successo in tutti e tre i tipi di cellule mesodermiche confermando la loro capacità di differenziazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ci sono quattro passaggi critici.Tagliare il cavo in pezzi da due a tre centimetri, tagliando in pezzi più piccoli, assicurandosi che l'omogeneato fluisca facilmente attraverso una pipetta da 25 millilitri e filtrando l'omogeneato attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolamento e caratterizzazione di cellule Stromal Mesenchymal cardiache da Endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica