Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Oogsten exosoom-verrijktgeconditioneerd medium uit cellen gekweekt in bioreactor kolven en isolatie door sacharose kussen ultracentrifugatie resulteren in exosoom preparaat van hoge opbrengst met minimale vervuilende eiwitten of niet-exosomale vesikles. Met behulp van een enkele sacharose kussen bereid in deuteriumoxide omzeilt de moeizame voorbereiding van een discontinu sacharose gradiënt en vermindert de hoeveelheid sacharose die nodig is om de vereiste dichtheid te bereiken. Effectieve in vitro levering van siRNA kapselt in exosomen bereid in dit protocol wijst op het potentieel van dit systeem als een nieuwe generatie RNA interferentie-gebaseerde therapie voor alvleesklierkanker.

Om te beginnen, cultuur HEK-293 cellen in normaal medium, zoals beschreven in het manuscript. Vouw de cellen uit in vier T75-kolven en groei tot ze 90% samenvloeien. Om een bioreactorkolf te bereiden, voeg 50 tot 100 milliliter normaal medium toe in het medium reservoir van de bioreactorkolf om het membraan nat te maken.

Verzamel alle HEK-293 cellen uit de vier T75 kolven, en resuspend ze in 15 milliliter exosoom-uitgeput medium in een centrifuge buis. Gebruik vervolgens een spuit van 20 milliliter die is aangesloten op een stompe vulnaald om deze celsuspensie zorgvuldig toe te voegen aan het celcompartiment van de bioreactorkolf. Vul vervolgens het medium reservoir van de bioreactorkolf met het normale medium, tot 500 milliliter, en broed het uit op 37 graden Celsius, 5% CO2 gedurende een week.

Na een week van incubatie, verwijder al het medium uit het medium reservoir van de bioreactor fles door het uit te gieten. Verwijder met behulp van een spuit van 20 milliliter die is aangesloten op een stompe vulnaald, verwijder al het medium uit het celcompartiment. Voeg vervolgens 50 tot 100 milliliter normaal medium toe aan het medium reservoir en 15 milliliter vers exosoomarm medium aan het celcompartiment met behulp van een spuit van 20 milliliter die is aangesloten op een stompe vulnaald.

Vul vervolgens het medium reservoir van de bioreactorkolf met normaal medium tot 500 milliliter. Incubeer bij 37 graden Celsius, 5%CO2 voor nog een week. Om het verzamelde geconditioneerde medium vooraf te ontruimen, centrifugeren op 500 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Breng de supernatant in een nieuwe buis, en gooi de pellet. Na het herhalen van deze centrifugatiestap met de teruggewonnen supernatant, herstel de supernatant opnieuw en gooi de pellet weg. Dan, centrifuge de herstelde supernatant op 2,000 keer g gedurende 15 minuten en vier graden Celsius.

Houd de supernatant, en gooi de pellet. Filtreer de supernatant eenmaal door een 22-micrometer filter bevestigd aan een 20-milliliter spuit in een verse centrifuge buis. Ondertussen, om een 25% sacharose oplossing in deuteriumoxide voor te bereiden, nauwkeurig wegen 1,9 gram sacharose in een universele buis.

Voeg vervolgens deuteriumoxide toe tot het gewicht 7,6 gram bereikt. Vul vervolgens een ultracentrifugebuis met 22,5 milliliter voorgezuiverd geconditioneerd medium. Plaats een glazen pipet in de buis.

Voeg drie milliliter sacharoseoplossing toe via de pipet, zodat de oplossing een aparte laag onder het geconditioneerde medium vormt. Plaats de buis met gelaagd geconditioneerde medium/sacharoseoplossing voorzichtig in de emmer van een uitschovingrotor. Zet de emmer in de rotor.

Plaats de rotor in de ultracentrifuge en draai 1,000 keer g op vier graden Celsius gedurende 1,5 uur. Verzamel twee milliliter van de sacharoselaag van de buis, een milliliter per keer met behulp van een P1000 pipet, met zijn tip bevestigd aan een 10-microliter tip, en voeg het toe aan een ultracentrifuge fles met 20 milliliter gefilterde PBS voor het wassen. Plaats de buis in een rotor met vaste hoek en zet hem gedurende 1,5 uur op 100,000 keer g bij vier graden Celsius.

Gebruik een serologische pipet van 10 milliliter om de supernatant voorzichtig te verwijderen. Resuspend de pellet met 400 microliters van gefilterde PBS. Voordat u met de elektroporatie begint, moet u de elektroporatiec cuvette 30 minuten op ijs koelen.

Meng zeven microgram exosomen met 33 microgram siRNA in de microcentrifugebuis. Voeg citroenzuurbuffer toe om het volume van 150 microliters te bereiken. Voeg het exosoom-siRNA mengsel toe aan de elektroporatie cuvette met behulp van een plastic pipet en dop de cuvette.

Plaats de cuvette in de juiste richting in de cuvettehouder van de elektroporator en draai het draaiwiel van de elektroporator 180 graden met de klok mee. Selecteer het gewenste programma en druk op de startknop om elektroporatie te starten. Het display geeft een succesvolle puls aan.

Draai vervolgens het wiel 180 graden tegen de klok in terug en verwijder de cuvette. Gebruik een plastic pipet om het monster uit de cuvette te verwijderen in een nieuwe microcentrifugebuis. Houd de buis op ijs of in een koelkast voor verdere verwerking, indien niet onmiddellijk gebruikt.

Om te beginnen met gratis siRNA verwijderen, passeren 3,5 milliliter gefilterde PBS door de grootte uitsluiting chromatografie kolom tweemaal te equilibrate. Los vervolgens 150 microliter van geëlektreerd monster op in 350 microliter van gefilterde PBS en breng deze over naar de SEC-kolom. Verzamel de eerste 500-microliter fractie ontplukt uit de kolom in een microfuge buis, en markeer het als F0. Voeg vervolgens 500 microliter gefilterde PBS toe aan de kolom.

Verzamel de volgende fractie en markeer deze als F1. Herhaal het toevoegen van de PBS en het verzamelen van elutiefracties tot een totaal van 10 500-microliter fracties, of tot F9, wordt verzameld. Ten slotte, om eventuele monsterresten te verwijderen, was de kolom met gefilterde PBS ten minste tweemaal, en ga dan verder met experimenten, zoals beschreven in het manuscript. Morfologische analyse met behulp van transmissie elektronenmicroscopie toonde aan dat HEK-293 exosomen bolvormige structuren waren die iets groter zijn dan 100 nanometer.

Dit resultaat is het eens met dat van nanodeeltjes tracking analyse meting, die ook de grootte verdeling van de exosomen toonde. Bovendien waren ze positief voor exosomale markers CD81, CD9 en CD63. Het percentage herstel van exosomen gezuiverd met behulp van grootte uitsluiting chromatografie en het percentage herstel van siRNA werden berekend zoals beschreven in het manuscript.

Het herstel na de zuivering van exosoom was 75%Met behulp van de siRNA-standaardcurve, de inkapselingsefficiëntie van siRNA in exosomen werd berekend op ongeveer 10 tot 20%Flow cytometrie kwalitatieve analyse van in vitro opname van exosomen geladen met fluorescerende Atto655-siRNA toonde aan dat PANC-1 cellen behandeld met siRNA-ingekapselde exosomen had de grootste verschuiving in fluorescente signaal. Dit werd bevestigd door de bevinding dat PANC-1-cellen die met siRNA-ingekapselde exosomen werden behandeld, een hoger percentage van de bevolking positief registreerden voor het Atto655-signaal in vergelijking met die behandeld met ongeladen exosomen en siRNA-mengsel. Cellulaire opname van siRNA was ook aanzienlijk hoger in PANC-1 cellen behandeld met siRNA-ingekapselde exosomen in vergelijking met die behandeld met de exosoom-siRNA mengsel, bevestigt dat de siRNA-ingekapselde exosomen werden geïnternaliseerd door de PANC-1 cellen en dat ze effectief leveren de siRNA intracellulair.

Het is belangrijk om de sacharose en deuteriumoxide zeer nauwkeurig te wegen bij het bereiden van de sacharoseoplossing en altijd vers bereide sacharoseoplossing te gebruiken om dichtheidsverbouwing tijdens opslag te voorkomen. Confocale microscopie kan worden uitgevoerd om de internalisering van siRNA ingekapseld in de exosomen in cellen verder te valideren en de intracellulaire handel na cellulaire opname te bestuderen. Dit protocol stelt ons in staat om de gen-specifieke knockdown van siRNA geleverd door exosoom te beoordelen en dient als een instrument voor nieuwe doelvalidatie in RNA interferentie-gebaseerde kankertherapie.