バイオリアクターフラスコで培養した細胞からエキソソーム濃縮されたコンディション培地を収穫し、ショ糖クッション超遠心分離によって分離すると、最小限の汚染タンパク質または非エキソソーム小胞を用いた高収率のエキソソーム調製が得られる。重水素酸化物で調製された単一のスクロースクッションを使用すると、不連続なスクロース勾配の骨の折れる準備を回避し、必要な密度を達成するために必要なショ糖の量を減らします。このプロトコルで調製されたエキソソーム中のsiRNAカプセル化の効果的なインビトロ送達は、膵臓癌に対する新世代のRNA干渉ベース療法としてこのシステムの可能性を強調している。
まず、HEK-293細胞を通常培地で培養し、原稿に記載した。細胞を4つのT75フラスコに拡大し、90%の合流度に達するまで増殖する。バイオリアクターフラスコを調製するには、通常の培地を50〜100ミリリットルの通常の培地をバイオリアクターフラスコの培地貯留部に加えて膜を湿潤させる。
4つのT75フラスコからすべてのHEK-293細胞を収集し、遠心分離管内のエキソソーム枯渇培地の15ミリリットルでそれらを再懸濁します。次に、鈍い充填針に接続された20ミリリットルのシリンジを使用して、この細胞懸濁液をバイオリアクターフラスコの細胞コンパートメントに慎重に加える。次に、バイオリアクターフラスコの培地貯留層を通常の培地、最大500ミリリットル、摂氏37度、5%CO2で1週間インキュベートします。
1週間のインキュベーションの後、バイオリアクターフラスコの培地貯留層からすべての培地を注ぎ出して取り出します。鈍い充填針に接続された20ミリリットルの注射器を使用して、セルコンパートメントからすべての媒体を取り除きます。次に、通常の培地を50〜100ミリリットルの培地に加え、鈍い充填針に接続された20ミリリットルのシリンジを使用して新鮮なエキソソーム枯渇培地をセルコンパートメントに15ミリリットル加えます。
次に、バイオリアクターフラスコの培地貯留部に、最大500ミリリットルの通常培地を充填します。摂氏37度、さらに1週間は5%CO2でインキュベートします。収集したコンディション培地を事前にクリアするには、摂氏4度で5分間500倍gで遠心分離します。
上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。回収した上清を用いてこの遠心分離工程を繰り返した後、再度上清を回収し、ペレットを廃棄する。次いで、回収した上清を15分間、摂氏4度で2,000回gで遠心分離する。
上清を保持し、ペレットを捨てます。20ミリリットルのシリンジに取り付けられた22マイクロメートルのフィルターを通して上清を新鮮な遠心管に1回フィルターします。一方、重水素酸化物に25%スクロース溶液を調製し、ユニバーサルチューブ内の1.9グラムのスクロースを正確に計量する。
その後、重さが7.6グラムに達するまで重水素酸化物を加える。その後、超遠心チューブに22.5ミリリットルの予めクリアされたコンディション培地を充填します。ガラスピペットをチューブに入れます。
ピペットを通して3ミリリットルのスクロース溶液を加え、溶液が条件付き培地の下に別々の層を形成するようにします。層状のコンディションのミディアム/スクロース溶液を含むチューブを、スイングアウトローターのバケツに慎重に入れます。バケットをローターに固定します。
ローターを超遠心分離機に入れ、摂氏4度で100,000倍のgで1.5時間回転させます。チューブからショ糖層の2ミリリットルを収集し、P1000ピペットを使用して一度に1ミリリットル、その先端を10マイクロリットルの先端に取り付け、洗浄のために20ミリリットルのろ過済PBSを含む超遠心分離ボトルに加えます。チューブを固定角度ローターに入れ、100,000倍のgで摂氏4度で1.5時間遠心します。
上清を慎重に取り除くために10ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。400マイクロリットルの濾過されたPBSでペレットを再懸濁します。エレクトロポレーションを開始する前に、氷の上でエレクトロポレーションキュベットを30分間前冷やします。
7マイクログラムのエキソソームと33マイクログラムのsiRNAをマイクロ遠心分離管に混ぜます。クエン酸バッファーを加えると、150マイクロリットルの体積を達成できます。プラスチックピペットを使用してエレクトロポレーションキュベットにエキソソーム-シRNA混合物を加え、キュベットをキャップします。
エレクトロポレーターのキュベットホルダーにキュベットを正しい向きに置き、エレクトロポレーターの回転ホイールを時計回りに180度回転させます。目的のプログラムを選択し、スタートボタンを押してエレクトロポレーションを開始します。ディスプレイは、正常なパルスを示します。
次に、ホイールを反時計回りに180度戻し、キュベットを取り外します。プラスチック製のピペットを使用して、サンプルをキュベットから新しいマイクロ遠心チューブに取り出します。すぐに使用しない場合は、さらなる処理の前に氷の上または冷蔵庫にチューブを保管してください。
遊離siRNA除去を開始するには、3.5ミリリットルの濾過したPBSをサイズ排除クロマトグラフィーカラムを2回通して平衡化する。次いで、150マイクロリットルの電気ポレートされたサンプルを350マイクロリットルの濾過PBSに溶解し、SECカラムに移した。カラムから溶出した最初の500マイクロリットル分をマイクロフュージチューブに集め、F0とマークします。次に、500マイクロリットルのフィルター処理されたPBSをカラムに加えます。
次の分数を収集し、F1 としてマークします。合計10 500マイクロリットルの分数、またはF9まで収集されるまで、PBSを追加し、溶出画分を収集することを繰り返します。最後に、任意のサンプル残基を除去するために、少なくとも2回濾過されたPBSでカラムを洗浄し、次に原稿に記載されているように実験を続ける。透過電子顕微鏡を用いた形態学的解析では、HEK-293エキソソームは100ナノメートルよりわずかに大きい球体構造であった。
この結果は、エキソソームのサイズ分布を示したナノ粒子追跡分析測定からのものと一致する。さらに、外皮マーカーCD81、CD9、およびCD63に陽性であった。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製したエキソソームの回収率とsiRNAの回収率を、原稿に記載した通りに算出した。
エキソソームの精製後の回収率は、siRNA標準曲線を用いて75%であった。 エキソソームにおけるsiRNAの封入効率は、蛍光Atto655-siRNAを搭載したエキソソームのインビトロ取り込みの約10〜20%のフローサイトメトリー定性分析であると計算され、siRNA封入された外因体で処理されたPANC-1細胞が蛍光シグナルの最大のシフトを有することを示した。これは、siRNAカプセル化エキソソームで処理されたPANC-1細胞が、アンロードされたエキソソームおよびsiRNA混合物で処理したものと比較して、Atto655シグナルに対して陽性の集団の割合が高いことを記録したという知見によって確認された。siRNAの細胞取り込みはまた、エキソソーム-シRNA混合物で処理された細胞と比較してsiRNA-封入エキソソームで処理されたPANC-1細胞において有意に高く、siRNA封入されたエキソソームがPANC-1細胞によって内部化され、細胞内で効果的に送達することを確認した。
スクロース溶液を調製する際にスクロースと重水素酸化物を非常に正確に計量し、保管中の密度変化を避けるために、常に作りたてのスクロース溶液を使用することが重要です。共焦点顕微鏡法は、エキソソーム内にカプセル化されたsiRNAの細胞内への内在化を更に検証し、細胞内取り込み後の細胞内密売を研究するために行うことができる。このプロトコルは、エキソソームによって送達されるsiRNAの遺伝子特異的ノックダウンを評価することを可能にし、RNA干渉ベースの癌治療における新しい標的検証のためのツールとして機能する。
