Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom "The Hygiene Wert Kette: Gestaltung Hygiene Systeme als Öko-Gemeinschaft Wertesystem" Projekt, ResearchInstitute für Mensch und Natur (RIHN, Projekt No.14200107) unterstützt.

1. mittlere Vorbereitung
<ol><li>Um ein Zellkulturmedium (Serum-haltigen Mittel) zu machen, fügen Sie 4,7 g des Adlers MEM Pulver zu 500 mL destilliertem Wasser hinzu. Autoklaven bei 120 ° C für 20 Minuten und lassen Sie die mittlere auf Zimmertemperatur abkühlen. Hinzufügen von fetalen Rinderserum (Endkonzentration: 10 %), L-Glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1 %) und Natriumbicarbonat (1,125 g/L). Lagerung bei 4 ° C für 1 Monat.</li>
	<li>Bereiten Sie das serumfreien Medium für die Ausbreitung des Virus wie in Schritt 1.1, aber ohne die fötalen Rinderserum beschrieben. Lagerung bei 4 ° C für 1 Monat.</li>
	<li>Sterilisieren Sie für die Plaque-Assay 100 mL des Adlers MEM Medium (Phenol-rot-haltigen) durch Autoklavieren. Lassen Sie das Medium auf Raumtemperatur abkühlen, und fügen Sie dann 2 % FBS, 2 % Penicillin-Streptomycin, 4 mM L-Glutamin und 2,25 g/L Nahco33. Shop bei 4 ° C.</li>
	<li>Sterilisieren Sie für die Plaque-Assay 100 mL 2,5 % Agarose-Gel von Autoklaven. Bereiten Sie das Gel am selben Tag, den die Plaque-Assay durchgeführt wird. Speichern Sie das Gel bei 47 ° C im Wasserbad.</li>
</ol>2. die Zellkultur
<ol><li>Ein Cryotube mit MA104-Zell-Linien aus dem Flüssigstickstoff-Behälter zu entfernen. Legen Sie die Cryotube in einem Wasserbad bei 37 ° C Auftauen der Zellen. 20 mL Serum-haltigen Medium in einem T75 Kolben 1 mL Zellsuspension hinzufügen. 2 oder 3 Tage inkubieren Sie die Küvette in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 . Hinweis: Die endgültige Zellkonzentration in der Suspension ist etwa 106 Zellen/mL.</li>
	<li>Sobald die Zelle Monolage 80 % Konfluenz erreicht, den Überstand zu entfernen und Waschen der Zellen zweimal mit 5 mL 1 x Dulbeccos PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung).</li>
	<li>4 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in den Kolben und Inkubation bei 37 ° C für 5 min um die Zellen aus der Flasche zu lösen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 190 X g für 5 min.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der gebeizte Zellen (106 ) in 1 mL Serum-haltigen Mittel bereit in 1.1. Die resuspendierte Zellen bei 100fach verdünnt mit dem Medium.</li>
	<li>Geben Sie 3 mL verdünnter Zellsuspension in jedem 6-Brunnen (für die Plaque-Assay) oder 24-Well-Platten (für die Zelle-Bindung-Assay), beziehungsweise. 2 oder 3 Tage inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigte Dampf. Hinweis: T75 Kolben eignet sich der Zeitverlauf Proben zu sammeln, weil das Probenvolumen des Überstands (1 mL) im Vergleich zum Gesamtvolumen überstand (30 mL) ignoriert werden kann. Unterdessen ist die infektiöse Titer des Virus in jedem Überstand der Plaque-Assay gemessen die in der Regel durchgeführt wird, mit einer 6-Well-Platte. Eine 24-Well-Platte ist für die Zelle-Bindung-Assay genutzt werden.</li>
</ol>3. spezifische Wachstumsrate von Rotavirus
Hinweis: Rhesus-Rotavirus (RRV, Genotyp: G3P[3]) ist in diesem Protokoll verwendet, weil RRV schnell und einfach Plaques mit MA104 Zellen bilden kann.
<ol><li>Ort ein Röhrchen mit 1 mL der Suspension Virus (107 Pfu/mL) in einem serumfreien Medium gespeichert bei-80 ° C in einem Wasserbad bei 37 ° C Auftauen. 1 mL der Virus Aussetzung (endgültige Trypsin Konzentration ist 4 µg/mL) und dann Wirbel fügen Sie 1 µg/µL Trypsin aus Schweinen Bauchspeicheldrüse hinzu. Inkubieren Sie die Virus-Aussetzung bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigte Dampf für 30 min. Hinweis: Trypsin aus anderen Quellen verwendet werden, aber die Wirkung auf Rotaviren Infektiosität muss vorab getestet werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie die aktivierte Virus-Suspension mit einem serumfreien Medium die Multiplizität der Infektion (MOI) auf 0,1 Pfu/Zelle anpassen.</li>
	<li>Hinzufügen 1 mL verdünnten Virus Suspension MA104 Zelllinien (80 % Zusammenfluss) in einem T75 Kolben 3 Tage nach der Beschichtung (2.1) Zelle, Inkubation bei 37 ° C für 1 h und schütteln der Flasche alle 15 min.</li>
	<li>Fügen Sie dann 30 mL 0,13 µg/mL Trypsin aus Schweinen Bauchspeicheldrüse in den Kolben-haltigem serumfreien Medium. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigte Dampf.</li>
	<li>Sammeln Sie 1 mL der Überstand in den Kolben bei 0, 6, 12, 18, 24 und 36 (bzw. 48) h nach der Infektion (Hpi) und ersetzen Sie den Überstand in den 1,5 mL Röhrchen mit einer Pipette zu.</li>
	<li>Das Einfrieren (-80 ° C) führen und bei 37 ° C Zyklus dreimal in einem Wasserbad schmelzen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 12.600 X g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand zu sammeln.</li>
	<li>Filtern des Überstands mit einem destillierten 0,2 µm-Filter, die Zelle Bruchteil zu entfernen. Lagern Sie der Überstand-80 ° C im Kühlschrank, bis die Plaque-Assay für die Messung der Virustiter zuweisen.</li>
	<li>Legen Sie die Röhrchen mit den gesammelten überstand (Schritt 3.5) in einem Wasserbad bei 37 ° C. Eine 1 mL 10-divisibel verdünnten Probe 4 µg/mL Trypsin hinzu und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Während der 30 min Inkubation in 3,8 zunächst die Plaque-Assay für die Messung der Virustiter von Zeit Kurs Proben (Schritt 3,5) erreicht, waschen Sie die MA104 Zellen zweimal in einem 6-Well-Platte mit 2 mL 1 X PBS nach dem Entfernen der Serum-haltigen Medium.</li>
	<li>Seriell Verdünnen der inkubierten Proben mit einem serumfreien Medium und 1 mL der verdünnten Probe in jede Vertiefung zu impfen. Brüten Sie die Platte für 90 min bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigten Dampf, und schütteln Sie die Platte alle 15 min.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation das Inokulum aus 6-Well-Platte. Das Medium vorbereitet (Schritt 1.3) fügen Sie 4 µg/mL Trypsin hinzu. Geben Sie sanft aber sofort 3 mL des Mediums gemischt mit Agarosegel (das Verhältnis ist 1:1) in jedem.</li>
	<li>Lassen bei Raumtemperatur für mehr als 10 min (bis das Agarosegel fest wird) und inkubieren Sie 2 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigte Dampf. Hinweis: Gießen Sie das Medium gemischt mit Agar vom Rand des Brunnens.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der 0,015 % neutrale rote Lösung verdünnt mit 1 X PBS in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigte Dampf. Entfernen des Farbstoffs nach 3 h und 1 Tag bei 37 ° C und 5 % CO2 unter der gesättigte Dampf inkubieren.</li>
	<li>Am nächsten Tag, die Anzahl der Tafeln in jede Vertiefung und berechnen der Pfu/mL. Überprüfen Sie sorgfältig die Zelle Zusammenfluss vor der Plaque-Assay um die Plakette Zahlen zu gewährleisten.</li>
</ol>(4) Zelle-Bindung-Assay
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf der Gilling Bericht13.
<ol><li>Fügen Sie 1 µg/µL Trypsin aus Schweinen Bauchspeicheldrüse zu 1 mL des Virus Aussetzung (endgültige Trypsin Konzentration ist 4 µg/mL) und dann Wirbel hinzu (auf die gleiche Weise wie in 2.1). Verdünnen Sie die Virus-Suspension mit einem serumfreien Medium MOI 1 Pfu/Zelle anpassen.</li>
	<li>Dann waschen Sie die MA104 Zellen zweimal auf 24-Well-Platte mit 1 ml Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS; 2,53 g/L Tris-base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl, 0,046 g/l Na2HPO4 , 1 L mit destilliertem Wasser zu erreichen).</li>
	<li>100 µL der verdünnten Virus Aussetzung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Zellen zu impfen, und bei 4 ° C für 90 min, mit sanft schütteln alle 15 min inkubieren.</li>
	<li>Das Inokulum Virus zu entfernen und Waschen der Zellen zweimal mit 1 mL TBS. Um die doppelsträngige RNA (ds) das Rotavirus zu extrahieren, hinzufügen, 140 µL 1 x PBS und 560 µL RNA-Extraktionspuffer (siehe Tabelle der Materialien) in jede Vertiefung. Mischen Sie angemessen mit einer Pipette (über 10 X oder bis der Dunst oder Verunreinigungen der Zellen in den Puffer nicht gesehen werden kann).</li>
	<li>Legen Sie nach der Genesung der doppelte gestrandeten RNS (DsRNA) laut Protokoll des Herstellers die 1,5 mL Röhrchen mit der DsRNA-Extrakt auf einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min zu denaturieren DsRNA, und dann sofort die Rohre auf Eis legen und inkubieren Sie für mehr als 2 min.</li>
	<li>Synthese die cDNA mithilfe einer reversen Transkription kit (siehe Tabelle der Materialien). Ein PCR-Röhrchen mit 16 µl Gemisch (Tabelle 1) 4 µL denaturierten virale RNA-Lösung hinzu und mischen Sie es sorgfältig mit einer Pipette um nicht Bläschen zu erzeugen. Spin-down der Rohre.</li>
	<li>Durchführen der reversen Transkription mit einem Thermocycler unter der Bedingung, die in Tabelle 2dargestellt. Wenn die cDNA nicht sofort verwendet wird, speichern Sie die PCR-Röhrchen mit der cDNA bei-20 ° C bis zu 1 Jahr.</li>
	<li>Für quantitative PCR Primer verwenden (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3")14 und einer Sonde einfügen einen Quencher (qPCR Sonden; 5'- / FAM/ATGAGCACA/Durstlöscher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/3"), targeting der 963 – 1049 Region NSP3 Genomabschnitt Rotavirus (ST3 Stamm, GenBank: X81436). Hinweis: Quencher ist in der Sonde, entworfen von Zeng Et Al.14 eingefügt.
</li>
	<li>Verdünnen Sie das standard Plasmid seriell (101 bis 106 Kopien/mL) mit PCR grade Wasser der qPCR-Mischung (Tabelle 3) und den master-Mix (20 µL/Probe) für qPCR nach Tabelle 4zu machen.</li>
	<li>Der Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte 20 µL des master Mix hinzu, und mischen Sie dann 5 µL cDNA Proben oder 5 µL des standard Plasmids durch Pipettieren 10 Mal. Starten Sie die Reaktion der qPCR-System gemäß den Bedingungen, die in Tabelle 4dargestellt.</li>
	<li>Zur Berechnung des Rotavirus Genoms gebunden an die Zelloberfläche MA104 durchführen Sie linearen Regression zwischen Ct-Werte und die bekannten Genom ein standard Plasmid und schätzen Sie die Probennummer Genom. Dann berechnen Sie das Verhältnis von Virion Zahlen Bindung an Zellen (G-t) mit denen in der ersten Inokulum (G0).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus.">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li><li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains:+current+status+and+future+prospects.">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li><li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines.">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li><li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+rotavirus+serotypes/+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine.">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li><li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread.">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li><li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland.">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li><li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins.">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li><li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells.">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li><li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus.">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li><li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis.">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li><li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions:+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition.">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li><li>Br&#252;ssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis.">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li><li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Unser Protokoll zur Messung der spezifischen Wachstumsrate ist einfacher als die vorherigen und kann für andere Viren angepasst werden, es sei denn, ihre Zellkultursystem noch nicht feststeht. In dieser Studie verwendeten wir RRV (G3P[3]) weil diese Sorte Plaques einfacher als menschliche Rotaviren bilden kann bei der Verwendung der MA104-Zell-Linien. Einige menschliche Rotavirus-Stämme können nicht in diese Zelllinie Plaque bilden. Daher kann anstelle der Plaque-Assay, der Schwerpunkt bilden Einheit (FFU) Assay15 oder Median Gewebekultur infektiöse Dosis (TCID50) Assay für viele Rotaviren Stämme16angewendet werden. Die vorgestellte Protokoll zur Ermittlung der spezifischen Wachstumsrate kann verwendet werden, für andere Virustypen aber eignet sich nicht für Viren, für die keine etablierten Zellkultursystem ermittelt wird. Bevor das Experiment für die spezifischen Wachstumsrate, es ist besser, im Voraus wissen, wann die infektiöse Virustiter zu steigen beginnt und erreicht die stationäre Phase in eine Vorprüfung. Wenn zu viele Plaketten vorhanden sind, sollten die Plaque-Assay durchgeführt werden, wieder nach dem Ändern der Verdünnung der Virusproben. Die Stunden nach der Infektion (Hpi) Proben zu sammeln sind auch wichtig, weil die Neigung der exponentiellen Wachstumsphase unterschätzt werden kann, wenn der richtige Zeitpunkt, die stationäre Phase zu erreichen, ist verfehlt. Bei der Angleichung durch die geänderte Gompertz-Modell sollte eine Bestimmungskoeffizient immer berechnet und überprüft werden. Wenn die Fitness auf das modifizierte Modell Gompertz niedrig ist, können andere Modelle wie die modifizierte logistisches Modell12 vorzuziehen.
Im Umgang mit Zellen, wenn Sie das Mittel "oder" Virus Inokulum zu entfernen, die PBS für Wasch- oder Agarose-Gel für die Plaque-Assay muss umgehend hinzugefügt werden jeweils von einer Zellplatte Kultur, die Zellen von Trockenheit zu verhindern. Zur gleichen Zeit müssen Sie vorsichtig gießen Sie PBS oder Agarose Zellen nicht, von Brunnen zu lösen. Dieser Schritt ist der wichtigste in beiden Tests (Schritt 3,9 und 3.11). Wenn die Plaque-Assay zu viele Proben hat, empfehlen wir unterteilen das Agarosegel (100 mL, die jeweils maximal empfohlene ist) in mehreren mittleren Flaschen und Flaschen Warmhalten, bis kurz vor dem Einsatz seit Agarose Gel innerhalb von ca. 10 min bei Zimmer erstarrt ist Temperatur. Da Trypsin anfällig für hohe Temperaturen17ist, sollte eine Trypsin-Lösung zu einem Medium und Agarose für die Plaque-Assay ausreichend abgekühlt hinzugefügt werden.
In der Zelle-Bindung-Assay erfolgen die Inkubation für Virus Bindung an Zellen bei 4 ° C, Invasion der Zellen zu verhindern. Nach der Gilling Methode13sind Zellen anfällig für Trocknung bei niedrigen Temperaturen, so sanft schütteln notwendig, alle 15 Minuten während der Inkubation. Das RNA-Extraktion-Kit hier verwendete kann für andere Kits ersetzt werden. Die Neigung der Standardkurve in RT-qPCR sollte ungefähr 3.3, und der Bestimmungskoeffizient sollte mehr sein als 0,98. Im Vergleich zu dem Fluoreszenzmikroskop, die Lokalisierung von Viren in Zellen zu visualisieren, ist der Test schneller und einfacher zu bedienen, weil die Bindung von Leuchtstoffen auf Viren nicht notwendig ist.
Vor kurzem, menschlichen Darm Enteroid (HIE), zeigen eine ähnliche zelluläre Zusammensetzung und Funktion als menschlichen Magen-Darm-Epithel, verfügbar für Rotaviren Ausbreitung18geworden. Die Verwendung von Holiday Inn Express kann ermöglichen, die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit nicht kultivierbarer Stämme Rotavirus zu bewerten. Darüber hinaus können beide hier beschriebenen Experimente zur Bewertung der Wirkungen der Droge auf beiden Phänotypen19angewendet werden. Die hier vorgestellten Protokolle machen es möglich, die Veränderungen im Phänotyp Parameterwerte von Rotavirus-Stämmen unter unterschiedlichen Bedingungen quantitativ zu diskutieren.

RNA-Viren bilden eine genetisch vielfältige Bevölkerung, bekannt als Quasispezies1, wegen deren Mutationsrate,2 , der höher ist als die DNA-basierten Organismen. Bevölkerungsstruktur in Quasispezies ist die Bevölkerung genetische Faktoren, wie Mutation, Selektionsdruck und Gendrift betroffen. Spannungen in einem einzigen genetischen Abstammung können unterschiedliche Phänotypen wegen der genetischen Vielfalt zeigen. Rachmadi Et Al. zeigte beispielsweise, dass freies Chlor Empfindlichkeit anders unter murinen Norovirus Stämmen war, die aus einem Plaque-gereinigte Stamm S7-PP33entstanden.
Rotaviren (Gattung Rotavirus in Familie Reoviridae) sind unbehüllte ds RNA-Viren bilden Quasispezies2. Neben der oben beschriebenen Bevölkerung Erbfaktoren betrifft Genom Reassortment die genetische Vielfalt der Rotavirus, da dieses Virus 11 segmentierten Genome4hat. Rotaviren verursachen Durchfall vor allem bei Säuglingen und Säuglingssterblichkeit im Jahr 2013 wurden über 250.0005geschätzt. Zwei Impfstoffe sind in mehreren Ländern im Einsatz und haben sich als wirksam bei der Verringerung der Belastung von Rotavirus-Infektion, aber einige Forscher diskutieren jetzt die Anwesenheit von Impfstoff-Flucht durch Mutation entstehende Variationen6,7,8, 9. die Charakterisierung dieser Mutanten ist wichtig, die Impfstoff-Escape-Mechanismen zu verstehen.
Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für zwei Tests zur Bewertung der spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus um die phänotypische Unterschiede zwischen den Sorten/Mutanten zu verstehen. Die Wachstumskurve der Rotaviren wurde in vorherigen Berichten10vorgestellt, aber Wachstumsparameter wie spezifischen Wachstumsrate sind in der Regel nicht gemessen. Eine Zelle-Bindung-Assay durchgeführt umfasst bisher immunofluorescent staining Technik11. Wir zeigen hier einfachere Methoden der Nutzung des Plaque-Assay und RT-qPCR, die uns erlauben, den Unterschied in der viralen Phänotypen quantitativ zu diskutieren. Diese Methoden eignen sich für die Charakterisierung der Rotavirus Phänotypen und können schließlich dazu beitragen, den Bau neuer Impfstoffe für mehrere Genotypen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Rotavirus ist der wichtigste ätiologische Faktor für infantile Durchfall. Es ist ein RNA-Virus doppelsträngige (ds) und bildet eine genetisch vielfältige Bevölkerung, bekannt als Quasispezies aufgrund ihrer hohen Mutationsrate. Hier beschreiben wir, wie zur Messung der spezifischen Wachstumsrate und die Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus als seine Phänotypen. Rotavirus ist behandelt mit Trypsin-Rezeptor der Zelle erkennen und dann in MA104 Zellkultur geimpft. Der Überstand, einschließlich virale Stammarten ist zeitweise gesammelt. Die Plaque-Assay dient zum Bestätigen der Virustiter (Plaque-bildende Einheit: Pfu) jeden gesammelten überstand. Die spezifischen Wachstumsrate wird durch den Einbau von Zeit-Kursdaten von Pfu/mL auf das modifizierte Modell Gompertz geschätzt. In der Zelle-Bindung-Assay sind MA104 Zellen in einer 24-Well-Platte mit Rotavirus infiziert und für 90 min bei 4 ° C für Rotaviren Adsorption an Zellrezeptoren inkubiert. Eine niedrige Temperatur hemmt Rotaviren vor der Invasion der Wirtszelle. Nach dem Waschen um ungebundene Virionen zu entfernen, wird die RNA Virionen befestigt an Zellrezeptoren gefolgt von cDNA Synthese und Reverse Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) entzogen. Diese Protokolle können angewendet werden, für die Untersuchung der phänotypischen Unterschiede zwischen den Virenstämmen.

Ein Überblick über zwei Protokolle zu den spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindung Assay Plaque-gereinigte RRV Stämme zeigt in Figur 1A und 2A.
In der Probe für die spezifischen Wachstumsrate erreicht die endgültige Virustiter mehr als 107 Pfu/mL auf den T75 Kolben zu propagieren. Wenn die maximale Konzentration niedriger als 107 Pfu/mL ist, kann die MA104 Zelle nicht konfluierende geworden oder RRV war nicht gut von Trypsin aktiviert. Einige Modelle stehen zur Abschätzung der spezifischen Wachstumsrate über die infektiöse Gerätedaten. In diesem Protokoll wird die modifizierte Gompertz Modell12 als Beispiel verwendet; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
wo N0 (104 Pfu/mL in dieser Studie) und Nt (104 108 Pfu/ml) sind die infektiösen Virustiter (Pfu/mL) bei 0 und t (Beispiel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) Hpi, bzw. A ist der asymptotischen Wert [Log (N∞/n0 )] (Beispiel: 3 bis 4), µ ist der spezifischen Wachstumsrate [1/h] und e ist die Napier konstante λ beträgt die Verzögerung [h]. Modellparameter ergeben sich durch die Solver-Funktion der Analyse-Software, die die Summe der Quadrate der Differenz zwischen den beobachteten und modellierten Werten minimiert. Im Beispiel in Abbildung 1 bder spezifischen Wachstumsrate (µ) wird auf geschätzt [1/h] 0.197 und die Verzögerung (λ) beträgt 6,61 [h] mit der zuletzt quadratische Methode um ein modifiziertes Gompertz-Modell und die relative Virustiter über die stationäre Phase nach der ursprünglichen Titer ( Log-Skala) (A) ist 3.15 [Log (N∞/n0)]. Wir haben insgesamt 6 Rotaviren Klone getestet, und die geschätzten Werte der spezifischen Wachstumsrate reichte von 0,19 bis 0,27 [1/h]. Diese geschätzten Werte verlässlich sind, da der Koeffizient der Entschlossenheit Werte in der Modell-Armatur mehr als nur 0,98 ist.
RRV Virionen binden an Zelloberflächen waren ca. 103 Kopien/mL (verbindliche Effizienz war ca. 1 %) bei der Verwendung einer 24-Well-Platte für die Zelle-Bindung-Assay (Abb. 2 b). Der Test erfolgt in der Regel drei Mal für jede Probe, und einige Probleme wie über Wasch- und unzureichende Aktivierung des RRV von Trypsin können auftreten, wenn eine große Varianz in der Kopienzahl in einer Probe beobachtet wird. Der Ct-Wert von mehr als ca. 36,0 qPCR ist nicht besser und wird betrachtet, um unter einer Nachweisgrenze in unserem qPCR-Zustand.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volumen / 1 Reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript Puffer</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT Enzym Mix I</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo-dT-Primer</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zufällige 6 mers</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deionisiertes destilliertes Wasser</td>
			<td>6.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SsRNA Probe</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Insgesamt</td>
			<td>20.0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Meister Mischen Zusammensetzung für die cDNA-Synthese des Rotavirus Genoms.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Zeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Reaktion Zustand für die cDNA-Synthese des Rotavirus Genoms.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volumen/1 Reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premix Taq</td>
			<td>12,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forward Primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rückwärts-Primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonde (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referenz-Farbstoff II</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deionisiertes destilliertes Wasser</td>
			<td>5,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA-Probe</td>
			<td>5,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Insgesamt</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Master Mischen Zusammensetzung für die quantitative PCR Rotavirus ein Genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Zeit</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45-Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Reaktion Bedingung für die quantitative PCR Rotavirus ein Genom.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Schätzung der Rotavirus-Wachstum und die Wachstumskurve Rotavirus. (A) die infektiöse Einheit Rotavirus ist mit dem Plaque-Assay gemessen. (B) die Kurve (blaue Linie) wurde durch die veränderte Gompertz-Modell basierend auf Beobachtungsdaten in unserem Labor (weißer Kreis) angenähert. Die spezifischen Wachstumsrate [µ]; [h-1], 0.197 lag Periode (λ); 6,61 [h], die relative Virustiter über die stationäre Phase nach der anfänglichen Titer (Log-Skala) (A); 3.15 [Log (N∞/n0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Übersicht und repräsentatives Ergebnis der Zelle-Bindung-Assay fünf RRV Stämme von Plaketten in unserem Labor gereinigt. (A) A Kultur Zellplatte mit Rotaviren geimpft wird bei 4 ° C für die Hemmung der Virus-Invasion in Zellen inkubiert. Nach Inkubation und entfernen die ungebundenen Viruspartikel auf Zellen die Anzahl der Genome aus gebundenen Viruspartikel an der Zelloberfläche mit RT-qPCR zu quantifizieren. (B) das Ergebnis der Zelle-Bindung-Assay wurde als verbindliche Wirkungsgrad (%), die das Verhältnis von gebundenen Viruspartikel an die Anwesenden in das Inokulum wurde angezeigt. Mutige Bar: Median, Ende der Boxen: Quartil Abweichung, Zeilenende: maximale und minimale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, einer für die Messung der spezifischen Wachstumsrate und die andere für die Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus mit dem Plaque-Assay und RT-qPCR. Diese Protokolle sind für die Bestätigung der unterschiedlichen Phänotypen Rotavirus-Sorten zur Verfügung.

Assays für die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Anhand der hier vorgestellten Assays kann der Unterschied im Phänotyp unter Rotavirusstämmen bewertet werden, wo einzigartige Stämme isoliert werden. Konkret wird die phänotypische Veränderung desdesinfektionsmittelresistenter Rotavirusstämme untersucht. Um klare quantitative Ergebnisse mit dem Plaque-Assay zu erreichen, ist es wichtig, eine geeignete Kombination aus Rotavirus-Stamm und Serum auszuwählen, bei der das Rotavirus gut an das Serum angepasst ist.Demonstriert wird das Verfahren von Syun-suke Kadoya, einem Doktoranden aus meinem Labor. Entfernen Sie ein CryoTube mit MA104-Zelllinien aus dem flüssigen Stickstoffbehälter. Legen Sie die CryoTube in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Zellen aufzutauen.Fügen Sie einen Milliliter der Zellsuspension zu 20 Millilitern des serumhaltigen Mediums in einem T75-Kolben hinzu. Inkubieren Sie den Kolben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 für zwei bis drei Tage. Sobald die Zellmonoschicht 80% Konfluenz erreicht hat, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern 1X Dulbeccos PBS.Fügen Sie vier Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in den Kolben und inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen. Die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und Zentrifuge bei 190 g für fünf Minuten übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierten Zellen in einem Milliliter Serum-haltigen Medium wieder auf.Dann verdünnen Sie die resuspendierten Zellen 100-fach mit dem Medium. Fügen Sie drei Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu jedem Brunnen einer Sechs-Well-Platte für den Plaque-Assay hinzu. Fügen Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte für den zellbindenden Assay hinzu.Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigtem Dampf für zwei oder drei Tage. Übertragen Sie eine Röhre mit einem Milliliter der Virussuspension in einem serumfreien Medium aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in ein 37 Grad Celsius Wasserbad zum Tauen. Fügen Sie ein Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin aus der Pankreas des Schweines zu einem Milliliter der Virussuspension hinzu und wirbeln Sie dann.Inkubieren Sie die Virussuspension bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigtem Dampf für 30 Minuten. Verdünnen Sie die aktivierte Virussuspension mit serumfreiem Medium, um die Infektionsvielfalt oder MOI auf 0,1 pfu pro Zelle anzupassen. Fügen Sie drei Tage nach der Zellbeschichtung einen Milliliter der verdünnten Virussuspension in einen T75-Kolben ein.Bebrüte die Zellen mit Virus bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und schüttelte den Kolben alle 15 Minuten sanft. Dann 30 Milliliter eines serumfreien Mediums mit vier Mikrogramm Pro Milliliter Trypsin aus der Schweinebauchspeicheldrüse in den Kolben geben. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigten Dampf.Sammeln Sie einen Milliliter des Überstandes in der Flasche bei Null, sechs, 12, 18, 24 und 36 Stunden nach der Infektion, und ersetzen Sie den Überstand in den 1,5-Milliliter-Typen mit einer Pipette. Führen Sie einen Frost-Tau-Zyklus innerhalb von 15 Minuten bei minus 80 Grad Celsius, gefolgt von einer 15-minütigen Schmelze in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Dann zentrifugieren Sie die Rohre bei 12, 600 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Sammeln Sie den Überstand. Filtern Sie den Überstand mit einem destillierten 0,2-Mikron-Filter, um die Zellfraktion zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius auf, bis er auf den Plaque-Assay zur Messung des Virustiters aufgebracht wird.Wenn Sie bereit sind, den Plaque-Test durchzuführen, legen Sie die Rohre mit dem gesammelten Überstand in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Trypsin zu einem Milliliter 10-fach verdünnter Probe hinzufügen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Waschen Sie während dieser 30-minütigen Inkubation die MA104-Zellen sorgfältig in einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern 1X PBS, nachdem Sie das serumhaltige Medium entfernt haben.Die inkubierten Proben mit serumfreiem Medium seriell verdünnen und jeweils einen Milliliter der verdünnten Probe in jeden Brunnen impfen. Bebrüte die Platte 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigtem Dampf, und schütteln Sie die Platte alle 15 Minuten sanft. Nach der Inkubation das Inokulum von der Sechs-Brunnen-Platte entfernen.Fügen Sie dem vorbereiteten Medium vier Mikrogramm pro Milliliter Trypsin hinzu. Sanft, aber sofort drei Milliliter des Mediums mit Agarose-Gel gemischt zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie das Agarose-Gel bei Raumtemperatur für mehr als 10 Minuten erstarren.Dann inkubieren Sie die Platte für zwei Tage bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigten Dampf. Als Nächstes fügen Sie einen Milliliter 0,015%Neutral Red Lösung mit 1X PBS verdünnt, um jeden Brunnen, und inkubieren mit den gleichen Bedingungen. Entfernen Sie den Farbstoff nach drei Stunden und weiter für einen Tag zu inkubieren.Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Plaques in jedem Brunnen und berechnen Sie den Pfu pro Milliliter. Überprüfen Sie sorgfältig den Zellzusammenfluss vor dem Plaque-Test, um die Plaque-Nummern zu gewährleisten. Für den zellbindenden Assay ein Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin aus einer Schweinebauchspeicheldrüse zu einem Milliliter der Virussuspension hinzufügen und dann Wirbel.Verdünnen Sie die Virussuspension mit serumfreiem Medium, um den MOI auf einen Pfu pro Zelle einzustellen. Waschen Sie die MA104-Zellen zweimal in einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter Tris-gepufferter Kochsaline. Impfen Sie nun die Zellen mit 100 Mikrolitern verdünnter Virussuspension in jeden Brunnen der 24-Well-Platte.Die Platte bei vier Grad Celsius 90 Minuten lang mit sanftem Schütteln alle 15 Minuten bebrüten. Entfernen Sie das Virus inoculum, und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter Tris-gepufferte Salin. Um die doppelsträngige RNA des Rotavirus zu extrahieren, fügen Sie 140 Mikroliter 1X PBS und 560 Mikroliter des RNA-Extraktionspuffers zu jedem Brunnen hinzu.Mischen Sie mit einer Pipette, bis der Dunst der Zellen im Puffer nicht gesehen wird. Nach der Wiederherstellung der doppelsträngigen RNA, nach dem Protokoll des Herstellers, legen Sie die 1,5 Milliliter-Röhren, die den doppelsträngigen RNA-Extrakt enthalten, fünf Minuten lang auf einen Wärmeblock bei 95 Grad Celsius, um die RNA zu denaturieren. Dann sofort die Rohre auf Eis legen und für mehr als zwei Minuten inkubieren.Synthetisieren Sie die cDNA mit einem Reverse-Transkriptionskit. Fügen Sie vier Mikroliter denaturierter viraler RNA-Lösung in eine PCR-Röhre mit 16 Mikroliter Reaktionsgemisch ein und mischen Sie sie sorgfältig mit einer Pipette, um keine Blasen zu erzeugen. Nach dem Abspinnen der Rohre, führen Sie die umgekehrte Transkription mit einem Thermocycler.Verwenden Sie für die quantitative PCR eine Quencher-Inserting-Sonde, die auf den Bereich 963 bis 1, 049 des NSP3-Genomsegments des Rotavirus abzielt. Das Standard-Plasmid mit PCR-Wasser wird seriell verdünnt, und machen Sie den Master-Mix für quantitative PCR. Fügen Sie 20 Mikroliter der Master-Mischung in die Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.Mischen Sie dann fünf Mikroliter cDNA-Proben oder fünf Mikroliter des Standardplasmids, indem Sie 10 Mal pipetieren. Führen Sie quantitative PCR entsprechend den Bedingungen im Textprotokoll durch. Berechnen Sie schließlich das Rotavirus-Genom, das an die MA104-Zelloberfläche gebunden ist, wie im Textprotokoll beschrieben.Hier ist eine Wachstumskurve des Rotavirus zu sehen. Wenn die Methode am wenigsten quadratisch auf ein modifiziertes Gompertz-Modell angewendet wird, wird die spezifische Wachstumsrate auf 0,197 geschätzt, und die Verzögerungsdauer wird auf 6,61 Stunden geschätzt. Der relative Virustiter in der stationären Phase zum initialen Titer ist 3.15.Von den sechs getesteten Rotavirus-Klonen lagen die geschätzten Werte der spezifischen Wachstumsrate zwischen 0,19 und 0,27. Diese Schätzwerte sind zuverlässig, da der Bestimmungskoeffizient im Modellfitting wert ist mehr als 0,98. Das Ergebnis des zellbindenden Assays wird als Bindungseffizienz angezeigt, d. h. das Verhältnis gebundener Viruspartikel zu denen, die im Inokulum vorhanden sind.Unsere RV-Virionsbindung an Zelloberflächen beträgt ca. 10.000 Kopien pro Milliliter bei einer Bindungseffizienz von ca. 1%, wenn eine 24-Well-Platte für den Zellbindungstest verwendet wird. Da kultivierte Zellen empfindlich auf körperliche Belastungen reagieren, achten Sie darauf, den Puffer und Agar sanft, aber schnell zu gießen. Im Wesentlichen wurde ein neues System für die Viren eingeführt.Mit diesem System können wir die reale Zellbindungsfähigkeit und spezifische Wachstumsrate mit Instrumenten bewerten. Unser Protokoll ist vorteilhaft bei der Messung der phänotypischen Eigenschaft. Durch die Überprüfung verschiedener neu auftauchender Stämme können Sie helfen, die neuen Impfstoffe gegen die Viren zu bewerten.Die Viren sind als BSL-2-Erreger bezeichnet, daher müssen Sie BSL-2-Experimentalräume für dieses Verfahren vorbereiten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...