Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Die Autoren möchten Mariko Yamatake und Masako Takashima für technische Unterstützung danken. Diese Arbeit unterstützt wurde teilweise durch KAKENHI Zuschuss zahlen 16H 00759 und 17 H 04017 (SO).

1. bereiten Sie Liposomen
<ol><li>Phospholipide (z.B. 10 mg Pulver) im Chloroform bei einer gewünschten Konzentration (z.B. 10 mg/mL) auflösen.</li>
	<li>Verdunsten Sie Chloroform.<ol>
<li>Ort der Phospholipid-Lösung in ein Rundboden Kolben und es auf einen Drehverdampfer (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Gasflasche N2 verbunden. Drehen Sie die Flasche unter N2 fließen bei Raumtemperatur bis ein dünne Phospholipid-Film (nach ~ 30 min) erscheint.</li>...

Die CBB-Methode von Lipid Bilayer Bildung basiert auf dem Prinzip eines Wasser-in-Öl-Tropfens, gesäumt von einem monomolekularen Film20. Technisch sind die Verfahren zur Bildung von CBBs einfach, vor allem für Patch-Clamp-Forscher, die Manipulation von Glas Mikropipetten beherrschen. Die elektrophysiologische Setup für die Patch-Clamp ist leicht in der CBB verwendet, wenn zwei Pipette Manipulatoren mit Microinjectors verfügbar sind. Auf der anderen Seite, weil der CBB ein Nachfolger der herk?...

Für Ionenkanäle ist die Zellmembran nicht einfach ein unterstützendes Material, sondern als Partner für die Erzeugung des Ionen-Fluss. Funktional, die Membran ist ein elektrischer Isolator, in welche, den Ionen Kanäle eingebettet sind, und aller Zellmembranen sind mit einem ruhenden Membranpotential vermittelt. Konventionell, wurde eine willkürliche Membranpotential aus einem Außenkreis verhängt mit dem elektrischer Strom durch die Kanäle gemessen wurde. Diese quantitative Auswertung der Ionen-Fluss an verschiedenen Membran Potenziale offenbart die molekularen Eigenschaften dieser Kanäle, wie ihre ionenselektive Permeation und gating Funktionen1,2. Die Membran-Plattform für funktionelle Studien von Ionenkanälen ist die Zellmembran oder Bilayer Lipidmembran. Historisch, Einkanal-elektrische aktuelle Aufnahmen wurden uraufgeführt im Lipid Bilayer3,4, und die einschlägigen Techniken wurden entwickelt, um Zelle Membranen, wie der Patch-Clamp-Methode (Abbildung 1A )5,6. Seitdem haben sich diese beiden Techniken separat für verschiedene Zwecke (Abbildung 1)7,8entwickelt.
Membranlipide und Bilayer Membranen stehen derzeit im Mittelpunkt der Forschung für ihre Rolle bei der Unterstützung der Struktur und Funktion von Kanalproteinen. Daher ist die sofortige Verfügbarkeit von Methoden, um die Lipidzusammensetzung in Bilayer variieren stark nachgefragt. Lipid Bilayer Bildung Methoden wie die planare Lipid Bilayer (PLB)8,9,10,11, Wasser-in-Öl Tröpfchen Bilayer12und Tröpfchen Schnittstelle Bilayer (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 Techniken (Abbildung 1) sind allgemeine Wahlen, bietet eine Möglichkeit für die Prüfung unter variierenden Lipid Kompositionen20-Kanal-Funktion. Obwohl die DIB technisch wesentlich einfacher ist zu produzieren als die herkömmlichen PLB, die Größe des DIB schuf ein Abschreckungsmittel für Patch-reckenden anwenden für das Studium Einkanal-aktuelle Aufnahmen mit üblichen mittleren Leitwert (< 100 pS).
Um die Geräuschkulisse zu umgehen, muss der Bilayer Umgebung minimiert werden. Dieses Problem, erinnert sich die Wiederholungen der Geschichte bei der Entwicklung von elektrophysiologischer Techniken für Lipid Bilayer (Abbildung 1). In den frühen Tagen bildete sich eine kleine Bilayer (1-30 µm im Durchmesser) an der Spitze der Pipette (Tipp-Dip-Methode; Abbildung 1 ( C) 21 , 22 , 23, anstatt mit einem freistehenden Bilayer (~ 100 µm im Durchmesser) auf eine hydrophobe Septum in einer Kammer (Abbildung 1B). Die Tipp-Dip-Methode für elektrische Messungen mit viel niedrigeren Hintergrund Lärm24zulässig. Unsere Erfahrungen mit der PLB-25,26, Tipp-Dip22,23,27und Patch-Clamp28,29,30, 31 -Methoden führte uns auf eine neue Idee von Lipid Bilayer mit den Grundsätzen der Wasser-in-Öl-Bilayer bildet. Wir haben dies als Kontakt Blase Bilayer (CBB) Methode20,32bezeichnet. Bei dieser Methode anstatt hängen die Wassertropfen in einer Ölphase (Abbildung 1D), eine Wasser-Blase wird geblasen aus einer Glaspipette (mit Durchmesser von ca. 30 µm) in die Ölphase (Abbildung 1E und 2), wo die Blase wird durch einen stetigen Druck aufrechterhalten. Spontan an der Wasser-Öl-Schnittstelle an der Oberfläche der Blase bildet sich eine Monolage. Dann zwei Seifenblasen durch die Manipulation von zwei Glaspipetten angedockt sind, und die Bilayer bildet sich nähern die beiden Monolagen einander, einen Gleichgewicht Bilayer Bereich nachgeben. Die Größe der Blase wird durch den Intra-Blase Druck (Nachdruck), und ebenso die Bilayer Größe gesteuert. Ein Durchmesser von 50 µm wird häufig verwendet. Obwohl das Volumen der Blase klein ist (< 100 pL), Anschluss an das größere Volumen der Pipette-Lösung, die im Bereich Mikroliter, bilden die Bulk-Elektrolyt-Phase ist.
Es gibt viele Vorteile, die CBB-Methode (Tabelle 1) zu verwenden. Als Lipid Bilayer Bildung Technik Membranen der verschiedenen Lipid-Kompositionen herstellbar und asymmetrische Membranen sind leichter gebildeten32 , als die von herkömmlichen klappbare Methode33sind. Die Bilayer kann mechanisch bearbeitet werden, im Gegensatz zu den herkömmlichen PLB, die nur mit einem hydrostatischen Druck Unterschied34,35gebogen werden kann. Durch die Veränderung der Nachdruck, die Luftblasen erweitern oder verkleinern, was zu erhöhten oder verringerten Membran Spannung32. Die Bilayer ist mechanisch abnehmbar in Monolayer, ähnlich wie die Freeze-Fraktur Technik36,37 der Membranen in den morphologischen Studien, aber mit der CBB ermöglicht eine Manöver wiederholt trennen und anfügen Zyklen32 . Das geringe Volumen der Elektrolyt-Lösung innerhalb der Blase ermöglicht effiziente Mischung aus Kanal rekonstituiert Liposomen in der Bilayer, und die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens Kanal Aufnahmen ist viel höher als bei der konventionellen PLB-Technik. Das kleine Blase Volumen ermöglicht schnelle Perfusion (innerhalb von ~ 20 ms) auch einmal eine weitere Injektion Pipette wird entweder der Bläschen eingelegt. Im Gegensatz zur Patch-Clamp-Methode einmal gebrochen, eine CBB-Membran ist neu formiert, sofort und immer wieder, und Pipetten können mehrmals täglich verwendet werden. Durch die Integration Vorteile der Patch-Clamp und PLB Methoden, bietet der CBB eine vielseitige Plattform um die physikalisch-chemischen Bedingungen der Membran variieren für noch nie dagewesene Studien von Kanal-Membran Interaktionen ermöglicht.
Vor der Präsentation eines detaillierten Protokolls der CBB-Entstehungsprozess, ist physikalisch-chemischen Hintergrund der Bilayer Bildung zunächst dargestellt, die hilfreich für Patch-reckenden experimentelle Schwierigkeiten in Bezug auf die Membran Bildung behoben werden Das sind anzutreffen.
CBB Experimente vermitteln Lektionen der Oberflächenchemie Wissenschaft38. Der CBB ist ähnlich wie eine Seifenblase geblasen aus einem Strohhalm in die Luft, wo ebenfalls, eine Wasser-Blase in einem organischen Lösungsmittel geblasen. Man wird feststellen, dass eine Wasser-Blase kaum aufgeblasen wird, wenn Membranlipide nicht in das Wasser-Blase oder dem organischen Lösungsmittel enthalten sind. Bei fehlender amphipathische Lipide die Oberflächenspannung an einer Wasser-Öl-Schnittstelle ist hoch, und der Intra-Blase Druck für eine Seifenblase wird hoch sein. Dies ist eine Erkenntnis der Laplace-Gleichung (ΔP = 2 γ/R, wo ΔP ist der Druck, Intra-Blase, γ ist Oberflächenspannung und R ist der Blasenradius). Wenn die Konzentration von Lipiden in der organischen Phase oder der Elektrolytlösung hoch ist, erhöht die Dichte der Lipide in der Monolage, wie von Gibbs Adsorption Isotherm diktiert (-Dγ = Γich Dµich, wo Γich die Oberfläche Selbstbeteiligung ist der Verbindung i und µich ist das chemische Potential der Komponente ich)39, führt zu einer niedrigeren Oberflächenspannung und Leichtigkeit der Blasenbildung. In der CBB das Bilayer beobachtet werden, von einem tangentialen Winkel (Abbildung 2), und des Kontaktwinkels zwischen der Monolage und Bilayer messbar. Dieser Winkel stellt ein Gleichgewicht zwischen den Surface tensions der Monolage und Bilayer (junge Gleichung: γBi = γMo cos(θ), wo γBi ist die Bilayer Spannung, γMo ist die Monolayer-Spannung und θ ist der Kontaktwinkel). Die Änderungen in der Kontaktwinkel zeigen Veränderungen in der Bilayer Spannung, angesichts der Tatsache, dass die Monolayer-Spannung als Funktion des Membranpotentials von Änderungen in der Kontaktwinkel ausgewertet wird (Young-Lippmann Gleichung: γMo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θV)), wo Cm die Membran Kapazität ist V das Membranpotential ist und θ0 und θV jeweils der Kontaktwinkel auf 0 und V mV sind)40,41 ,42. Wenn zwei Bläschen nah genug sind, gehen sie einander spontan. Dies ist aufgrund der Van-Der-Waals-Kraft, und wir können visuell beobachten dieser dynamischen Prozess in CBB-Formation.
Ein CBB-System besteht aus verschiedenen Phasen: nämlich ein Großteil Ölphase, Wasser Bläschen mit einem monomolekularen Film und eine Kontaktaufnahme mit Bilayer (Abbildung 3) beschichtet. Diese ähneln der mehrere Phasen in einem PLB, z. B. eine lösemittelhaltige Torus um die Bilayer-Phase und eine dünne organische Phase eingeklemmt durch zwei Monolagen43,44beobachtet. In der CBB Monolayer-Phase ist kontinuierlich mit der Bilayer Broschüre und Lipidmoleküle leicht diffundieren zwischen der Monolage und die Packungsbeilage. Die Monolayer-Phase umfasst einen Großteil der Blase Oberfläche, bilden die Hauptphase, die als ein Lipid-Reservoir dient. Weil das hydrophobe Ende der Lipide in der Monolage erstreckt sich nach außen auf die Masse Ölphase, öffnet Bilayer Interieur oder die hydrophoben Kern der Masse Ölphase. Somit ist eine hydrophobe Substanz injiziert in die Ölphase in der Nähe der Bilayer Bilayer Innenraum leicht zugreifen. Dies ist die Membran Perfusion Technik, die wir kürzlich45, entwickelt hatte, durch die die Lipidzusammensetzung in der Bilayer schnell (innerhalb einer Sekunde) bei Einkanal-aktuelle Aufnahmen geändert. Wir fanden, dass der Cholesteringehalt in der Bilayer reversibel durch die Cholesterin-Durchblutung an und Ausschalten45gesteuert werden konnte. Den Fall, dass die Konzentration des betreffenden Stoffes in der Monolage und Bilayer unterscheidet, ist das Konzentrationsgefälle des betreffenden Stoffes sofort durch Diffusion, aufgelöst bekannt als der Marangoni Effekt46, 47. auf der anderen Seite sind Flip-flops über die Monolagen langsam48,49,50.
Bei der CBB-Methode der Bilayer bildet sich unter vielseitigen physikalisch-chemischen Bedingungen, wie ein Elektrolyt pH-Wert so niedrig wie 1 51, eine Konzentration von Salz (K+, Na+)bis zu 3 M, ein Membran-Potential so hoch wie ±400 mV und ein System bis zu 60 ° c.
Es gibt mehrere Optionen für die Bildung der CBB und Einbeziehung der Kanal Moleküle darin. Für Bildung von der Monolage an der Wasser-Öl-Schnittstelle sind Lipide hinzugefügt, entweder in einem organischen Lösungsmittel (Lipid-Out-Methode; Abbildung 4 A, 4 C) oder in einer Blase als Liposomen (Lipid-Methode; Abbildung 4 " B, 4D). Insbesondere kann die Lipid-Methode für die Bildung von asymmetrischen Membranen15,32. Kanal-Moleküle in wässriger Lösung (z.B. Kanal bilden Peptide) löslich werden direkt in die Blase (Abbildung 4A, B)52,53, hinzugefügt, während Kanalproteinen in wieder hergestellt werden Liposomen, die dann in die Blase (Abbildung 4C, D) hinzugefügt werden. Hierin, die Bildung von CBBs durch das Lipid-in-Verfahren für entweder ein Kanal-Peptid (Polytheonamide B (pTB); Abbildung 4 ( A) oder ein Protein (KcsA Kaliumkanal, Abbildung 4C) angezeigt wird.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipid Bilayer bieten eine einzigartige experimentelle Plattform für funktionelle Studien der Ionenkanäle, so dass die Prüfung des Kanal-Membran Interaktionen unter verschiedenen Membran Lipid-Kompositionen. Unter anderem hat die Tröpfchen Schnittstelle Bilayer Popularität gewonnen; die große Membran Größe behindert jedoch die Aufzeichnung der elektrischen geringes Grundrauschen. Wir haben festgestellt, dass ein Kontakt Blase Bilayer (CBB)-Methode, die die Vorteile der planaren Lipid Bilayer verbindet und Patch-Clamp-Methoden, wie die Fähigkeit der Lipidzusammensetzung variieren und die Mechanik Bilayer bzw. zu manipulieren. Mit dem Setup für herkömmlichen Patch-Clamp-Experimenten, können CBB-basierten Experimente leicht durchgeführt werden. Kurz gesagt, eine Elektrolyt-Lösung in einer Glaspipette wird in einem organischen Lösungsmittel-Phase (Hexadecan) geblasen, und die Pipette Druck beibehalten wird, um eine stabile Blasengröße zu erhalten. Die Blase ist spontan eine Lipid-Monolayer (reine Lipide oder gemischte Lipide), gesäumt von Liposomen in den Bläschen vorsah. Als nächstes werden die beiden Monolage gesäumten Bläschen (~ 50 µm im Durchmesser) an der Spitze der Glaspipetten für Bilayer Bildung angedockt. Einführung von Kanal rekonstituiert Liposomen in die Blase führt zu die Einbeziehung der Kanäle in der Bilayer, zulassend Einkanal-aktuelle Aufnahme mit einem Signal-Rausch-Verhältnis des Patch-Clamp-Aufnahmen vergleichbar. CBBs mit einem asymmetrischen Lipidzusammensetzung sind leicht gebildet. Der CBB ist wiederholt durch Ausblasen der früheren Bläschen und bilden neue erneuert. Verschiedene chemische und physikalische Störungen (z.B., Membran-Perfusion und Bilayer Spannung) auf die CBBs. hierin auferlegt werden können, präsentieren wir Ihnen das grundlegende Verfahren für CBB Bildung.

Eine typische CBB hatte einen Durchmesser von 50 µm (Abbildung 56) und die spezielle Membran-Kapazität im Hexadecan war 0,65 µF/cm2. Die Blasengröße wurde willkürlich durch die Intra-Blase Druck gesteuert. Wenn Bläschen für rauscharme Aufnahmen notwendig sind, sollte der Kopfkreis entsprechend klein sein. Beispielsweise sollte der Kopfkreis für eine Blasengröße von 50 µm im Durchmesser, 30 µm.
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.

Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Die Contact Bubble Bilayer-Methode ist eine alternative Technik für herkömmliche Lipid Bilayers. und diese Methode ermöglicht vielseitigere Vibrationen durch die Membran. Die CBB-Methode integriert die Vorteile der Planar Lipid Bilayer und Patch Clamp Methode.Als Lipid-Bilayer-Technik kann ein CBB mit einer beliebigen Lipidzusammensetzung gebildet werden. Wir haben einen CBB für Einkanal-Stromaufnahmen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis entwickelt. Diese Methode ermöglicht Verschiedene von Membranschwingungen und bietet eine riesige Typplattform zur Kanalmembranschnittstelle.Jeder hat erlebt, wie er eine Seifenblase bläst. Ähnliche Manöver werden für die CBB-Bildung durchgeführt, indem der aufgebrachte Druck manuell verfeinert wird, anstatt durch den Mund zu blasen. Üben und genießen Sie die CBB.Um dieses Verfahren zu dispergieren Phospholipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration in einem runden Bodenkolben. Legen Sie die Phospholipidlösung auf einen Drehverdampfer, der mit einer Stickstoffgasflasche verbunden ist. Drehen Sie den Kolben unter Stickstofffluss bei Raumtemperatur, bis ein dünner Phospholipidfilm erscheint.Als nächstes legen Sie den offenen Kolben in einen Trockenkörper, der mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. Mit der Vakuumpumpe aspirieren Sie das Innere des Trockenators für mehrere Stunden, um das Chloroform gründlich zu entfernen. Anschließend ein geeignetes Volumen elektrolytlösung in den Kolben geben und das Phospholipid aussetzen, um eine 2 Milligrmas pro Milliliter Phospholipidsuspension zu erhalten.Sonciate die Suspension für 20 bis 30 Sekunden mit einem Bad Beschallungsmittel, um eine mehrschichtige Vesikelsuspension zu erhalten. Zur Herstellung von Proteoliposomen, die Ionenkanalproteine enthalten, fügen Sie der mehrschichtigen Vesikelsuspension eine Proteinlösung hinzu. Und beschallen Für einige Sekunden mit dem Bad Beschallungsmittel.Um große Glaspipetten vorzubereiten, legen Sie eine Glaskapillare in einen Pipettenzieher und fertigen Sie die Mikropipette mit einer feinen verjüngten Spitze durch zweistufiges Ziehen. Dann stellen Sie die Mikropipette auf eine Mikroschmiede und kontaktieren Sie die Spitze der Mikropipette mit einem Platin-Filament im verjüngten Teil mit einem Durchmesser von 30 bis 50 Mikrometern. Das Filament kurz erhitzen und sofort ausschalten.Mit destilliertem Wasser und Ethanol reinigen Sie die Oberfläche der Glasrutsche mit einem flachen Brunnen. Als nächstes das Silikonisierende reagenz auf den Glasschlitten auftragen und das Reagenz vollständig in der Luft trocknen lassen. Legen Sie dann die Glasrutsche auf die Bühne eines invertierten Mikroskops.Fügen Sie 100 Mikroliter Hexadecan in den flachen Brunnen des silikonisierten Glasschlittens ein. Mit einer Tuberkulinspritze füllen Sie die Elektrolytlösung bis zur Hälfte der Länge der Mikropipette. Als nächstes stellen Sie die Mikropipette auf den Mikropipettehalter mit dem Druckanschluss, so dass die Silber/Silberchlorid-Drahtelektrode in der Pipettenelektrolytlösung einweichen kann.Schließen Sie einen der Mikropipette-Halter an die Kopfstufe eines Patchklemmverstärkers und den anderen an den elektrischen Boden an. Anschließend einen Mikroinjektor an den Druckanschluss des Mikropipettehalters anschließen. Stellen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator an eine geeignete Position über der Stufe eines invertierten Mikroskops ein.Um das Elektrodenversatzpotential einzustellen, legen Sie einen Mikroliter der gleichen Elektrolytlösung, mit der die Mikropipette auf der flachen Oberfläche um den flachen Brunnen des Glasschlittens gefüllt wird, um eine Elektrolytkuppel zu erzeugen. Die Spitze beider Mikropipetten in der Elektrolytkuppel einweichen. Danach stellen Sie das Elektrodenversatzpotential des Patchklemmenverstärkers ein.Um die Liposomenlösung von der Spitze zu ziehen, fügen Sie einen Mikroliter Liposomenlösung auf die flache Oberfläche um den flachen Brunnen des Gleitglases. Als nächstes die Spitze der Mikropipette in die Liposomen-haltige Kuppel legen. Aspirieren Sie die Liposomen-haltige Lösung mit dem Mikroinjektor.Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Mircopipette zur Ansaugung kanalrekonstituierter Liposomen. Nun legen Sie die Mikropipette in das Hexadecan eimtin im flachen Brunnen. Blasen Sie eine Wasserblase langsam, indem Sie den Druck erhöhen, bis die Blase die gewünschte Größe erreicht, und halten Sie danach den gleichen Druck aufrecht.Entsorgen Sie die Blase, indem Sie die Spitze durch die Öl-Luft-Schnittstelle passieren, wenn es schwierig ist, die Größe der Blase stabil zu halten. Wiederholen Sie die Prozeduren, bis zwei stabile Blasen gebildet werden. Stellen Sie einen Kontakt zwischen den beiden Blasen her.Optimieren Sie den Druck, um die Blasengröße beizubehalten, da sich die Größe auch beim konstanten Intra-Blasendruck allmählich ändern kann. Stellen Sie das Membranpotential mit dem Patch-Anspruchsverstärker auf den entsprechenden Wert ein und warten Sie, bis der Kanalstrom entsteht. Für eine stabile Lipid-Bilayer-Bildung ist es wichtig, die Blotter zu reinigen.Glaskapillar- oder Pipettenzubereitungen sollten gründlich gewaschen werden und eine Kontamination durch die Waschmittelmoleküle vermeiden. Nachdem die CBB die Kanalmoleküle entweder in wässriger Lösung oder im Liposom gebildet hatten, wurden sie innerhalb von wenigen bis Dutzenden Minuten spontan in die Bilayer eingeführt. Einfügungen der Kanäle wurden durch die schrittweise Erhöhung der Stromamplitude unter dem aufgebrachten Membranpotential bestätigt.Ein durch die CBB-Methode gebildeter Doppelschichtkannin kann in zwei Monolayer zerfallen werden. Der pTB-Kanalstrom trat unmittelbar nach dem Anbringen der beiden Monolayer auf. Und der Strom wurde größer, als die Kontaktaufnahme die Amplitude des Stromes mit der Trennbefestigungsmanipulation des CBB synchronisiert wurde.Wenn die Anzahl der Blasen ausblasen, nimmt die Lipidkonzentration in der wässrigen Lösung ab und die Monoschicht wird nicht gebildet. Dann versuchen, Druck auf Liposomenabschnitt zu entlasten. Sobald die CBB-Bildung und Kanalrekonstitution etabliert sind, können Sie versuchen, Zusammensetzungen der wässrigen Lösung und Membran durch Überprofusion oder Injektion einer hydrophilen oder hydrophoben Substanzen zu variieren.Die CBB-Methode hat vielseitige Möglichkeiten eröffnet, Channel-Membran-Wechselspiele zu erforschen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functional Mapping mit Simultaneous MEG und EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Die Kombination Computer Game-Based Behavioural Experimente mit High-Density EEG-und Infrarot-Tracking-Gaze

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Untersuchen Local Network Processing mit Multi-Contact-Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Closed-loop Neuro-Roboter-Experimente zur Computational Eigenschaften Neuronale Netze Testen

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Die Herstellung von High-Kontakt-Dichte, Flach-Interface Nerve Elektroden für die Aufnahme und Stimulation Anwendungen

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning Experimente mit funktionalen Nah-Infrarot-Spektroskopie

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Verwenden von Neuron Spiking Activity zum Auslösen von Closed-Loop Stimuli in neurophysiologischen Experimenten

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...