Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Agentschap voor ontwikkeling defensie (Grant nr. UD170039ID).

1. bereiding van Poly(PFPA) homopolymeer
<ol><li>Herkristallisatie van AIBN<ol>
<li>5 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) combineren met 25 mL van methanol in een bekerglas van 250 mL. Dompel het bekerglas in een oliebad 60 ° C, en vervolgens krachtig roer het mengsel met een roer-bar tot AIBN is volledig opgelost.</li>
		<li>Filtreer de warme oplossing door filterpapier (5-8 μm deeltje retentie) en bewaar het filtraat bij 4 ° C tot laat langzaam de kristallen te vormen.</li>
		<li>De recrystallized AIBN ver...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

De synthese van poly(PFPA) geënt SiO2 kralen wordt geïllustreerd in Figuur 1. Door APTES als een linker-molecuul, kunnen poly(PFPA) borstels covalent geënt op SiO2 substraat bereid worden via een eenvoudige stappen. Hoewel sommige van de PfP-units worden opgeofferd voor de reactie met APTES, een groot aantal van de PfP-eenheden naar verwachting blijven beschikbaar voor latere reactie met amino-PEG of antilichamen. De PfP-groepen staan bekend om te vormen van de lage ...

Reactieve polymeren borstels hebben veel belangstelling in de afgelopen jaren ontvangen. Ze kunnen worden gebruikt om te immobiliseren functionele moleculen op organische of anorganische materialen maken van geactiveerde oppervlakken met applicaties op gebieden zoals opsporing en scheiding1,2,3,4, 5. Onder de reactieve polymeren gemeld, zijn die met pentafluorfenyl ester eenheden vooral handig als gevolg van hun hoge reactiviteit met amines en weerstand tegen hydrolyse6. Één dergelijke polymeer is poly(PFPA) kan, en het gemakkelijk matiemaatschappij na polymerisatie met moleculen bevat primaire of secundaire amines7,,8,,9,10. In een voorbeeld, waren poly(PFPA) borstels reageerde met amino-spiropyrans maken van licht-responsieve oppervlakken7.
De voorbereiding van de poly(PFPA) en haar toepassingen zijn beschreven in een aantal eerdere publicaties6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. In het bijzonder rapporteerden Theato en medewerkers de synthese van poly(PFPA) borstels via zowel "enten te" en "enten van" methoden7,8,10,11,12 . In de "enten te" aanpak, een poly (methylsilsesquioxaan)-poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(MSSQ-PFPA)) hybride polymeer was gesynthetiseerde8,10,11,12. De poly(MSSQ)-component was in staat om de sterke adhesie van de vorm met een aantal verschillende organische en anorganische oppervlakken, waardoor het poly(PFPA) onderdeel vormen van een borstel-laag op het gecoate oppervlak van materiaal. In de "enten van" aanpak, oppervlak geïnitieerd omkeerbare toevoeging en versnippering keten overdracht (SI-vlot) polymerisatie te bereiden poly(PFPA) borstels7werkzaam was. In dit geval, was een agent van de postoverdracht oppervlakte geïmmobiliseerdet keten (SI-CTA) eerst covalent gekoppeld aan het substraat via silica-silane reactie. De geïmmobiliseerdet SI-CTA deelgenomen vervolgens in de SI-vlot polymerisatie van PFPA monomeren, genereren van dichtbevolkte verpakte poly(PFPA) borstels met stabiele covalente verbinding met het substraat.
Door gebruik te maken van de borstels van de poly(PFPA) gesynthetiseerd via SI-vlot polymerisatie, we onlangs aangetoond de immobilisatie van antilichamen op de poly(PFPA) geënt silica deeltjes en hun latere toepassing in eiwit zuivering18. Het gebruik van poly(PFPA) borstels voor antilichaam immobilisatie werd gevonden voor het oplossen van een aantal kwesties in verband met de huidige eiwit scheiding via IP. Conventionele IP is afhankelijk van het gebruik van eiwitten A/G als een linker voor antilichaam immobilisatie19,20,21. Aangezien het gebruik van eiwitten A/G de antilichamen worden verbonden met een specifieke oriëntatie toestaat, wordt hoge doel antigeen herstelcapaciteit bereikt. Echter, het gebruik van eiwitten A/G lijdt aspecifieke eiwit interactie evenals het verlies van antistoffen tijdens het herstel van de eiwitten, die beide tot een hoog niveau van achtergrondgeluiden bijdragen. U kunt oplossen door deze tekortkomingen, is directe crosslinking van de antilichamen aan een stevige steun onderzocht22,23,24. De efficiëntie van deze technieken is meestal minder intensief als gevolg van de willekeurige oriëntatie van de kruisverwijzende antilichamen. Voor de poly(PFPA) geënt substraat is de immobilisatie van antilichamen blijvend, bereikt door middel van uitwisseling reactie tussen PfP-eenheden en amine functionaliteiten op antilichamen. Hoewel de antilichaam-oriëntatie nog steeds willekeurig is, profiteert het systeem met vele reactieve PfP-sites, controleerbaar door de mate van polymerisatie. Bovendien toonden we die door de gedeeltelijke vervanging van PfP-eenheden met amino-PEG, oppervlakte hydrophilicity kan worden afgestemd, verdere verbetering van de herstelcapaciteit van de eiwitten van de systeem-18. Over het geheel genomen bleken de poly(PFPA) geënt silica deeltjes een effectief alternatief voor traditionele IP met redelijke efficiëntie alsmede veel schoner achtergrond.
In deze bijdrage rapporteren we een alternatieve methode voor te bereiden op poly(PFPA) geënte oppervlak antilichaam immobilisatie en IP-applicatie. In eenvoudige stappen, zoals wordt geïllustreerd in Figuur 1, een APTES linker molecuul wordt eerst gestort op het oppervlak van silica, dan het poly(PFPA) polymeer is covalent gekoppeld aan de linker molecule door de reactie tussen de PfP-eenheden op de polymeer en de amine functies op APTES. Deze voorbereiding methode zorgt voor de permanente crosslinking van poly(PFPA) aan de oppervlakte van een substraat, maar vermijdt de vele complicaties geassocieerd met SI-CTA synthese en SI-vlot polymerisatie van poly(PFPA) borstels. Gedeeltelijke vervanging van de PfP-eenheden met amino-PEG kan nog steeds worden uitgevoerd, waardoor "fine-tuning" van het polymeer borstel oppervlakte-eigenschappen. Laten we de poly(PFPA) geënt silica kralen dus bereid kunnen worden geïmmobiliseerd met antilichamen en kan worden gebruikt voor eiwitverrijking via IP. De gedetailleerde kraal voorbereiding procedure, antilichaam immobilisatie en IP-testen worden beschreven in dit artikel, voor lezers die geïnteresseerd zijn in het zoeken naar een alternatief voor conventionele eiwit A/G op basis van IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

We laten zien een eenvoudige methode om te bereiden poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(PFPA)) geënt silica kralen voor antilichaam immobilisatie en latere immunoprecipitation (IP)-toepassing. Het poly(PFPA) geënte oppervlak is bereid via een eenvoudige stappen. In de eerste stap, wordt 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) gestort als een linker molecuul op het oppervlak van siliciumdioxide. In de tweede stap, poly(PFPA) homopolymeer, gesynthetiseerd via de omkeerbare toevoeging en versnippering keten overdracht (vlot) polymerisatie, aan de linker molecule door de reactie van de uitwisseling tussen de eenheden pentafluorfenyl (PFP) is geënt op de polymeer en de amine groepen op APTES. De afzetting van APTES en poly(PFPA) op de silica deeltjes zijn bevestigd door X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), evenals gecontroleerd door het deeltje grootte aanpast gemeten via Dynamische lichtverstrooiing (DLS &AMP;). Om de oppervlakte hydrophilicity van de parels, de gedeeltelijke vervanging van de poly(PFPA) met poly(ethylene glycol) amine-matiemaatschappij (amino-PEG) wordt ook uitgevoerd. De PEG-gesubstitueerde poly(PFPA) geënt silica kralen zijn vervolgens geïmmobiliseerd met antilichamen voor IP-applicatie. Een antilichaam tegen proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) is werkzaam voor demonstratie, en IP-efficiëntie wordt bepaald door het westelijke bevlekken. De resultaten van de analyse weergeven dat het antilichaam geïmmobiliseerd kralen inderdaad kunnen worden gebruikt voor het verrijken van PKR, terwijl niet-specifieke eiwitinteractie minimaal zijn.

Een schema voor de bereiding van poly(PFPA) geënt SiO2 kralen, met of zonder PEG vervanging is weergegeven in Figuur 1. Als u wilt controleren de APTES en de poly(PFPA) enten proces, blote SiO2 kralen, APTES matiemaatschappij SiO2 kralen en poly(PFPA) geënt SiO2 kralen worden gekenmerkt door zowel DLS (Figuur 2) en XPS (Figuur 3). IP-efficiëntie van de p...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Een protocol voor de bereiding van poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(PFPA)) geënt silica kralen wordt gepresenteerd. Vervolgens wordt het functionalized oppervlak van poly(PFPA) geïmmobiliseerd met antilichamen en met succes gebruikt voor de scheiding van de eiwitten door middel van immunoprecipitation.

Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO2 parels eiwitreiniging

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Deze methode kan worden gebruikt om biomolecuul-geactiveerde oppervlakken voor te bereiden, die toepassingen hebben op gebieden zoals de levering van geneesmiddelen, biologische doeldetectie en bioscheiding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de poly PFPA borstels zeer reactief zijn met amines, en de immobilisatie van antilichamen wordt bereikt door incubatie in bufferoplossing voor een paar uur. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de eiwitzuivering door middel van immunozuivering, omdat het geïmmobiliseerde antilichaam met succes kan binden met doelantigenen.Hoewel deze methode is aangetoond voor antilichaam mobilisatie en eiwitzuivering, het kan ook worden toegepast op andere systemen die biomoleculaire mobilisatie. Voor de behandeling van siliciumdioxidekralen met APTES, moet u eerst siliciumdioxidedeeltjes verkrijgen in de vorm van een waterige suspensie van 5%. Combineer 0,8 milliliter siliciumdioxide suspensie met 40 milligram APTES en acht milliliter methanol in een 20 milliliter scintillatie flacon uitgerust met een roerstaaf.Laat de reactie vijf uur lang op kamertemperatuur met krachtig roeren doorgaan. Breng de oplossing na vijf uur over op een conische buis. Om de aptes gefunctionaliseerde siliconendioxidekralen te isoleren, centrifugeert de oplossing gedurende vijf minuten op 10.000 G.Verwijder vervolgens de supernatant. Was nu de kralen door ze te verdringen in drie milliliter verse methanol. Schud de buis met de hand voor het mengen, maar indien nodig, het verbeteren van de dispersie door sonicatie in een waterbad voor een paar seconden.Centrifugeren als voorheen, en herhaal de wasstap nog een keer. Combineer de methanol wassen siliconen dioxide kralen met drie milliliter dimethylsulfoxide, of DMSO. Schud het mengsel met de hand, of indien nodig, sonicaat gedurende een paar seconden totdat de kralen volledig zijn verspreid in de DMSO.Na centrifugatie op voor, verwijder de supernatant. Herhaal de centrifugatie stap een laatste keer om volledige oplosmiddel uitwisseling van methanol naar DMSO te garanderen. Los 20 milligram poly PFPA op in twee milliliter DMSO in een 20 milliliter scintillatiefolie.Los amine gefunctionaliseerde PEG op in één milliliter DMSO om peg-oplossing voor te bereiden. Breng de PEG-oplossing nu over op de poly PFPA-oplossing. Reageer een uur lang bij kamertemperatuur met krachtig roeren.Breng een milliliter van de APTES gefunctionaliseerde siliciumdioxide kralen opgehangen in DMSO in de PEG vervangen poly PFPA oplossing. Laat de enting tussen poly PFPA en APTES gefunctionaliseerde siliciumdioxidekralen een uur lang op kamertemperatuur gaan met krachtig roeren. Isoleer de kralen vervolgens door centrifugatie op 10.000 G gedurende vijf minuten, gevolgd door het verwijderen van de supernatant.Was de kralen door het toevoegen van drie milliliter DMSO, en meng met de hand of met een paar seconden van sonicatie. Centrifugeren de kralen als voorheen. En verwijder de supernatant voordat u de DMSO-was twee keer herhaalt.Was de kralen nog twee keer met drie milliliter drievoudig gedestilleerd water. Meng vervolgens met de hand of met een paar seconden van sonicatie. Centrifuge de kralen als voorheen en verwijder de supernatant.Ten slotte droog de kralen op 40 graden celsius in een vacuüm oven 's nachts. Voeg vijf milligram poly PFPA geënte siliciumdioxide kralen toe aan een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Was de kralen door het toevoegen van 800 microliter pbs, en meng goed door vortexing.Centrifugeren de kralen op 10.000 G bij kamertemperatuur gedurende een minuut. Verwijder de supernatant en herhaal de wasstap drie keer. Voeg nu 350 microliter verse PBS, 50 microliter van 0,1%PBST en 6,67 microgram van het antilichaam toe.Incubeer ongeveer 20 uur op een rotator bij vier graden Celsius. De volgende dag, was de kralen en centrifuge op 400 G en vier graden celsius voor een minuut. Verwijder vervolgens de supernatant en voeg voorzichtig 400 microliters lyse buffer toe.Voorzichtig resuspend de kralen door pipetting op en neer vijf keer. Herhaal deze wasstap drie keer. Verwijder na de laatste wasbeurt zoveel mogelijk van de supernatant.Cellen en lysisbuffer voorbereiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Dan resuspend de cel pellet met 400 microliters van de lyse buffer. Sonicate de cellen met behulp van een ultra sonicator.Na sonicatie, vortex kort. Dan centrifugeren het lysaat op 20,000 G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de supernatant over op een nieuwe, 1,5 milliliter centrifugebuis.Om immunoprecipitatie uit te voeren, moet u 300 microliter cellysaat overbrengen naar eerder voorbereide antilichaam geïmmobiliseerd poly PFPA geënte siliciumdioxidekralen. Bewaar 30 microliter van de cellysaat als inputmonster in een nieuwe microcentrifugebuis. Incubeer de lysate kralen mengsel gedurende drie uur op een rotator op vier graden celsius.Na incubatie, centrifugeren het mengsel op 400 G op vier graden Celsius gedurende een minuut. Verwijder de supernatant, en voeg voorzichtig 400 microliter wasbuffer. Voorzichtig resuspend de kralen door pipetting op en neer ongeveer vijf keer.Na drie wasbeurten, verwijder zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk. Voeg 30 microliter van 2x SDS ladingkleurstof toe aan de kralen en aan het invoermonster. Verwarm ze dan 10 minuten bij 95 graden Celsius.Na het verwarmen, analyseren van het monster met behulp van westerse blotting, of bewaar het monster op min 20 graden Celsius. De gefunctionaliseerde silica kralen worden onderzocht door x-ray foto-elektronecosspectroscopie, of XPS, om de samenstelling van het oppervlak te bepalen. Representatieve XPS-gegevens worden hier weergegeven.Na de behandeling met APTES wordt de stikstof1s-piek in verband met de aminegroepszone APTES gedetecteerd. Na de poly PFPA-behandeling wordt de fluor 1s-piek die geassocieerd is met de PFP-eenheden op het polymeer gedetecteerd. Eiwit kinase RNA geactiveerd, of PKR verrijking door middel van immunoprecipitatie wordt uitgevoerd, en de gezinspeelde eiwit monster worden geanalyseerd met behulp van westerse blotting.Zoals verwacht, kralen geïmmobiliseerd zonder antilichaam, of een niet-specifieke antilichaam mixuture tonen geen PKR herstel. De kralen geïncubeerd met anti-PKR kan met succes verrijken PKR zoals aangegeven door de aanwezigheid van een PKR-band en de afwezigheid van GAPDH band. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat bij het vergelijken van systemen, de IP-experimenten evenals de daaropvolgende westerse blotting analyse moet gelijktijdig worden gedaan.Na de ontwikkeling kan deze techniek worden gebruikt voor de immobilisatie van verschillende biomoleculaire of materiële substraat. Bovendien heeft deze methode het extra voordeel van het afstemmen van alleen oppervlakte-eigenschappen die moeten worden afgestemd op de behoefte van elke toepassing.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese en karakterisering van gefunctionaliseerde metaal-organische roosters

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbellen Fabrication van Concave-porositeit PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Bereiding van een Corannulene-gefunctionaliseerd Hexahelicene door koper (I) -gekatalyseerde Acetyleenalkoholen-azide Cycloadditiereacties van nonplanar Polyaromatische Units

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

Het effect van interfaciale chemische binding in TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Composieten op hun fotokatalytische NOx Abatement Performance

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren voor gerichte plasmide DNA-levering

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

Efficiënte synthese van all-Carbon quaternaire Centers via de geconjugeerde toevoeging van functionele Monoorganozinc bromiden

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...